酒精饮料中氨基甲酸乙酯的研究进展.pdf

氨基甲酸乙酯为一种致癌物，在酒精饮料中含有痕量的氨基甲酸乙酯。文章简析了氨基甲酸乙酯对人体的危害与限量标准，对现有的氨基甲酸乙酯的控制方法和国内外的检测方法进行了综述，并对氨基甲酸乙酯检测方法的发展趋势进行了展望。关键词关键词:酒精饮料；氨基甲酸乙酯；检测方法 氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）为具有基因毒性和致癌性的物质，是发酵食品和酒精饮料在发酵过程、加热（如蒸馏）和储存时产生的一种副产物1。它已被广泛用于一些商业用途，像氨基树脂的制备与改性，作为农药或医药制造的助溶剂和纺织行业用作增添磨损性能的化学中间体。在日常生活中人体从发酵食品和酒精饮料中摄取的氨基甲酸乙酯的剂量不大，但对于长期食用发酵食品和饮用酒精饮料的人们，氨基甲酸乙酯在体内的累积，无疑是增加了健康的风险。发酵食品（如酱油，泡菜，面包，馒头，饼干，豆腐等）和酒精饮料（如黄酒，葡萄酒，白酒等）中，均有较高的氨基甲酸乙酯水平。而现有的研究表明，目前人体摄取的氨基甲酸乙酯的主要途径是饮用酒精饮料。1 1 对人体的危害与限量标准对人体的危害与限量标准 1943 年，Nettleship2等的研究证实了氨基甲酸乙酯具有致癌性。1971 年,国外研究人员在葡萄酒中发现了 EC，并测定了其含量3。随后，Ough 在对啤酒等酒精饮料的测定中发现了微量 EC4。据国外的研究,在生物体内的代谢，EC 的含量与细胞色素 P450 密切相关5-7。对于啮齿类动物,氨基甲酸乙酯是一种多位点致癌物,EC 几乎可被胃、肠和皮肤快速地完全吸收8，使机体患肿瘤、癌症等疾病的几率大大增加。随着人们的广泛关注，世界卫生组织规定了发酵食品中氨基甲酸乙酯的限量标准。1985 年，加拿大卫生福利部率先规定了酒精饮料中 EC 的限量标准，随后欧美等发达国家也相继提出了各种酒类中 EC 的限量标准，其标准见表 19-12。表 1 不同酒精饮料中 EC 的限量标准（g/L）国家 佐餐葡萄酒 强化葡萄酒 蒸馏酒 水果白兰地 清酒 加拿大 30 100 150 400 100 美国 15 60 150 捷克 30 100 150 400 200 法国 150 1000 日本 30 100 150 400 100 瑞士 150 1000 目前，人们对酒中 EC 含量非常重视，出口酒类中 EC 残留量检测方法 SN 0285-93 也在我国施行了。但由于各方面因素所限制，到目前国家有关 EC 的限量标准还没有出台，出现黄酒、果酒、起泡葡萄酒、啤酒、食用酒精等中 EC 含量偏高的现象。然而，随着人们生活水平的提高，酒精饮料已越来越受到大众的青睐，如何降低 EC 在酒精饮料中含量已经成为研究者的重要课题，制定我国的 EC 限量标准已刻不容缓。2 2 氨基甲酸乙酯的控制氨基甲酸乙酯的控制 2.1 高性能菌株的选育 网络出版时间：2015-01-05 15:13网络出版地址：http:/ 年，巫景铭14等实验证明不同菌种发酵液样中氨基甲酸乙酯的含量不一，最低仅有 0.5 g/kg。陈胜15等比较不同产酒酵母的发酵性能及产尿素能力，筛选出发酵性能优良且低产尿素的酵母,且不影响发酵性能。日本研究人员通过诱变，培育出了不产尿素的清酒酵母16。因此选育产尿素能力差的酵母菌，是降低 EC 含量的一个主要方向。需要注意的是，酵母发酵全过程中要防止杂菌的污染，某些杂菌分解后会影响 EC 含量13。2.2 发酵原料中尿素的控制 例如，在种植葡萄阶段，合理喷施尿素，避免尿素过多地残留在表皮枝叶上，将尿素带入葡萄酒酿造环节，使氨基甲酸乙酯含量的升高；或对发酵的粮食精制或多次清洗，可以适当的降低原料中的尿素，但该方法会影响原料营养价值，影响发酵质量17。2.3 适当改变酿酒工艺 对发酵过程中的温度、pH 值等工艺条件进行控制，可以降低产品中氨基甲酸乙酯的含量。但对工艺条件的调整必须要谨慎，稍有不当酒中的部分风味物质可能就会流失，故可操作性不强。2.4 添加酸性脲酶 脲酶具有分解尿素的作用，在生产过程中利用脲酶控制成品酒中氨基甲酸乙酯含量是最为常用的方法。酒精饮料中添加酸性脲酶水解尿素，在日本清酒和葡萄酒中已有广泛应用。近年来，国际葡萄酒组织、美国 FDA 等多个组织批准将脲酶作为食品添加剂使用18。研究分析，脲酶水解尿素的影响因素，发现脲酶的添加量和作用温度是尿素分解率高低的主要原因之一,除此之外,酒液的 PH 值、乙醇含量、苹果酸和氟化物的含量对尿素酶的分解效果都有一定的影响19。2006 年，国内首次对酸性脲酶在不同的温度、用量、时间及酒体 pH 值下分解黄酒中尿素的酶解特性进行了研究，填补了国内在此领域的空白20。目前，我国脲酶的生产还未形成产业化，国内企业使用的脲酶主要依靠进口，脲酶纯度低是阻碍我国脲酶产业化的主要原因之一，由于脲酶添加剂中含有大量的杂质，添加到酒中会造成二次污染，加大酒类安全风险，因此，如何提高脲酶纯度仍然是国内厂商需要解决的一大技术难题17。3 氨基甲酸乙酯检测方法氨基甲酸乙酯检测方法 3.1 薄层分析法 1991 年，纳新力21等研究了利用薄层分析对酒精饮料中氨基甲酸乙酯的含量测定。样品预处理后制备薄层板，然后在薄层板上使用标准液点样，将经处理后的薄层板置于盛有展开液（二甲基甲酰胺苯苯二硫化碳 10:7:20）的展开槽中，待薄层分离，取出薄层板，自然挥发至干燥，在用 365 nm 紫外灯照射数分钟，在 Rf 值为 0.88 处，标准系列层析点显示蓝紫色荧光。该方法检出限 10 g/L，灵敏度为 0.02 g，回收率为 88%。该方法可针对氨基甲酸乙酯做定性及半定量分析，但对测定酒中氨基甲酸乙酯的限量标准意义不大22。3.2 GC/MS 法 3.2.1 液/液萃取(LLE)1991 年，国内首次提出对氨基甲酸乙酯的测定方法23。对样品用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，经脱水浓缩后用 GC/MS 分析，在 DX-1 柱上用多离子检测法定性和定量，在白酒样品的回收率为 98.4%，检出限 10 g/L。该方法的优点是选择性、灵敏度、回收率和重复性能达到预期效果，且操作简单。但也存在操作烦琐、耗时长，易产生乳化，萃取液有毒且用量大等缺点。3.2.2 固相萃取(SPE)Canas B J24等采用固相萃取柱吸附酒中的氨基甲酸乙酯，以二氯甲烷提取，用正丙基氨基甲酸叔丁酯作为内标，对蒸馏酒，加烈葡萄酒，佐餐酒和酱油样品进行 GC/MS 分析，得知酒样中 EC 的回收率为 87%93。该方法检出限 010g/L，标准偏差 2%32%。相较于液液萃取，SPE 方法具有速度较快、花费低、回收率和操作系统误差较小等优点，但同时存在操作较为烦琐，在规模化检测时速度较慢，且需要使用二氯甲烷等有毒有机溶剂的缺点25。3.2.3 固相微萃取(SPME)与 SPE 法相比 SPME 法在样品前处理时，无需萃取溶剂，萃取时间缩短，为样品前处理方法的研究提供了方向。萃取头对萃取效果的影响最大，如何根据不同的萃取样品选择合适的萃取头以及对萃取头性能的改进，将是 SPME 法优化的关键。SPME 和气相色谱联用，再与高灵敏度的检测器如质谱、电子捕获检测器、原子发射光谱检测器结合，可使检出限达到 g/Lng/L 的级别，多次顶空固相微萃取（MHS-SPME）能够克服通常存在于 SPME 分析中的基质干扰效应，尤其适合于大量不同基质的样品分析25-27 3.2.4 GC/PICI-MS/MS Hamlet28等使用气相色谱法(GC)结合正离子化学电离作用(PICI)和串联质谱分析(MS/MS)对面包中氨基甲酸乙酯的含量进行检测，其检出限 1.2 g/L，标准偏差 7%。此方法具有减少样品制备时间，提高灵敏度等优点。3.2.5 GC-TSD 多维 Ma29等以异丙基氨基甲酸叔丁酯（I-PC）作为内标物，用 GC/TSD 方法分析被检酒样，其中相对标准偏差为 2%，检出限为 1 g/L。该方法预处理简便，灵敏度高，选择性强，适应于酒和米酒中氨基甲酸乙酯的检测。3.2.6 二维或多维-气质联用技术（MDGC/MS）马娅萍30等建立了一个利用二维色谱技术直接定量测定白酒中氨基甲酸乙酯的方法。该方法最低检测限 13 g/L，相对标准偏差为 7.7%。在本方法中，利用二维色谱技术的出色分离能力，免除了以往复杂的化学前处理步骤；应用对含氮化合物具有选择性响应的 NPD，提高了定性的可靠性和分析灵敏度；选用氨基甲酸异丙酯做内标物，克服了二维色谱技术中应用内标法定量的困难。但是，此法有一定的限制，只适合高浓度的酒类，并且偏差较大。Jagerdeo31在实验中先用固相微萃取技术对葡萄酒中的氨基甲酸乙酯进行萃取和浓缩，再利用多维气质联用技术进行检测，该方法检出限达到 0.1 g/L，定量限为 1 g/L。3.3 HPLC 法 近年来，国内外对高效液相色谱荧光检测器（HPLC-FLD）检测酒类中 EC 的方法作了广泛的报道，高年发32等利用 EC 和 9-羟基吨在酸性条件下生成可产生荧光的Xanthylurethane 物质的原理，优化检测条件，结合荧光检测器对白兰地中 EC 进行定性和定量分析。随后，国外研究者对中国黄酒中 EC 含量利用 HPLC-FLD 法进行检测33。陈达炜34等建立葡萄酒中氨基甲酸乙酯(EC)含量的高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)测定方法，EC 在 10250 g/L 范围内呈良好的线性关系，平均加标回收率为 93.7%106.6%，相对标准偏差为 1.4%1.8%，定量限为 15 g/L，HPLC-FLD 和 GC-MS 两种方法对葡萄酒的EC 含量测定结果无明显差异。研究表明，与 GC-MS 法相比，HPLC-FLD 法的准确性和灵敏性较差，在检测 EC 之前，还需要柱前衍生，成本较高，但它具有前处理简单、分析快速、重现性和精密度较好等优点，可作为基层实验室和企业对 EC 的快速检测要求35。3.4 傅立叶变换红外光谱仪法 Lachenmeier36等对核果酒精饮料中的 EC 含量用傅立叶变换红外光谱仪（FTIR）进行检测，标准偏差在 0.290.4 mg/L，加标回收率为 77%91%。该方法重现性高，检测速度快，可用于定性及半定量检测。但由于其精密度和灵敏性较差，FTIR 法尚不能满足酒精饮料中 EC 限量标准的测定要求。4 4 总结与展望总结与展望 从三鹿集团的婴儿奶粉中检出三聚氰胺到双汇产品暴发“瘦肉精”污染，以及后来的白酒“塑化剂”事件，近年来食品安全问题频有发生，氨基甲酸乙酯的致癌性，应当给予足够的认识，以防止类似事件的发生。文章阐述了酒精饮料中氨基甲酸乙酯的限量标准和控制方法，并对检测方法及其优缺点进行了综述。目前有关酒精饮料中的氨基甲酸乙酯检测方法还存在大大小小的弊端，应该通过研究各种前处理手段、优化检测方法和选用更适合的仪器的方式，以期能建立快速、简单、实用、无损伤的测定方法和限制标准，从而能更好地降低酒精饮料中氨基甲酸乙酯的含量，进一步提高白酒等酒精饮料质量。对如何使实验室研究和企业产品安全的检测更加安全、快捷、有效，有重大实践意义。参考文献：参考文献：1 Battaglia R，Conacher H B,Page B D.Ethyl carbamate（urethane）in alcoholic beverages and foods:a reviewJ.Food Additives and Contaminants,1990,7（4）:96-477.2 A Nettleship,PS Henshaw,HL Mayer.Induction of 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standard.Present control methods and detection methods in domestic and abroad were overviewed,additionally the development trend of ethyl carbamate detection methods were looked ahead.Key words:alcoholic beverages；ethyl carbamate(EC)；detection methods