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浅论慢病毒载体介导的RNA干扰抑制TLR基因的表达
【摘要】 目的：研究慢病毒载体介导的RNA干扰对有TLR2 或者TLR4表达的小鼠来源的细胞株抑制干扰效率。方法：根据GeneBank小鼠的TLR2 或者TLR4基因mRNA的已知序列，在http:///techlib/misc/siRNA_，寻找符合特征的靶序列。编码GeneBank模板的体外合成,收获病毒,侵染靶细胞，检测干扰效率。结果：检测表明干扰效果明显，达到80%以上。结论：慢病毒载体介导的RNA干扰是一种高效的基因沉默手段，可以对小鼠TLR基因功能进行长期的研究，检测有关蛋白基因的表达，揭示TLR在当中的作用。
【关键词】 小鼠;慢病毒感染;RNA干扰;TLR2;TLR4
　【ABSTRACT】Objective:To investigate the transfection efficiency of RNA mediated by lentivirus and intereference effects on TLR2 or TLR4 gene in mouse :According to the known arry of TLR2 or TLR4 gene in GeneBank Mouse,the targeting arry to fit in with the features was found,to code synthesis of GeneBank in vitro,collect the virus,infect the targeting cells,and check efficiency of :The efficiency of interference was so obvious that it reached to above 80 :Lentivirus mediated RNA interference is an effective means to silent gene expression and could be used in the study of function for TLR gene in mouse so as to measure some proten and to reveal its effets.
　　【KEY WORDS】Mice,Lentivirus infections,RNA interference,TLR2,TLR4
　　一直以来，人们对于固有免疫及其炎症反应的信号通路尚未完全阐明，近年来，随着果蝇Toll蛋白的发现，人们发现在哺乳动物和人类也存在着一类与果蝇Toll蛋白相似的跨膜蛋白，即Toll样受体(toll-like receptor,TLRs),在免疫及炎症反应的信号传导中扮演重要的角色[1]。吞噬作用是宿主固有免疫抵御外来入侵病原微生物的另一个关键因素。由巨噬细胞引起的吞噬作用和随后的病原体降解在宿主应对微生物感染的固有免疫中发挥了枢纽的作用。最近的研究表明，TLRs在通过上调巨噬细胞的吞噬活力和促进细菌的清除中发挥重要的作用。RNAi(RNA interference)技术的出现,为研究内源性基因功能和信号转导途径提供了强有力的研究工具。我们在已经获取TLR基因的RNAi有效靶序列的基础上,设计、构建和鉴定表达TLRsiRNA的慢病毒载体,为研究TLR基因在巨噬细胞中的作用机制和基因治疗打下基础。
　　1材料和方法
　　材料和试剂三羟甲基氨基甲烷(北京鼎国生物技术有限责任公司),胎牛血清(杭州四季青公司),小鼠OPN一抗、小鼠STAT3一抗、小鼠B-actin一抗(美国Santa Cruz公司)。病毒包装质粒由上海吉玛生物公司合成。
　　慢病毒RNAi表达载体的构建
　　针对TLR2或者TLR4干扰序列的设计及编码siRNA DNA模板的体外合成
　　靶位点的选择
　　根据GeneBank小鼠的TLR2 或者TLR4基因mRNA的已知序列，在寻找符合特征的靶序列。靶序列寻找的基本指导原则：ATG下游25nt开始，寻找AA(N19).序列，如果没有合适的序列，寻找NAR(N17)YNN,R is a purine(A,G),and Y is a pyrimidine(C,U).;G-C 含量在 36%~52%;正义链的3′端要有相对低的稳定性，在其15-19的位置至少要有一个A or T;避免4个或多个同一核苷酸重复，特别是T的重复，因为polyT是一种RNA聚合酶Ⅲ终止信号;一个基因需要设计3~4个靶序列的siRNA。
　　编码siRNA DNA模板的体外合成
　　选择3-4个靶位点,用blast软件进行序列同源性分析,并用RNA structure 软件对其二级结构预测,每条模板链的组成包括21个碱基正义链和与其互补的21个碱基的反义链,正反链之间有6个碱基(CTCGAG)间隔,反义链之后有5个T作为转录终止信号。
　　由上海吉玛生物公司合成,将合成的寡核苷酸用ddH2O 配成20 μmol/L，按照以下体系进行混合：5 μLForward oligo　5 μLReverse oligo　　5 μL10×退火缓冲液35 μLddH2O水浴锅里煮沸10min后，然后自然冷却至室温，获取双链。
　　scramble shRNA载体线性化及回收
　　将 scramble shRNA用AgeI和EcoR I双酶切,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收，测定线性化载体浓度。
　　载体与siRNA模板链连接
　　连接体系中模板与载体的摩尔数比约为3~5∶1，充分混匀，加入T4连接16℃反应过夜。连接产物可立即转化感受态细胞或于-20℃保存。
　　连接产物的转化
　　取100μL的感受态细菌，加入 scramble shRNA与siRNA连接产物，轻轻旋转混匀,冰浴30min，42℃热休克90s，快速放置冰浴中2min，加入800μL LB培养基(不含Amp)，37℃振荡培养60min，吸100μL培养液滴于含Amp的LB平板涂匀，待表面液体吸收后，倒置平皿37℃培养16~20h。
　　阳性重组克隆的筛选
　　挑取单个菌落，接种于3mL含Amp(100μg/mL)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日取于Eppendorf管中，10 000rpm离心1min，收集菌体，加入冰冷的溶液Ⅰ100μL(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，)，冰浴5min，加入新鲜配制的溶液Ⅱ200μL(10%SDS， NaOH)，轻轻混匀，加入溶液Ⅲ150μL(60mL 5mol/L KAc， HAc， H2O)，颠倒混匀，冰浴5min，40C，10 000rpm离心10min，取上清，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，室温放置5min，15 000rpm离心10min，弃上清，加入冰冷的75%乙醇洗一次，离心室温干燥，用含RNase(50μg/mL)的双蒸水10μL充分溶解沉淀。用限制性内切酶EcoRI 和 NcoI双酶切重组质粒，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。阳性克隆送出测序，引物如下:　5′ CAA GGC TGT TAG AGA GAT AAT TGG A 3′
　　干扰效率的检测
　　选取有TLR2或者TLR4表达的小鼠来源的细胞株，将构建好的穿梭质粒瞬转，37℃,5%CO2孵箱中孵育72h后，收集细胞分别用蛋白裂解液及Trizol裂解细胞提取总蛋白及总RNA,待做Western blot及RT-PCT分析。在干扰效率大于70%时，进行慢病毒包装。
　　慢病毒包装
　　细胞转染
　　溶液的制备提取慢病毒包装系统中三种质粒DNA，干扰效率达到70%以上的穿梭质粒，psPAX2和质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在~之间。
　　转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度，重新接种于 6cm细胞培养皿，37℃、5%CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70%~80%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
　　转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。
　　向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液
　　1μ shRNA plasmid750ngpsPAX2 packaging　envelope plasmidto 20μLserum-free OPTI—MEM在室温下温育5min。
　　将Lipofeetamine2000试剂轻柔摇匀，取Lipofectamine2000试剂在另一管中与Opti—MEM混合，在室温下温育5min。
　　把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5min之内混合。
　　混合后，在室温下温育20min，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物。
　　将DNA与Lipofeetamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。
　　培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20mL的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
　　每皿细胞中加入含10%血清的细胞培养基，于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48h。
　　病毒的收获
　　收集转染后48h的293T细胞上清液。于4℃，1 250rpm，离心5min除去细胞碎片。以滤器过滤上清液于50mL corning管中。-20℃ 或-80℃保存。
　　侵染靶细胞，检测有关蛋白基因的表达，揭示TLR在当中的作用
　　细胞铺板，根据不同需要决定接种细胞数目。转染当天，以检测的MOI值转染靶细胞，再往培养基内加入Polybrene，调至终浓度为8μg/mL，轻轻混匀，37℃过夜。第二天，换新鲜培养基。第三天，换新鲜培养基(含有嘌呤霉素)培养。AssayDays post-infectionmRNA knockdown(quantitative PCR)≥ 3 daysProtein knockdown(western blot)≥ 4 daysPhenotypic assay≥ 4 days随后，检测有关蛋白基因的表达，揭示TLR在当中的作用。
　　2结果
　　测序结果如下。
　　第1条 (S1)forward oligo:　5-CCGGAACCTCCAGGTTCTGATGTTGCTCGAGCAACATCAGAACCTGGAGGTTTTTTTG-3Rerverse oligo:　　5-AATTCAAAAAAACCTCCAGGTTCTGATGTTGCTCGAGCAACATCAGAACCTGG测序结果：第2条 (S2)forward oligo:5-CCGGAAGTCCAGCAGAATCAATACACTCGAGTGTATTGATTCTGCTGGACTTTTTTTG-3Rerverse oligo:5-AATTCAAAAAAAGTCCAGCAGAATCAATACACTCGAGTGTATTGATTCTGCTGGACTT-3测序结果：第3条：(S3)forward oligo:5-CCGGAAGGTGAAGCGAATCACAGTACTCGAGTACTGTGATTCGCTTCACCTTTTTTTG-3Rerverse oligo:5-AATTCAAAAAAAGGTGAAGCGAATCACAGTACTCGAGTACTGTGATTCGCTTCACCTT-3测序结果
　　干扰效率检测
　　检测表明干扰效果明显，达到80%以上。1：细胞2：P ：S14：S25：S3图1干扰效果WB检测图A：GFPB：white light　　C：病毒噬斑照片图2慢病毒转染效果图
　　重组慢病毒的包装
　　将干扰效果最好的，进行慢病毒包装。
　　3讨论
　　RNA干扰是进化中保守的一种过程，在基因的转录后针对含有特异性序列的mRNA进行沉默。RNAi技术的出现,成了一种新的反向遗传学手段被广泛地应用于基因功能分析、信号转导通路研究和基因治疗。质粒介导RNAi有一定的局限性,转染率低,基因抑制表达作用弱,持续时间短,不适合体内实验。慢病毒载体是一种复制缺陷型逆转录病毒载体,以HIV21为基础发展而得,具有许多优点,能够转染非分裂期细胞和分裂期细胞,而且病毒的遗传物质能够整合到宿主的基因组,将其用于瘤的基因治疗,除比其他病毒载体更具优势外,病毒的VSVG外壳使载体病毒颗粒具有更强的稳定性,慢病毒载体RNAi作用持久,同时扩大了载体感染细胞的范围,因此慢病毒载体是很有前途的基因治疗载体。最近,用慢病毒载体介导RNAi的几项体内外研究即显示了该技术策略在内源性基因功能研究和基因治疗前沿领域的重大意义。人类TLRs家族至少有11个成员，各自识别特异的病原体相关模式分子，拥有特殊的细胞内信号通路，参与了机体应对不同病原微生物入侵的免疫反应。TLR2和TLR4两者都在细胞膜上表达，分别涉及革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞壁成分的识别。TLR2能够识别革兰氏阳性细菌壁成份脂磷壁酸(lipoteichoicacid，LTA)，肽聚糖和脂肽，而应对革兰氏阴性细菌壁成份内毒素/LPS则需要TLR4。TLR2和TLR4在识别病原微生物、产生促炎细胞因子和启动宿主炎症反应中发挥着重要的作用。在应对外来病原微生物分子的过程中，TLRs介导的细胞内信号传递导致促炎细胞因子基因的表达。各个TLRs在微生物之间分辨能力似乎是宿主对各种病原体防御特异性的决定因素，这种特异性可借助TLRs的相互作用来达到。由于TLRs是识别外来入侵病原微生物和活化宿主天然免疫系统的主要成份，TLRs表达和信号传递的变化不仅在脓毒血症而且在外科应激的发病机理中也发挥着重要的作用。
　　巨噬细胞通过多种吞噬受体如Fcγ受体(FcγRs)、补体受体3(CR3)检测到入侵病原体。在微生物病原体的吞噬过程中，表面的TLRs包括TLR4和TLR2被募集到吞噬体并被微生物细胞壁成分活化。即使TLR4和TLR2的刺激是否调节吞噬体的成熟仍然是一个尚有争论的问题，TLRs的结合被证明可通过IRAK-4和P38激活MyD88依赖的信号，导致许多吞噬基因表达程序的上调。
　　我们的前期工作(江苏省卫生厅重大项目K200509)主要探讨了Toll样受体在新生儿手术应激中的意义，我们发现新生儿和婴幼儿手术应激后，术后即刻外周血单核细胞表面TLR2和TLR-4表达水平有明显下降的趋势，术后1d恢复正常水平;经过进一步分析，有感染的新生儿和婴幼儿，术后1d TLR-2和TLR-4水平仍较低。据此，我们推测提出如下假设：手术应激可导致TLR-2和TLR-4受体表达水平的下降，从而影响吞噬体的成熟，导致感染并发症的增加。而这一点在新生儿和婴幼儿由于其巨噬细胞吞噬体成熟的滞后和缺陷而表现尤为突出。
　　基于上述的认识，本课题将在延续我们多年研究的基础上，对婴幼鼠及成年鼠吞噬体成熟和杀菌功能及其作用机理进行研究，着重阐明两个问题：①明确婴幼和成年小鼠腹腔巨噬细胞吞噬体成熟是否存在不同;②Toll样受体在巨噬细胞吞噬体成熟过程中发挥的作用。如能达到预期目的，将为开展新生儿重症感染时的免疫调控干预提供进一步的理论依据，此举具有重大的科学价值。
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