单核细胞增生李斯特菌hfq基因缺失株的构建及其生物学特性.pdf

esearch Paper研究报告微生物学报 Acta Microbiologica Sinica55(4):433 439;4 April 2015ISSN 0001 6209;CN 11 1995/Qhttp:/journals im ac cn/actamicrocndoi:10.13343/j cnki wsxb 20140342基金项目:国家自然科学基金(31101841，31472193);江苏省科技支撑计划(BE2012367)*通信作者。Tel:[phone];Fax:[phone];E-mail:yylan yzu edu cn作者简介:康美琴()，女，河北人，硕士研究生，从事人兽共患病原菌的分子致病机理相关研究。收稿日期:2014-07-03;修回日期:2014-11-03单核细胞增生李斯特菌 hfq 基因缺失株的构建及其生物学特性康美琴，蔡雪薛，谈卫军，段斐斐，赵丹，潘志明，殷月兰*，焦新安扬州大学，江苏省人兽共患病重点实验室，江苏省动物主要疫病防控协同创新中心，江苏 扬州225009摘要:【目的】单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)为革兰氏阳性的短杆菌，营腐生和寄生生活，是重要的食源性人兽共患病原菌，对低温、酸碱和高渗透压等环境具有较强的抵抗力。Lm 在各种环境中适应、生存并表现致病力，是与调控因子的网络调控密切相关，本文初步研究了细菌调控因子 hfq 的生物学特性。【方法】利用同源重组技术对血清型为 1/2 a 的 EGDe 菌株进行 hfq 基因的敲除，对获得的突变株EGDehfq 进行生化鉴定及生物学特性研究。【结果】实验结果表明:在4低温环境下，缺失株生长显著减慢(P 0.05);在含7%NaCl 高渗 BHI 培养基及含4.5%乙醇的 BHI 培养基中生长受到抑制;缺失株形成生物被膜的能力显著下降(P 0.05);对 Caco-2 细胞系的侵袭能力下降;与野生型菌株相比，EGDehfq 对BALB/c 小鼠的感染能力减弱、半数致死剂量提高。【结论】由此表明，Hfq 蛋白对细菌抗胁迫、生物被膜形成及细菌毒力具有重要的调控作用。此缺失株的构建为进一步研究 Hfq 的功能提供了材料，为研究其在 Lm胁迫环境生存及疾病预防控制奠定了基础。关键词:单核细胞增生性李斯特菌，hfq 基因，调控因子，致病性，胁迫应答中图分类号:Q933文章编号:0001-6209(2015)04-0433-07单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一种重要的食源性病原菌，作为一种兼性胞内寄生菌，可在巨噬细胞和非吞噬细胞(如上皮细胞、内皮细胞和肝细胞)内增殖，可引起哺乳动物和人的败血症、脑膜炎，以及孕畜流产等1 3。Lm 所引起的李斯特菌病，对畜牧业造成经济损失，对人类健康造成严重威胁。早在 20 世纪 90 年代，WHO 将该菌列为食品中的四大致病菌之一，引起各国的普遍关注4。Lm 的致病性与毒力与相关调控因子的表达有着直接关系，深入研究其分子致病机理，对于李斯特菌病的预防和控制显得尤为必要。Hfq 也称 Host factor I(HF-I)，是一种热稳定蛋白，首次从金黄色葡萄球菌中发现，其结构和细菌Sm 蛋白相似，通过形成同源六聚体与 sNAs、DNA或 NA 的结合，调控细菌基因的转录和翻译，有利于细菌对生存环境的适应，以及对致病性方面有所影响5。在不同细菌中 Hfq 的大小和功能有所不同，如大肠杆菌中 Hfq 是核糖核酸调节的关键调节子，hfq 缺失株在高温、氧化、酸、渗透压等条件下生存、繁殖能力减弱6 7。另外，布鲁氏菌 hfq 缺失株在营养匮乏、氧化、酸等不良环境中生存、繁殖能力丧失8。Hfq 是李斯特菌重要毒力调节因子，由 hfq基因编码，可与反式编码的 sNAs 互作调控基因的转译5，该因子与李斯特菌毒力基因及其它潜在基Meiqin Kang et al/Acta Microbiologica Sinica(2015)55(4)因的表达有关，从而对李斯特菌的侵袭起到调控作用。本研究通过同源重组的方法从基因组中缺失hfq 基因，并对缺失株的生物学特性进行了研究。1材料和方法1.1材料1.1.1菌株和质粒:大肠杆菌(Escherichia coli)DH5、单核细胞增生李斯特菌血清型为 1/2 a 的野生型菌株 EGDe、穿梭载体 pKSV7(Ampr)质粒均由本室保存;pMD18-T 购自 TaKaa 公司。1.1.2实验动物:BALB/c 小鼠由扬州大学比较医学中心提供。1.1.3培养基:试剂 BHI 培养基(BactoTM BrainHeart Infusion)购自 BD 公司。1.1.4主要试剂和仪器:细菌基因组 DNA 抽提纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司;DNA 聚合酶、高保真DNA 聚合酶、DNA 回收试剂盒及限制性核酸内切酶(BamH 、Xbal )、DNA 分子标准量 Marker均购自大连宝生物(TaKaa)公司;T4 DNA 连接酶购自 Promega 公司;氨苄青霉素、氯霉素、红霉素等购自Sigma 公司;电转化仪购自 Eppendorf;培养箱购自上海跃进医疗器械厂;摇床、离心机购自Thermo，凝胶成像系统购自伯乐生命医学产品有限公司。1.1.5引物:表 1 为本研究中使用的引物，参照GenBank 上公布的基因序列设计，由南京金斯瑞公司合成。表 1 目的基因引物序列Table 1 Primers sequences of target genesPrimerSequence(53)estriction sitehfqaFACTGGGATCCGGAATAGGATGGAGATTGATTGGATBamH IhfqaTTGTCTTTTAAGTAACGTGCAATTTCCCTCTCCAATCTCTATCTThfqbFAAGATAGAGATTGGAGAGGGAAATTGCACGTTACTTAAAAGACAAhfqbAGCCTCTAGAAATAATCCGCGCCTCAACAGCAGCCXbahfqaFTGTGGCATTGGCTACAAAGAhfqbACGGTGCTGTTCAACATGCGTT1.2EGDehfq 突变株的构建以单核细胞增生李斯特菌标准株 EGDe 为材料，用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取 EGDe 的基因组。以引物 hfqaF 和 hfqa、hfqbF 和 hfqb 分别扩增上下游同源臂片段 hfqa、hfqb。PC 产物经DNA 回收试剂盒纯化回收，再以 hfqaF 和 hfqb 为引物，通过 SOEing PC 将 hfqa、hfqb 连接起来，命名为 hfqab。再与 pMD20T 载体相连，转化至 E coliDH5 中，经 PC 鉴定及 BamHI、XbaI 的双酶切分析，将阳性克隆送金斯特公司测序。以 BamH和XbaI 分 别 双 酶 切 阳 性 克 隆 pMD20T-hfqab 和pKSV7，纯化后用 T4 DNA 连接酶进行连接、转化大肠杆菌 DH5。将测序正确的阳性克隆命名为pKSV7-hfqab。用电转化方法将重组穿梭质粒导入野生型 EGDe 菌株，通过温度和氯霉素抗性压力进行同源重组，然后在 30无抗性压力下传 10 代，使载体丢失，获得在氯霉素(10 g/mL)抗性中不能生长且经 PC 和 T-PC 鉴定正确的菌株 EGDehfq。1.3EGDe 和 EGDehfq 对 NaCl 耐受性的测定两株细菌接种到新鲜 BHI 培养基中过夜培养，次日取细菌，13800 g 离心 2 min。PBS 重悬，测定此时的 OD600值。将处理后细菌分别转接到 10 mL质量分数为 7%NaCl 的 BHI 培养基或体积分数为4.5%乙醇的 BHI 培养基的三角瓶中，并使其初始OD600值为 0.05，每个细菌设 3 个平行组，置 37摇床振摇培养，定时测定各瓶的 OD600值并记录实验数据。1.4EGDe 和 EGDehfq 在 4及 40温度条件下生长的测定将细菌接种到新鲜 BHI 培养基中过夜培养，次日取 1 mL 菌液，PBS 清洗 2 遍并重悬，然后分别转接细菌到 10 mL BHI 培养基的三角瓶中，每个细菌设 3 个平行组，令初始 OD600值为 0.05，分别置 4 和 40 摇床振摇培养并定时测定各瓶的OD600值。1.5EGDe 和 EGDehfq 生物被膜形成能力比较构成生物被膜的胞外多糖易于结晶紫结合，可434康美琴等:单核细胞增生李斯特菌 hfq 基因缺失株的构建及其生物学特性/微生物学报(2015)55(4)利用胞外多糖的量来衡量生物被膜的生成量。收集过夜培养基于指形管，用 BHI 液体培养基调整各细菌 OD600值为 1.0，稀释 10 倍后(OD600约为 0.1)，取200 L 菌悬液加入 96 孔 U 形细胞培养板中，于37条件下培养 72 h。于 72 h 时吸走培养基，无菌SW 洗 3 遍，用 0.1%的结晶紫染色，再用无菌 SW洗 3 遍，55烘干后每孔滴加 225 L 96%乙醇洗脱15 min，使用酶标仪测量其在 595 nm 下的吸光度值。1.6细胞侵袭实验挑取生长良好的 Caco-2 细胞，消化转移一定数量细胞至 24 孔细胞培养板中，至细胞培养至单层时，对板孔内的细胞计数，然后按细菌与细胞的数量比(MOI)20 加入新鲜培养的野生株 EGDe 和缺失株EGDehfq，继续培养，1 h 后换用含硫酸庆大霉素(100 g/mL)的 DMEM 培养 2 h。用无菌 PBS 清洗2 次，加入冷的 0.1%Triton X-100 裂解细胞 8 min，释放细菌。用无菌 PBS 稀释裂解液，选择 10 倍和100 倍稀释梯度涂布于 BHI 平板上，置于 37温箱培养 20 h 后对菌落计数。1.7野 生 株 EGDe 及 缺 失 株 EGDe hfq 对BALB/c 小鼠的感染实验取 37过夜培养的两种菌液，次日转接到新鲜培养基中培养 3 h，将细菌用 PBS 洗 2 遍，调整其OD600至 0.8，再调整细菌量为 3 105CFU，将 6 周龄BALB/c 小鼠随机分成 2 组，每组 3 只，分别感染EGDe 与 EGDehfq。每只小鼠腹腔注射 100 L 3104CFU 细菌。3 天后，分别摘取每组小鼠的脾脏和部分肝脏，均质仪研磨后将组织液稀释并平板计数。1.8野 生 株 EGDe 及 缺 失 株 EGDe hfq 对BALB/c 小鼠的 LD50测定37 培养细菌制备种子液，次日将种子液按1 20的比例重新接种于新鲜的 BHI 液体培养基中，于 37振荡培养，用无菌 PBS 洗 2 遍，调整 OD600值至所需大小。将 6 周龄雌性 BALB/c 小鼠随机分成2 组，每组 5 只，进行腹腔注射。每只小鼠注射剂量为 100 L 并呈五倍递减，同时将细菌适度稀释后涂布 BHI 培养板进行菌落计数。连续观察 14 天，并记录小鼠死亡情况。采用 eed-Muench 方法计算重组菌对雌性 BALB/c 小鼠的半数致死量。2结果2.1重组菌构建结果2.1.1上下游片段 hfqa、hfqb 的扩增:以单核细胞增生李斯特菌标准株 EGDe 基因组 DNA 作为模板，分别合成 hfq 基因上下游片段 hfqa、hfqb，电泳结果显示产物大小与预期片段大小 253、467 bp 相符。2.1.2pMD20-T-hfqab 的构建及鉴定:将通过SOEing PC 拼接片段连接至 pMD20-T 载体，转化到 DH5 中，提取质粒通过 Xba、BamH双酶切鉴定分别得到2700 bp 的载体片段和675 bp 的目的片段，与预期结果相符。2.1.3pKSV7-hfqab 的构建及鉴定:用 Xbal、BamH双酶切鉴定重组克隆，得到 7000 bp 的载体片段和 675 bp 的同源片段，与预期结果相符。2.1.4缺失株的鉴定:用 PC 鉴定转化产物，结果显示在 997 bp 处有清晰的目的条带，说明缺失株构建成功。分别提取 EGDe、EGDehfq 总 NA 并反转录为 cDNA，以得到的 cDNA 为模板进行反转录PC。电泳结果显示野生株能扩增出特异性条带，大小为 234 bp(图 1)，缺失株无此条带。实验进一步证明 hfq 基因已成功缺失。图 1 T-PC 鉴定缺失株 EGDe、EGDehfqFigure 1 The result of T-PC identification of EGDehfq M:DL2000 Marker，lane 1:positive control，lane 2:PC product ofEGDe，lane 3:PC product of EGDehfq2.2Lm 抗胁迫实验结果2.2.1Lm 对 NaCl 耐受性测定:在等渗溶液中，微生物可正常生长繁殖;在高渗溶液中，细菌的细胞失水收缩，从而生长繁殖受到抑制。对 NaCl 耐受性测定结果表明，EGDe、EGDehfq 在含 7%NaCl 的BHI 培养基中生长受到明显抑制，进入稳定期时间延后(图 2)。此外，缺失株 EGDehfq 的生长趋势534Meiqin Kang et al/Acta Microbiologica Sinica(2015)55(4)较野生株减慢，10 h 时 EGDe 的活菌数是缺失株EGDehfq 的2 倍。由此表明7%NaCl 渗透强度明显抑制细菌生长和繁殖，且 Hfq 对于 Lm 耐受 7%渗透压力发挥重要作用。图 2 细菌耐盐实验结果Figure 2 Osmotic stress tolerance of EGDe and EGDehfq2.2.2Lm 对 EtOH 耐受性的测定:醇类物质可侵入菌体细胞，破坏蛋白质表面的水膜，使之失去活性，同时也破坏细菌蛋白质的肽健，使之变性。由图3 的测定结果可知，在含有 4.5%乙醇的 BHI 中，EGDe、EGDehfq 的生长都受到抑制，但随着时间推移 EGDehfq 的生长能力较野生株下降，在测定范围内，12 h 时二者达到最大差异，由此可见，hfq 对细菌耐受乙醇起着重要作用。图 3 EGDe、EGDehfq 耐受乙醇实验结果Figure 3 Ethanol stress tolerance of EGDe and EGDehfq2.2.3低温胁迫对 Lm 生长的影响:考虑到 Lm 是一种可在低温下生长的食源性病原菌，它的耐寒特性对食物保藏和公众健康造成严重威胁。本实验测定细菌在 4培养条件下生长情况:两株细菌的生长都极其缓慢，但随着时间的推移，缺失株的生长显著低于野生株(P 0.05)(图 4)，由此提示，hfq 对于细菌抵抗低温环境发挥重要作用。2.2.4高温胁迫对 Lm 生长的影响:单核细胞增生李斯特菌可以耐受 45高温，本实验探索了 Lm 于40温度条件下细菌的生长情况。图 5 中实验结果图 4 EGDe 和 EGDehfq 4生长情况Figure 4 The growth curve of EGDe and EGDehfq at 4图 5 EGDe 和 EGDehfq 37生长情况Figure 5 The growing state of of EGDe and EGDehfq at 37显示缺失株的生长趋势与野生株相同，表明 hfq 基因的缺失未对 Lm 耐受高温造成明显影响。2.3Lm 对 Caco-2 细胞系侵袭能力的测定生物被膜是细菌抵抗外界不利环境时形成的，它是一种多细胞聚合物，由细菌团块与表多糖、蛋白和胞外 DNA 构成的细胞外基质形成的复合物。由图 6 可见缺失株 EGDehfq 与野生株 EGDe 相比，形成生物被膜的能力有显著降低(P 0.05)，实验表明 Hfq 对于细菌应对外界不利条件形成自我保护的生物被膜具有重要作用。2.4细胞侵袭实验已知与黏附、侵袭及胞内繁殖相关的基因主要存在于 Lm 毒力岛 LIPI-I 和 LIPI-II 中，其中 LIPI-II上的基因编码一组与侵袭素功能相似的蛋白，主导细菌对非吞噬细胞的黏附侵袭。图 7 的侵袭实验结果表明，EGDehfq 的侵袭能力(0.786%)明显低于野生株 EGDe(2.242%)，说明缺失 hfq 基因后，细菌侵入 Caco-2 细胞的能力减弱。2.5野 生 株 EGDe 及 缺 失 株 EGDe hfq 对BALB/c 小鼠的感染实验由图 8 的实验结果可知，EGDehfq 感染小鼠634康美琴等:单核细胞增生李斯特菌 hfq 基因缺失株的构建及其生物学特性/微生物学报(2015)55(4)图 6 Lm 于 37 BHI 生物被膜形成能力测定Figure 6 Determination of ability of biofilm formation of Lm in BHI at37图 7 EGDe 和 EGDehfq 细胞侵袭实验结果Figure 7 esult of cell invasion of EGDe and EGDehfq后的肝脏和脾脏中的细菌载量均低于野生株EGDe，表明缺失株对小鼠的感染能力减弱，毒力降低，Hfq 对李斯特菌致病性有重要作用。图8 EGDe、EGDehfq 对 BALB/c 小鼠感染实验测定结果Figure 8 The CFUs ofEGDe and EGDehfq in mice organs2.6野 生 株 EGDe 及 缺 失 株 EGDe hfq 对BALB/c 小鼠的 LD50测定经 eed-Muench 法计算得到 EGDehfq 对小鼠半数致死量为 3.54 106CFU，EGDe 对小鼠半数致死量为 5.92 105CFU，hfq 缺失株的半数致死量较其亲本株提高了 6 倍，表明缺失株的毒力明显降低(表 2)。表 2 EGDe 和 EGDehfq 菌株对 BALB/c 小鼠 LD50的测定结果Table 2 LD50of EGDe and EGDehfq for BALB/c miceGroupCFU per mouse/(1 105)MortalityLD50/(CFU)EGDe489.61.925/54/50/55.92 105CFUEGDehfq7715.43.085/55/50/53.54 106CFU3讨论Lm 是一种能营腐生生活和寄生生活的病原菌，该菌在体内黏附、侵袭及细胞内感染过程中，其毒力因子各司其职由相互协作，并受到调控因子的网络调控，使其在各种环境中适应、生存并表现致病力。目前已 经 发 现 的 致 病 因 子 主 要 包 括 SigmB 9 10、PrfA 11、Vir 12、HrcA 和 Hfq 1，13，前四种调控因子的调控机制研究比较清楚，而 Hfq 发现较晚，对其研究报道较少。对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等病原菌的 Hfq 研究发现，将 hfq 基因缺失后，突变株表型改变，如难以应对各种环境压力、毒力减弱等。本文通过比较 hfq 缺失株和野生株性状，对 Lm Hfq 蛋白在压力耐受及毒力方面的生物学特性进行了研究。当 Lm 侵入小鼠体内后，宿主会通过天然免疫和获得性免疫对其产生免疫应答，以控制和清除病原菌;Lm 面临宿主体内的特殊环境时，能及时调整新陈代谢并促使相应毒力因子的表达，以逃离宿主对它的攻击，在这个过程中，Hfq 可能在细菌适应宿主体内一系列特殊微环境中发挥作用 1。本研究以人结肠腺癌细胞系 Caco-2 为体外感染模型、小鼠为体内感染模型，对缺失株 EGDehfq 和野生株 EGDe 的侵袭能力、致病力及 LD50进行了测定，结果显示缺失株对Caco-2 的侵袭率明显低于野生株，由此表明 hfq 缺失株对非吞噬细胞侵袭能力减弱。以小鼠进行的体内感染实验结果显示，缺失株在小鼠脾脏和肝脏中的数量明显少于野生株，对小鼠的感染作用减弱;而野生株 EGDe 对小鼠具有较强的感染能力和致病性，由此提示 Hfq 对 Lm 在小鼠体内的生存起到一定作用。LD50实验也进一步证明缺失株对小鼠的毒力明显下载，这与一些革兰氏阴性菌 hfq 缺失株对动物模型的734Meiqin Kang et al/Acta Microbiologica Sinica(2015)55(4)毒力下降甚至消失相似 14 15。已知 Lm 与黏附、侵袭及胞内繁殖相关的基因主要存在于毒力岛 LIPI-I和 LIPI-II 中，体内外实验结果提示，Hfq 蛋白与 Lm的致病力相关，可能对两个毒力岛中的基因具有调控作用和互作关系。对大肠杆菌、嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、百日咳杆菌等 Hfq 蛋白的功能研究结果显示，该蛋白除参与细菌的致病性之外 14 17，还参与细菌的基因转录、蛋白表达、应激反应等 18，20。当亲本株 hfq 基因缺失后，大量蛋白的表达发生变化，从而细菌的生长、形态和对外界环境的耐受性改变 21 22。本研究通过温度、高盐和乙醇等胁迫因素，对野生株和 hfq 缺失株抗胁迫能力进行了测定。高盐胁迫实验结果显示，虽然两株细菌在高盐培养基中生长都受到一定程度抑制，但在测定范围内，缺失株生长明显落后于野生株，另外，与野生株相比，缺失株对乙醇敏感性显著性增加(P 0.05)且生物被膜形成能力显著下降，这充分显示了 Hfq 影响 Lm 细胞膜的完整性以增强细菌适应性，这与 Christiansen 等得出的结论一致。对温度这一环境条件研究结果显示，突变株和野生株于 37、40的生长无显著性差异，表明 hfq 对于细菌抵抗高温不是必需的。但于 4低温条件下两株细菌生长速度都减慢，且缺失株生长明显落后于野生株(P 0.05)。以上实验结果说明 hfq 对于细菌抵抗外界不利环境发挥重要作用。本研究成功地构建了单核细胞增生李斯特菌的hfq 基因缺失株 EGDehfq，并对缺失株的抗胁迫能力、对细胞的侵袭性以及对小鼠的毒力进行了研究，初步表明 hfq 对 Lm 压力耐受及致病性发挥一定作用，本研究为开展 Hfq 蛋白的调控机理研究奠定了基础。参考文献1Christiansen JK，LarsenMH，IngmerH，Sgaard-Andersen L，Kallipolitis BH The NA-Binding ProteinHfq of Listeria monocytogenes:ole in Stress Toleranceand VirulenceJournalofBacteriology，2004，186(11):3355-33622Hain T，Chatterjee SS，Ghai，Kuenne CT，Billion A，Steinweg C，Domann E，Krst U，Jnsch L，Wehland J，Eisenreich W，Bacher A，Joseph B，Schr J，Kreft J，Klumpp J，Loessner MJ，Dorscht J，Neuhaus K，FuchsTM，Scherer S，Doumith M，Jacquet C，Martin P，Cossart P，usniock C，Glaser P，Buchrieser C，GoebelW，ChakrabortyTPathogenomicsofListeriasppInternational Journal of Medical Microbiology，2007，297(7-8):541-5573Cossart P Molecular and cellular basis of the infection byListeria monocytogenes:an overview International 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monocytogenes(Lm)is an important zoonotic foodbornepathogen，engaged in both saprophytism and parasitism It could adapt，survive and display pathogenicity under differentenvironmental stress challenges，which is associated with the regulatory network consisting of regulating factors Thebiological characterizations of regulator hfq was evaluated in this study Methodshfq deleted serovar 1/2 a strain EGDewas constructed with homologous recombination，the biological characteristics of the mutant strain was compared with itsparental strain esultsThe growth of EGDehfq was significantly inhibited under cold temperature(P 0.05)，saltmedium containing 7%NaCl and the medium containing 4.5%ethanol The ability of biofilm formation of the mutantstrain in BactoTM Brain Heart Infusion(BHI)was reduced significantly(P 0.05);notably，the invasion rate to Caco-2 cell lines was obviously reduced Infection capacity of EGDehfq to BALB/c mice decreased and the LD50was 6 timeshigher than EGDe ConclusionHfq protein of Listeria monocytogenes plays an important role in regulating bacterialvirulence，biofilm formation and stress response This deletion strain provided material to further study the function of H