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第 29 卷 第 15 期 农 业 工 程 学 报 Vol.29 No.15 294 2013 年 8 月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Aug.2013 超声波-表面活性剂协同萃取苦瓜皂苷 于 滨1,2，葛邦国2，宋 烨2，李丹丹2，马晓燕2，吴茂玉2（1.枣庄学院生命科学学院，枣庄 277160；2.中华全国供销总社济南果品研究院，济南 250014）摘 要：为了探索快速有效的苦瓜皂苷提取方法，该文利用响应面法研究了超声功率（133167 W/g）、乙醇体积分数（60%80%）、十二烷基硫酸钠（SDS）质量浓度（1525 mg/mL）对苦瓜皂苷萃取率的影响，并对所得苦瓜皂苷的结构进行初步鉴定。结果表明响应面所建立的苦瓜皂苷提取模型能很好地预测不同提取条件下的苦瓜皂苷提取率。超声功率、乙醇体积分数、SDS 质量浓度均对苦瓜皂苷提取率存在显著影响（p0.05），其中超声波功率与 SDS 质量浓度间存在协同作用。验证试验表明超声功率为 153 W/g，乙醇体积分数为 74%，SDS 质量浓度为16 mg/mL，苦瓜皂苷提取率达到 3.22%，显著高于（p0.05）乙醇及超声萃取。液相色谱-多级质谱表明所萃取的皂苷由苦瓜皂苷 L 和苦瓜皂苷 F2组成。超声波-表面活性协同萃取是一种有效的提取皂苷方法，值得进一步的开发应用。关键词：超声波，优化，模型，苦瓜皂苷，表面活性剂，协同萃取，结构鉴定 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2013.15.036 中图分类号：TS255.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6819(2013)-15-0294-07 于 滨，葛邦国，宋 烨，等.超声波-表面活性剂协同萃取苦瓜皂苷J.农业工程学报，2013，29(15)：294300.Yu Bin,Ge Bangguo,Song Ye,et al.Ultrasound-surfactant synergistic extraction of saponins from balsam pearJ.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2013,29(15):294300.(in Chinese with English abstract)0 引 言 苦瓜属于葫芦科苦瓜属植物，广泛种植于热带、亚热带地区。苦瓜作为药食同源的蔬菜，具有清热解毒和清心等功效1。近年来研究证明苦瓜具有明显的降血糖2、抗肿瘤3、抑制皮肤炎4等作用。苦瓜皂苷是苦瓜中的有效成份之一，占苦瓜干物质质量分数的 4%，大部分属于三萜类5。苦瓜皂苷具有降血糖6，抗肿瘤7，抗氧化8等多种活性。前人对苦瓜中皂苷成分的提取已有研究，可采用有机溶剂提取9、索式提取10、超声提取11等方法，但最大提取率不超过 3%，提取效率不高了影响进一步的试验与应用。罗登林等12利用表面活性剂强化超临界 CO2萃取人参皂苷，取得了较好的效果。Choia利用高压液相萃取与非离子表面活性剂从西洋参中提取人参皂苷，不但提高提取效果，而且缩短了提取时间13。而 Sun 利用微波辅助表面活性剂从黄 收稿日期：2013-03-13 修订日期：2013-7-21 基金项目：国家农业科技成果转化资金项目（2008GB24420474）作者简介：于滨（1980），男，讲师，博士，研究方向为：农产品加工与贮藏工程。枣庄 枣庄学院生命科学学院，277160。Email: 通信作者：吴茂玉（1972），男，研究员，博士，研究方向为：农产品加工与贮藏工程。济南 中华全国供销总社济南果品研究院，250014。Email: 连中提取生物碱，并认为该方法是一种绿色快速的有效方法14。表面活性剂还可以用于其他多环芳烃15及多种活性物质的提取16。但利用表面活性剂强化提取苦瓜皂苷的研究未见报道。为研究有机溶剂浸提、超声提取及表面活性剂强化浸提的协同作用及其各自浸提效果，本试验以乙醇溶液为溶剂，加入少量表面活性剂与超声波协同萃取苦瓜皂苷。乙醇能够改善溶剂的极性，提高皂苷的溶解性17，表面活性剂能增强溶剂对皂苷的润湿性和渗透性18，超声波可以强化对溶剂的渗透性，加速皂苷的溶出19，将三者结合起来能增加浸出效能和萃取率，达到省时、节能、萃取率高的目的，为皂苷提取提供一种思路。1 材料与方法 1.1 材料与试剂 苦瓜汁冻干粉，大绿苦瓜（皂苷质量分数为1.56 mg/g）经破碎、机械压榨得苦瓜汁（皂苷质量分数为1.68 mg/g，含水率 96.3%），经冻干（40预冻3 h，升华温度37.526，解析温度40）得苦瓜汁冻干粉（皂苷质量分数为 46.50 mg/g，含水率 3.2%），再经粉碎过 80 目筛；十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate,SDS），国药集团化学试剂有限公司；人参皂苷 Rg1 对照品，中国药品检验所；XAD-2 大孔树脂，寰宇科技（北京）有限公司；第 15 期 于 滨等：超声波-表面活性剂协同萃取苦瓜皂苷 295 甲酸（色谱纯），德国 Merck 公司；乙腈（色谱纯），德国 Merck 公司；其他试剂均为国产分析纯。1.2 仪器与设备 KQ250B 超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；752 紫外-可见分光光度计，上海棱光仪器有限公司；Thermo LTQ XL 液相色谱-质谱联用仪，美国 Thermo 公司；Surveyor Plus 二维液相色谱系统，美国 Thermo 公司。1.3 试验方法 1.3.1 苦瓜总皂苷的提取方法 超声波-表面活性剂协同提取法：准确称取苦瓜冻干粉 3 g 于 250 mL 三角瓶中，加入 50 mL 一定体积分数乙醇溶液（60%80%）及十二烷基硫酸钠（SDS）（1525 mg/mL）后，在一定功率下（133167 W/g），依据文献11，选择超声提取温度 60浸提 2 h，取出过滤，将滤渣二次浸提后过滤，滤液在 60、真空度为 0.01Mpa 条件下减压浓缩后，用水饱和正丁醇溶液萃取过夜；分离出正丁醇相，经减压浓缩、真空冷冻干燥（40预冻 3 h，升华温度37.526，解析温度40）后得苦瓜皂苷粗品20。有机溶剂提取法：利用试验优化后的乙醇萃取浓度，在 60浸提 2 h，其他同超声波-表面活性剂协同提取法。超声波辅助提取法：利用试验优化后的超声功率和乙醇萃取浓度，在 60浸提 2 h，其他同超声波-表面活性剂协同提取法。提取过程中苦瓜皂苷提取率按照（1）式计算。100%=皂苷质量皂苷提取率苦瓜汁冻干粉质量 （1）1.3.2 苦瓜总皂苷含量的测定 采用香草醛-高氯酸比色法测定苦瓜总皂苷的含量21。1.3.3 苦瓜皂苷的纯化 将苦瓜皂苷粗品加蒸馏水充分溶解，取 1mL溶解液上 XAD-2 大孔树脂，用 4 倍柱体积去离子水洗柱用以除去水溶性杂质，弃去洗脱液，再用 4倍柱体积 70%的乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩蒸干后得苦瓜皂苷纯品22。1.3.4 苦瓜皂苷的结构分析 利用液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）对纯化后的苦瓜皂苷组成进行分析。1）高效液相色谱分析 液相色谱条件依据文献23，并做适当修改，具体如下。检测器：UV 检测器；检测参数：扫描波长范围：200600 nm，采用三通道检测：220 nm(Channel A)，254 nm(Channel B)，280 nm(Channel C)；色谱柱：Hyper Gold C18(100 mm2.1 mm，3 m)；柱温：25；流动相：体积分数为 0.1%的甲酸水溶液、乙腈，05 min，10%60%乙腈，518 min，60%80%乙腈，1819 min，80%95%乙腈，1922 min，95%乙腈，2222.1 min，95%10%乙 腈，22.1 25 min，10%乙 腈；流 速0.4 mL/min；进样量 5 L。2）质谱条件 离子源：HESI-II；喷雾电压：3.5 kV；鞘气流速：100 L/min；辅助气流速：10100 L/min；离子传输管管温度：320；气化温度：300；扫描模式：Full MS 及 dd-MSn(CID 35%)；扫描范围：m/z 1001 000。质谱采用全扫描（Full Scan）模式对样品进行一级质谱扫描，推测化合物分子量；并通过数据依赖多级质谱扫描（dd-MSn）模式完成样本主要成分的多级质谱扫描以推断其结构。1.3.5 试验设计 为建立超声波-表面活性剂协同萃取模型，同时比较 3 种提取方法关键影响因素的差异，本文依据文献11将苦瓜皂苷的萃取温度（60）和时间（2 h）分别固定，基于文献8,11和单因素试验，采用Box-Behnken 模型的响应面法优化超声功率（133167 W/g）、乙醇体积分数（60%80%）、SDS 质量浓度（1525 mg/mL）对苦瓜皂苷提取率的影响。根据试验方案进行试验后，对试验数据进行二次回归拟合，建立苦瓜皂苷萃取模型。2 结果与分析 2.1 苦瓜皂苷萃取模型的建立 按照试验设计方案进行试验，结果如表 1 所示。对表 1 在不同条件下所测得的皂苷提取率进行多项式拟合回归，以皂苷提取率为因变量，超声功率，乙醇体积分数，SDS 质量浓度为自变量，建立回归方程如下：Y=58.317+0.511A+0.433B+0.582C0.0006AB 0.0002BC+0.002AC0.002A20.002B2 0.022C2 （2）式中，Y代表皂苷提取率，%，A代表超声功率，W/g，B代表乙醇体积分数，%，C代表 SDS 质量浓度，mg/mL。对回归方程方差分析见表 2，其决定系数（R2）为 95.25%，表明 95.25%的试验数据可用该模型进行解释，说明方程可靠性较高。Y的变异系数（CV）越小，显示试验稳定性越好，本试验中CV值为6.94%，说明试验操作可信。综上说明该回归方程为优化苦瓜皂苷提取工艺条件提供了一个良好的农业工程学报 2013 年 296 模型。表 1 试验设计条件及结果 Table 1 Design and results of experiment 试验号 Test number 超声功率 A Ultrasonic power/(Wg-1)乙醇体积分数B Ethanol volume fraction/%SDS 质量浓度 C Mass concentrations of SDS/(mgmL-1)皂苷提取率 Y Extraction rateof saponins/%1 133 60 20 1.99 2 167 60 20 2.37 3 133 80 20 2.64 4 167 80 20 2.58 5 133 70 15 1.62 6 167 70 15 1.79 7 133 70 25 1.88 8 167 70 25 2.92 9 150 60 15 1.91 10 150 80 15 2.37 11 150 60 25 2.28 12 150 80 25 2.71 13 150 70 20 3.22 14 150 70 20 3.05 15 150 70 20 3.15 16 150 70 20 2.92 17 150 70 20 3.15 表 2 回归方程的方差分析结果 Table 2 Variance analysis of regression equation 变异来源 Source 平方和 Sum of squares 自由度df 均方 Mean square F 值 F valuep 值 p value模型 Model 4.2307 9 0.4701 15.58000.0008A 0.2926 1 0.2926 9.69810.0170B 0.3828 1 0.3828 12.68760.0092C 0.5513 1 0.551 18.27020.0037AB 0.0484 1 0.0484 1.60410.2458AC 0.1892 1 0.1892 6.27150.0407BC 0.0002 1 0.0002 0.00750.9336A2 0.9863 1 0.9863 32.69050.0007B2 0.2019 1 0.2019 6.69300.0361C2 1.3275 1 1.3275 43.99770.0003残差 Residual 0.2112 7 0.0302 失拟 Lack of Fit 0.1569 3 0.0523 3.85470.1127纯误差 Pure Error 0.0543 4 0.0135 总和 Cor Total 4.4420 16 对回归方程进行方程分析，由表 2 可以看出，模型F值和失拟p值的数值说明其他因素对试验结果干扰较小，模型能较好的反映数据。A、B、C、AC、A2、B2、C2的p值小于 0.05，因此对回归方程进行简化。Y=58.317+0.511A+0.433B+0.582C+0.002AC 0.002A2 0.002B2 0.022C2 （3）2.2 模型影响因素分析 通过对试验数据的极差分析，可以得出各因素对响应值的影响，结果如表 3 所示。表 3 试验数据极差分析 Table 3 Range analysis of experimental data 因 素Factors超声功率 Ultrasonic power乙醇体积分数 Ethanol volume fraction SDS 质量浓度 Mass concentrations of SDS k-1 2.03 2.14 1.92 k0 2.75 2.63 2.79 k1 2.42 2.58 2.45 R 0.72 0.46 0.87 从单因素对皂苷提取率的影响可以看出，随着超声功率的增加，皂苷提取率呈现先上升后下降的趋势，当超声功率达到 153 W/g 时，皂苷提取率达到较高水平。随超声功率的增大，细胞的破裂越来越完全，因而总皂苷含量也随之增大。继续增加超声功率，组织细胞大量破裂，导致细胞内不溶物及粘液质等进入提取液中，增大传质阻力，影响有效成分的溶出24。SDS 质量浓度与超声功率呈现相同的趋势，当 SDS 质量浓度达到 16 mg/mL 时，皂苷提取率达到较高水平。随着 SDS 质量浓度增大，溶液中形成胶束数目增多，对皂苷的溶解能力增强25。乙醇体积分数呈现逐渐上升的趋势，后期稍有下降，当乙醇体积分数为 75%时，皂苷提取率达到较高水平。乙醇体积分数过小，多糖等物质易溶出，影响纯化难度，总皂苷提取率低，而乙醇体积分数过高，脂溶性成分溶出增多，影响皂苷的纯度26。极差表明各因素对皂苷提取率影响从大到小依次为：SDS 质量浓度、超声功率、乙醇体积分数。将乙醇体积分数固定在零水平，即可得到超声功率与 SDS 质量浓度交互作用对苦瓜皂苷提取率影响的子模型，如图 1 所示。图1 交互作用对皂苷提取率的影响（乙醇体积分数为70%）Fig.1 Effect of interaction on extraction rate of saponins（Ethanol volume fraction was 70%）从图可以看出，当乙醇体积分数固定在零水第 15 期 于 滨等：超声波-表面活性剂协同萃取苦瓜皂苷 297 平，高皂苷提取率处于响应曲面的中心，超声功率与 SDS 质量浓度在较低水平均对皂苷提取率有促进作用，而在较高的水平下，皂苷提取率稍有下降。响应面中皂苷提取率最大可以达到 3.20%，均高于各单因素作用下的最大提取率，因此可以看出超声功率与 SDS 质量浓度的交互作用明显。2.3 皂苷提取工艺优化 对回归方程进行分析，可知当超声功率153 Wg-1，乙醇体积分数为 74%，SDS 质量浓度16 mgmL-1时，皂苷提取率可以达到 3.20%。为验证模型的可靠性，比较有机溶剂法、超声浸提法与本文中提取方法对皂苷提取率的影响，各进行 5 批次试验。采用本文模型优化的提取条件提取皂苷，平均皂苷提取率到 3.22%，与预测值相对标准偏差(RSD)为 0.62%。而利用乙醇萃取和超声波萃取的平均皂苷提取率分别为 2.48%与 2.85%。表明Box-Behnken 模型优化可有效用于苦瓜皂苷提取条件的优化，所得参数准确可靠，具有实用价值。另外对比三种皂苷提取方法，有机溶剂提取皂苷效果最差，超声波辅助可以有效的提高有机溶剂提取皂苷的提取效果，而采用超声波-表面活性剂协同提取苦瓜皂苷效果最好，可见表面活性剂在提取皂苷的过程中起到重要作用，这可能与极性较小苦瓜皂苷易溶于 SDS 等表面活性剂的溶液中有关，超声波在处理过程中加速了皂苷溶出，使得苦瓜皂苷能在较短时间内高效提取27-28。2.4 苦瓜皂苷成分的初步鉴定 为验证所提取苦瓜皂苷种类，结合苦瓜皂苷种类的研究，本试验采用质谱分析，对提取的苦瓜皂苷种类进行初步鉴定。对纯化后的苦瓜皂苷进行质谱扫描分析，并结合文献的报道28-29，确定所提取的皂苷可能由苦瓜皂苷 L（C36H58O9）及苦瓜皂苷 F2（C36H58O8）组成，其多级质谱如图 2，3 所示。图 2 苦瓜皂苷 L 的多级质谱图 Fig.2 Multi-level MS of momordicoside L 文献29报道苦瓜皂苷 L（C36H58O9）的分子量为 634，图 2a 一级质谱扫描可知，在 m/z 635 处产生的峰为M+H+，与文献29相一致，由此推断可能为苦瓜皂苷 L。为进一步验证是否为苦瓜皂苷 L，进行多级质谱检测。多级质谱得到的碎片信息与苦瓜皂苷 L 推测的裂解过程一致，故可以推断此物质为苦瓜皂苷 L。文献28报道苦瓜皂苷 F2（C36H58O8）的分子量农业工程学报 2013 年 298 为 618，由图 3a 的一级质谱扫描可知，在 m/z 619处产生的峰为M+H+，与文献28相一致，由此推断苦瓜皂苷 2 可能为苦瓜皂苷 F2。为进一步验证是否为皂苷 F2，进行多级质谱检测。多级质谱得到的碎片信息与苦瓜皂苷 F2推测的裂解过程一致，因此可以推断此物质为苦瓜皂苷 F2。图 3 苦瓜皂苷 F2的多级质谱图 Fig.3 Multi-level MS of momordicoside F2 3 结 论 本文利用 Box-Behnken 模型建立了超声波-表面活性剂协同萃取苦瓜皂苷的预测模型，其决定系数（R2）为 95.25%。预测模型中 SDS 质量浓度、乙醇体积分数、超声功率 3 个因素及超声功率与SDS 质量浓度的交互项对皂苷得率影响显著。应用预测模型对苦瓜皂苷的提取工艺条件进行了优化，验证试验结果表明当超声功率 153 W/g，乙醇体积分数为 74%，SDS 质量浓度为 16 mg/mL 时，皂苷提取率可以达到 3.22%。各因素对皂苷提取率影响从大到小依次为：SDS 质量浓度、超声功率、乙醇体积分数。相对于有机溶剂提取法、超声波辅助提取法，超声波-表面活性剂协同萃取法能有效提高苦瓜皂苷的提取率，相对乙醇和超声萃取，分别提高了 29%和 12%。所提取的苦瓜皂苷经纯化后，利用LC-MS 的多级质谱分析，表明提取的皂苷是由苦瓜皂苷 L（C36H58O9）及苦瓜皂苷 F2（C36H58O8）组成。参 考 文 献 1 董华强，蒋跃明，汪跃华.苦瓜采后热处理对其抗冷性的影响J.农业工程学报，2005，21(5)：186188.Dong Huaqiang,Jiang Yueming,Wang Yuehua.Effects of hot water treatments on chilling tolerance of harvested bitter melonJ.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2005,21(5):186 188.(in Chinese with English abstract)2 Fuangchana A,Sonthisombata P,Seubnukarnb T,et al.Hypoglycemic effect of bitter melon compared with metformin in newly diagnosed type 2 diabetes patientsJ.Journal of Ethnopharmacology,2011,134(2):422428.3 Konishi T,Satsu H,Hatsugai Y,et al.Inhibitory effect of a bitter melon extract on the P-glycoprotein activity in intestinal Caco-2 cellsJ.British Journal of Pharmacology,2004,143(3):379387.4 Park Dai,Tran N P,Duncan J M,Complementary use of topical bitter melon for atopic dermatitisJ.Alternative 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