大肠菌群检测方法中文翻译.doc

大肠菌群检测方法中文翻译

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2020年4月19日
文档仅供参考
3 定义和简介
3.1 定义
所有的大肠菌群均是发酵乳糖，革兰氏阴性，无牙孢的杆菌。官方的对大肠菌群的定义可能以培养温度（30、32、35、37）不同作评价；或以确定是否发酵乳糖产气作为定义的一个特征.大多数ISO和其它官方标准是利用发酵乳糖产气作为一个定义特征。而在ISO 4832 中则利用了在VRBL上的菌落大小作为其唯一的定义特征。
鉴于这些定义的不同，建议实验室根据相关定义用相应的适当方法。
l 国际标准：样品分析是否符合国际交易规范
l 官方主市场调整定义：样品分析是否符合地方标准
l 一般定义：样品分析是否符合一般规范。
任何必要方法的调改必须经过市场实验室质量确认中心和雀巢研究中心食品安全微生物组的协助。
以下为一些官方定义例子：
*ISO 4831大肠菌群是经过其在选择性肉汤上的生长和发酵乳糖产气能力来定义
*AOAC INTERNATIONAL, APHA/FDA定义大肠菌是指发酵乳糖产酸产气（T=32或35度）革兰氏阴性杆菌
*ISO 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小（最小5mm直径）和产酸情况。(T=30或35或37℃)
3．1．1 液体培养基中
ISO 4831 大肠菌群是根据其在选择性肉汤中生长能力和发酵乳糖产气情况来定义.(T=30或35或37℃)
AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。（T=32或35℃）
由LI第一章概述，大肠菌群是指发酵乳糖气微生物群。
3．1．2 固体培养基中
IOS 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小（最小5mm直径）和产酸情况。(T=30或35或37℃)
AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。基于以上定义可知大肠菌群在VRBL培养基上会形成5mm以上直径的红色菌落且在确认试验中发酵乳糖产气
由LI第二章概述，大肠菌群是指在VRBL琼脂培养基上会形成特征性菌落且在确认试验中发酵乳糖产气微生物群。
3．2 简注
BGLB：亮绿乳糖胆盐培养基肉汤
LST：月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤
MPN：最可能数
VRBL：紫红胆汁琼脂
4 安全防范
大肠菌群不表现为无害，注意实验室的良好操作。
5 参考资料
5．1 LIs中提到的及其它心要文件
LI-00．700
LI-00．702
LI-00．743-2
5．2 参考书目
*美国公共健康协会(1985).日用品检验标准，华盛顿。DC
*Bruchez N (1996).Research Note QS-TN960017: Detection of coliforms-lnprovement of LST
*Colwell N.D.and M.D. Microbiological techniques-Some statistical aspects.J.Sci.Fd.Agric_20(1969)573-579
*ISO 4831:1991:Microbiology-General guidance for the enumeration of coliforms-Most probable number technique.
* ISO 4831:1991:Microbiology-General guidance for the enumeration of coliforms -Colony count technique.
*Merck Microbiology Manual
*U.S.FDA(1995).Bacteriological Analytical Manual,8th Ed AOAC international, Gaitheresburg,MD,pp 4.01-4.29
6 前面说法之修正
完整修订本额外细节在大肠菌群计数、定义和分离改编中提供。
7方法认可
审批人
签名
日期
编写者

组领导

部门领导

CT-QM

8 附
1安全说明
2
概述
大肠菌群的研究与举例
第一章
液体培养基中的生长研究
1方法原理
接种至原倍或稀释后的选择性培养基中，30℃培养24-48小时，再经过转接阳性管进确认。
摘要
根据大肠菌群相应用的不同定义选用不同的培养温度（30℃/32℃/35℃/37℃）(查阅定义)
2 培养基的准备
在使用化学药品前查阅Sigma/Aldrich化学药品安全指南或其它相应手册或地方权威提供的安全数据表。认真阅读附1中的安全说明。更多的安全信息可从NEC/QS中获得。
2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）
根据制造商说明配制培养基，如是非成品干粉则可按以下方法配备（g/L）

单倍料 （g） 双倍料(g)
胰蛋白胨 20.0 40.0
乳糖 5.0 10.0
磷酸二氢钾 2.75 5.5
磷酸氢二钾 2.75 5.5
氯化钠 5.0 10.0
月桂硫酸钠 0.1 0,2
蒸馏水 1000ml 1000ml
PH6.6-7.0(25℃)
将以上化合物水中溶解，必要时能够加热，调整PH
单倍料分装到16*160mm的试管中每管10ml
双倍料分装到18*180mm的试管每管10ml
121℃,15分钟灭菌
为了避免月桂硫酸钠沉淀，LST室温贮藏不应超过4星期。
注意
由于样品引起高百分比的假阳性，也就说气体的产生是由于其它微生物而非大肠菌群。
在LST肉汤灭菌后加入无菌梭链孢酸或万古霉素，最终浓度为10毫克每毫升。
2.2 亮绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）
蛋白胨 10.0
乳糖 10.0
脱水牛胆苯 20.0
煌绿 0.0133
蒸馏水 1000ml
PH7.0-7.4(25℃)
将以上化合物水中溶解，必要时能够加热，调整PH, 分装到带有小试管的16*160mm的试管中每管10ml，灭菌后小试管中不应含有气泡。
3 化学药品与材料
商业参考仅供指导，列在页边提到的或是莫克化学药物和试剂目录或是 莫克微生物手册或是雀巢实验室材料。
3．1化学药品
101310 微生物煌绿
104873 KH2PO4 p.a.
K2HPO4 anhydrous GR
梭链孢酸钠盐 Sigma F 0881
Mannanase solution, Novo Nordisk KHNO1051
a-淀粉酶，Termamyl 1201 Novozymes
106404 氯化钠，p.a.
107657 微生物一水乳糖
112533 生物化学月桂基硫酸钠
822187 万古霉素氢化物，sigma V
3.2 药品和准备
1.03756干纯微生物牛胆苯
1.05454 BGLB或Oxoid CM31
1.07214 胰蛋白胨
1.10213 微生物胰蛋白
1.10266 LST或Oxoid CM 451 或Difco 0241
3.3 器材
101601 试管，直径15或16mm,长160mm
101603 平口试管Ф17/18mm长180mm
101605 平口试管，聚丙烯，Ф10mm长100mm
101901 发酵试管，圆底，纵切Ф7 mm长28 mm
252801 发酵试管，聚丙烯，Ф12mm 长55mm
902103 调整到30±1℃培养，如Heraeus B6120
4 样品
样品处理根据产品相关标准或说明
根据L1-00.700或L1S细节取适当用量选恰当方法处理样品。
5步骤
5．1 样品的准备
样品的准备与稀释在L1-00.700中有说明
注意
在从第一个稀释度（-1）的准备到最后的分析不超过15分钟
5．2样品准备-特别事项
5．2．1 谷物和面粉类制品
用100ml蒸馏水溶解5g淀粉酶，过滤灭菌并加10ml到80ml无菌的TS中。
5.2.2稠化
1ml甘露聚糖酶加99mlTS溶解，过滤灭菌
注意
加入的甘露聚糖酶体积能够增加到3ml，以促进诸如藻酸盐、果阿胶、黄原胶特殊稠化剂的溶解。
5.2.3卵磷脂
灭菌前加1ml到80至90ml的TS中，第一个稀释度充分混匀。
5.2.4 含脂肪较多的食品（＞20%脂肪含量）
灭菌前加1ml到80至90ml的TS中，第一个稀释度充分混匀。
5.2.5酸性或类酸性产品
第一稀释度PH低于6.5的，用1N的氢氧化钠调至PH6.5-7.0
5.2.6婴儿食品
根据样品类型要求，如ML-44.006和CP-08.714中所述，称取10g产品到90mlTS中，在宽颈瓶里稀释。将产品喷洒到该溶液上，放置10分钟，经过慢慢旋转瓶子将湿润、溶解。如有必要，40℃以下水浴5分钟同时轻轻震荡散热，然后室温放置。
如果其它类型样品要求，可适当调整TS用量。
5.2.7植物乳
用LST加万古霉素。加过滤灭菌后的万古霉素稀释至最终浓度10µg/ml
5.3 接种
转接10ml第一个稀释度或10ml原液体样品到10ml双倍LST料液
1ml（-1）稀释液和之后的稀释接到10ml单倍LST培养液中
小心混匀接种液与培养液
5.4 培养
所有的双倍和单倍LST试管30±1℃培养24和48小时
注意
如果是婴儿食品分析，LST肉汤必须在37±1℃培养24和48小时
5.5 观察
24和48小时后检查各试管，有产气或变浑浊的均认为是假定大肠菌群。大肠菌群的存在应该在这些管中确认。
5.6确认
每支产气或浑浊管转接一环到BGLB肉汤30℃培养。如果此阶段气体形成无法观测则再培养24小时。
24或48小时培养后对每个稀释的阳性管数第一时间统计。
注意
对于婴儿食品，LST假定阳性管要在VRBL上进行划线培养，用于如L1-00.743-2上所述进行后续鉴定
6结果描述
6.1 计算
仅计算大肠菌阳性管并将结果表述如下：
出现或不出现测试：基于阳性管确认数，根据所做稀释度计算，并表示为：每克或每毫升分析样出现或不出现大肠菌。（见L1-00.700）
最大可能数（MPN）：根据L1-00.700计算大肠菌确认数。
6.2方法的精确度
如果是MPN，其结果必须考虑到置信度的限制。
第二章
固体培养基中的举例应用
1方法原理
倾注法接种到VRBL琼脂培基上，并做适当的稀释度。30℃培养20至24小时。列举特征菌落。
注意
根据所提供的不同的大肠菌群的定义选择不同的培养温度。
2试剂与器材
2.1脂红胆汁乳糖胆盐VRBL
根据制造商说明准备培养基，如非干粉成品，按以下方法配置
蛋白胨 7.0
酵母汁 3.0
乳糖 10.0
氯化钠 5.0
胆汁盐 1.5
中性红 0.03
结晶紫 0.002
琼脂-琼脂 9.0-18.0
蒸馏水 1000ml
PH7.2-7.6（25℃）
*根据供应商推荐
各组分水中放置5分钟，混合，煮沸，同时搅拌。调整PH，煮沸2分钟，不须灭菌和再热。立即45-47℃水浴冷却。
2.2 BGLB
药品和试管的准备参考第一章
3 化学药品、培养基和器材
3.1化学药品
3.2培养基和微生物准备
3.3器材
请参考第一章和L1-00.700
4 样品
根据标准或产品相关说明处理
依据L1-00.700或L1s的具体规定选取适当量和恰当方法处理样品
5步骤
5.1 样品准备
样品准备和稀释如L1-00.700上所述
注意
在从第一个稀释度（-1）的准备到最后的分析不超过15分钟。
5．2样品准备-特别事项
参照第一章5.2.1至5.2.5.
5.3接种
转接每个适当梯度1ml到无菌平皿，马上倾注45-47℃的VRBL约15ml，马上将其混匀，水平放置冷却凝固，不堆叠。
完全凝固后再一层5-10ml的VRBL在上面，然后待凝固。
5.4 培养
倒扣放置30±1℃培养20-24小时，不要堆放超过6个皿。
5.5.1 ISO方法4832
在VRBL上培养，计数直径0.5mm或更大，略带紫色的菌落，有时其周边会有微红胆盐沉淀物
注意
不要求再确认
5.5.2 AOAC，BAM
在VRBL上培养，计数直径0.5mm或更大，略带紫色的菌落，有时其周边会有微红胆盐沉淀物。确认那些认为有气体产生（如5.6所述）的菌落为大肠菌群。
注意1
在菌落周边出现的微红胆盐沉淀取决于大肠菌群的类型和培养基的质量。
注意2
某些大肠菌群菌落颜色能够变成粉红色或者甚至白色。
5.6确认
接种5个特征菌落到BGLB管中（2.2），30℃培养24小时.如果24小时后气体产生不易观察，可再培养24小时。产生有气体在发酵管中的被认为是大肠菌群。
24或48小时后，记数每个稀释度的产气管数，将结果代入公式计算（第六节）
注意
如果是婴儿食品，在VRBL琼脂上的菌落则须如L1-00.743-2上所述进行鉴定。
6 结果表示
保留特征菌落数在10-150之间的平皿，每克或每毫升样大肠菌数计算如下：
number（per g or ml）=ΣC /（n1+0.1n2）d
ΣC：所有保留下来的平皿的菌落总和
n1：保留下来的平皿中第一稀释度的平皿数
n2：保留下来的平皿中第二稀释度的平皿数
d：
例
10-2稀释度： 128个菌落
10-3稀释度： 11个菌落
number/g=128+11/（1+0.1*1）*10-2=1.3*104coliforms/g
特殊情况参考L1-00.700.
附4
步骤 要点

5.1和5.2样品准备/稀释
参考L1-00.700或L1s

6结果表示
5.6确认
接种一环4.4到BGLB试管中30℃培养24小时（如需要）48小时
5.5观测
计数略带粉红色特征菌落

5.4培养
30±1℃培养20-24小时
*也可参考第三段定义

5.3接种1ml在VRBL，倾注覆盖。
培养基：检查质量，根据L1-00.702或供应商推荐选择。将培养基和接种液混匀。盖层是要抑制竞争菌在表面的生长与繁殖（如：假单胞菌）

不要培养超过24小时

只记数菌落数在10-150间的平皿

只保留菌落数在10-150间的平皿