氟尿苷二乙酸酯脂质固体纳米粒的制备.docx

氟尿苷二乙酸酯脂质固体纳米粒的制备【摘要】 目的：为了提高氟尿苷的疗效，降低其毒副作用而制备氟尿苷二乙酸酯固体脂质纳米粒. 方法：在吡啶和4二甲氨基吡啶存在时，FUDR与乙酸酐反应，制备氟尿苷二乙酸酯，并测定其核磁共振氢谱.RPHPLC测定其在正辛醇和磷酸盐缓冲液中的分配系数及不同pH缓冲液和组织匀浆中的稳定性.采用薄膜分散法制备FUDRASLN；透射电镜研究其形态、粒径及粒径分布；RPHPLC测定载药量、包封率. 结果：制备成的FUDRA在弱酸性溶液中较稳定，在弱碱性溶液中水解较快；在血清和组织匀浆中易水解，在肝匀浆中水解最快；FUDRA分配系数为 FUDRASLN粒径为nm，载药量为，包封率为. 结论: FUDR转化成FUDRA后亲脂性大大增加；FUDRASLN包封率较高，粒径分布较均匀.【关键词】 氟尿苷；固体脂质纳米粒；靶向给药系统0引言氟尿苷(floxuridine, FUDR)是5氟尿嘧啶的脱氧核苷衍生物，是有效的抗代谢类抗消化道肿瘤新药，主要用于肝癌治疗. 为了增加其肝靶向性，我们制备了氟尿苷固体脂质纳米粒，但FUDR的脂溶性较小，制备固体脂质纳米粒比较困难，故将FUDR酯化，合成了氟尿苷二乙酸酯(FUDRA)，以大豆磷脂为药物载体，制备FUDRASLN，期望药物静注后可浓集于肝脏，达到提高疗效，降低毒副作用的目的.1材料和方法材料RE52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；UV265型紫外可见分光光度计；INOVA400超导核磁共振仪；LC10Avp高效液相色谱仪；色谱柱：Kromasil C18柱，5 m， mm mm；KQ250型超声波发生器(江苏昆山淀山湖检测仪器厂)，BP190S电子天平(德国赛多利斯)，XW80A漩涡混合器；JEM2000Ex型透射电子显微镜；TG16W微量高速离心机；Sephadex G50葡聚糖凝胶. 药品和试剂：FUDR；乙酸酐；大豆磷脂. 其他药品和试剂均为分析纯. 昆明种小鼠5只，体质量(202) g, 由第四军医大学实验动物中心提供.方法的合成及结构鉴定FUDRg，加入干燥的二氯甲烷30 mL中，依次加入乙酸酐 g，吡啶3 mL，催化量4二甲氨基吡啶. 反应混合物室温搅拌3 h，反应结束后加入250 mL乙酸乙酯，依次用稀HCl，稀NaHCO3和H2O洗涤，加入适量无水Na2SO4干燥2 h，过滤，滤液旋转蒸发，除去大部分乙酸乙酯，加入石油醚使产物结晶析出，抽滤，干燥. 合成路线如图1所示. 进行核磁共振氢谱(1HNMR)鉴定.稳定性考察反相高效液相色谱法(RPHPLC)测定FUDRA的含量. 流动相甲醇水(3575)；流速：1 mL/min；检测波长：268 nm；保留时间：() min；温度：25. 配制FUDRA系列浓度标准液，分别进样20 L，以峰面积对浓度进行线性回归，在 mg/L范围内有良好的线性关系，回归方程为A=-+33317c，相关系数r=，(n=5). 高、中、低三种浓度的平均回收率为% (RSD=%). 精密吸取FUDRA( mg/L)甲醇液1 mL，加到9 mL 37水浴预热的pH分别为, ,的缓冲液中,混漩振荡1 min后,置入37水浴中,于不同时间点取样20 L进样，测定残留FUDRA浓度. 以浓度的自然对数对时间进行线性回归，求反应速率常数和FUDRA水解半衰期. 为评价FUDRA在体内转化为FUDR的速度，进行了FUDRA在小鼠血清及不同组织匀浆中的水解动力学研究. 小鼠眼眶取血后处死，迅速取出肝、肾、肺组织. 血浆离心10 min，取上清液 mL加pH 的缓冲液 mL；肝、肾、肺组织称质量，加五倍量pH 的缓冲液,匀浆，离心10 min，取上清液 mL，加pH 的缓冲液 mL，混匀. 向37水浴中预热的血清及组织匀浆稀释液中加入FUDRA贮备液各 mL，漩涡混合1 min，于不同时间取样200 L，加甲醇500 L，混合1 min，离心5 min，取上清液20 L进样，测定残留药物浓度. 以浓度的自然对数对时间进行线性回归，求FUDRA水解速率常数和半衰期.分配系数(P)的测定精密量取FUDRA的正辛醇溶液 5 mL，加入用正辛醇饱和过的磷酸盐缓冲液 5 mL, 混合5 min,HPLC法测定两相FUDRA浓度；用正辛醇饱和过的磷酸盐缓冲液配制FUDR溶液，精密量取该液5 mL，加入正辛醇5 mL, 混合5 min,RPHPLC法测定两相中FUDR浓度. P=C醇/C水,C醇表示在正辛醇中的浓度,C水表示在水中的浓度.的制备在单因素考察的前提下，利用薄膜超声分散法通过均匀设计优化制备工艺. 精密称取FUDRA 10 mg，大豆磷脂90 mg于100 mL圆底烧瓶中，加入15 mL氯仿溶解. 旋转蒸发除去氯仿，在烧瓶壁上形成一层薄膜. 加入60 g/L甘露醇水溶液 mL，水浴超声两次，每次30 min，分装于安瓿中.的形态学研究取FUDRASLN胶体溶液适量，加适量水稀释，滴加在铜网上，用20 g/L的磷钨酸钠液染色，用JEM2000Ex型透射电子显微镜观察并拍照，统计100个纳米粒的粒径.的包封率和载药量的测定采用凝胶层析法. 精密量取FUDRASLN胶体溶液 mL上柱，洗脱液为蒸馏水，每 mL收集一次，流速为 mL/min，层析温度为室温. HPLC法测定固体脂质纳米粒中药物含量. 另取 mL FUDRASLN胶体溶液，置50 mL的容量瓶中，甲醇溶解，定容. HPLC法测FUDRA浓度C0. 包封率=100%，载药量=100%.统计学处理： 考察时间与Ln(C/C0100)之间的线性关系，用SPSS 对数据进行相关分析，计算Pearson相关系数r，检验水准=2结果得片状结晶 g，产率91，mp . 1HNMR =(s,1H,NH)；(d,1H,C6H)；(t,1H,C1H)；(m,1H,C3H)；(m,1H,C4H)；(m,2H,C5H)；(m,1H,C2H)；(m,1H,C2H)；(s,3H,CH3CO)；(s,3H,CH3CO).在不同pH缓冲液中的稳定性pH对FUDRA稳定性影响较大. FUDRA在弱酸性溶液中较稳定，在弱碱性溶液中水解较快. 由相关系数r可见，水解为表观一级反应.表1氟尿苷二乙酸酯在不同pH缓冲溶液中的一级水解常数(Kobs)和半衰期(略)在小鼠血清和不同组织匀浆中的稳定性经HPLC检测,FUDRA在血清和组织匀浆中水解成FUDR. 由相关系数r可见，水解为表观一级反应. 血清和组织匀浆中的酶可显着地加速前体药物的水解，特别是在肝匀浆中.表2不同浓度组织匀浆和缓冲溶液中氟尿苷二乙酸酯的一级水解常数(Kobs)和半衰期(略)的分配系数FUDRA和FUDR的分配系数分别为和，说明FUDR转化成FUDRA后亲脂性大大增加.的载药量、包封率和形态HPLC法测得FUDRASLN的载药量为%,包封率为%. FUDRASLN为略带淡蓝色的胶体溶液，透射电镜下可见许多圆形或椭圆形的球粒. 纳米粒的粒径nm.3讨论SLN是近年正在发展的一种新型纳米粒类给药系统. 它以固态天然或合成的类脂如卵磷脂、甘油三酯等为载体，将药物包裹或夹嵌于类脂核中，制成固体胶粒给药系统1. SLN的制备方法主要有高压乳匀法、乳化分散法、溶剂乳化法、薄膜超声分散法等. 高压乳匀法、乳化分散法等需要加热到一定的温度，对FUDRA的稳定性有影响. 薄膜超声分散法简便易行，适合于实验室制备.SLN主要适合于包封亲脂性药物2. 将含有羟基的水溶性药物酯化制成亲脂性前体药物，可以提高其包封率3. FUDR的亲水性较强，与乙酸酐反应转化为FUDRA后，脂溶性明显提高，此反应操作简便，产物易分离纯化. 大豆磷脂毒性低于合成材料，体内可降解且有良好生理相容性4，故选其作为药物载体. 在选择SLN分散介质时，曾使用磷酸盐缓冲液和蒸馏水. 用磷酸盐缓冲液作分散介质的SLN在1 d内即很快混浊、分层，表明药物大量泄露，磷脂凝聚. 这是因为电解质的加入减小了体系中各种粒子间的静电排斥作用，促进了脂质载体晶型的转变5. 蒸馏水的渗透压太小，用蒸馏水作分散介质的SLN在3 wk后也混浊、分层. 实验证明60 g/L甘露醇水溶液作分散介质的SLN室温放置3 mo也无混浊现象.FUDRA在不同pH缓冲液中的稳定性研究表明，pH对FUDRA稳定性影响较大，pH 时t1/2为 h，而pH 时t1/2为 h. 由相关系数r可见，水解为表观一级反应. FUDRA在血清和组织匀浆中的降解动力学研究表明，FUDRA在体内很快被脏器中的酯酶水解为FUDR，由此推测FUDRASLN被细胞吞噬后，会迅速水解为FUDR而发挥治疗作用.文献6报道小于7 m的微粒静注后，由于单核巨嗜细胞系统的吞噬作用大部分被摄入肝脾. 本实验我们所制成的FUDRASLN粒径在此范围内，理论上推测具有肝靶向性. 小鼠体内的分布研究正在进行. 我们以前进行过十六酸拉米夫定酯固体脂质纳米粒的研究3，7，结果表明LAPSLN具有较高的载药量和包封率，肝靶向性良好，据此从实践角度推测FUDRASLN具有肝靶向性.【参考文献】1 连佳芳，张三奇. 固体脂质纳米粒研究进展J. 第四军医大学学报, 2005,26(17):1621-1623.2 于波涛，张志荣，曾仁杰.肝靶向氟尿嘧啶类脂纳米粒的研究J.药学学报,2000,35(9):700-705.3 薛克昌，顾宜，张三奇，等.十六酸拉米夫定酯固体脂质纳米粒的制备J.第四军医大学学报，2003,24:890-892.4 Muller RH, Maassen S, Schwarz C. Solid lipid nanoparticles(SLN) as potential carrier for human use: Interaction with human granulocytesJ.J Control Release, 1997,47(3):261-265.5 王建新,张志荣.固体脂质纳米粒的研究进展J.中国药学杂志，2001，36(2):73-76.6 Yuda T, Maruyama K, Iwatsuru M. Prolongation of liposome circulation time by various derivatives of polyethyleneglycolsJ.Biol Pharm Bull,1996,19(10):1347-1351.7 薛克昌，张三奇，顾宜，等.十六酸拉米夫定酯固体脂质纳米粒的肝靶向研究J.解放军药学学报，2004,20：1-4.