细胞生物学研究方法翟中和样本.doc

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第一节 细胞形态结构的观察方法

· 在细胞结构中, 细胞核、 线粒体、 核仁、 染色体直径大于0.2um, 能在普通光学显微镜中观察到的结构, 称为显微结构。
· 内质网膜、 核膜、 微管、 微丝、 核糖体等因小于0.2um而在普通光学显微镜中观察不到的结构, 被称为亚显微结构。
—、 光学显微镜
( 一) 普通复式光学显微镜
分辨力D=0.61λ / N•sin( α/2)
数值孔径( numeric aperture) NA＝N•sin( α/2)
λ=波长;
N=介质折射率;
α=镜口角, 标本在光轴上的一点对物镜镜口的张角, ≤140°。
提高分辨力的途径:
(1)降低l, 可采用不同光源
(2)提高N.A
普通显微镜最大分辨率为0.2μm, 人眼的分辨力是0.2mm, 因此一般显微镜设计的最大放大倍数一般为1000X。

( 二) 相差显微镜和微分干涉显微镜
相差显微镜
1．应用范围:
这种显微镜最大的特点是能够观察未经染色的标本和活细胞, 甚至细胞核、 线粒体等细胞器的动态。
2．相差显微镜的基本原理:
光线透过标本后发生衍射, 偏离了原来的光路, 同时被延迟了1/4λ( 波长) , 如果再增加或减少1/4λ, 则光程差变为1/2λ, 两束光合轴后干涉加强, 振幅增大或减小, 增强反差。
相差显微镜以较强的可见光作光源, 当光线到达标本面时, 标本内部的小粒、 小孔或其它结构均可产生衍射光 , 衍射光比直接入射的光线相位迟约l/4, 而且发生偏转、 发散。
相差显微镜的集光器内装有一套环状光栏, 环状光栏可使直射光在经标本面后, 最后在物镜后面聚集形成一个光环; 而标本面上发散的衍射光在到达物镜后焦面时不能聚焦成光环, 而分散在光环之外, 从而将直射光与衍射光在后焦面分开。
在相差显微镜后焦面装有一个相差板, 相差板分为环状的共轭区和环两侧的并协区, 直射光经过共轭区, 衍射光经过并协区。
可在共轭区和并协区分别涂上延迟相位的物质:
如果在并协区涂上延迟相位的物质, 使衍射光的相位差再延迟1/4 l , 使直射光与衍射光的相位差达1/2 l , 当这些产生衍射的颗粒或其它结构成像时, 合成波的振幅为二波振幅之差, 因而合成波的振幅比背景直射光的振幅小, 物象显得很黑而背景明亮, 这种效果叫暗反差;
如果在共轭区涂上延迟相位的物质, 直射光与被延迟1/4 l的衍射光同相位, 从而发生相长干涉, 合成波振幅比直射光振幅大, 物象比背景亮 , 这种效果叫明反差。

微分干涉显微镜
DIC显微镜的应用:
DIC显微镜使细胞的结构, 特别是一些较大的细胞器, 如核、 线粒体等, 立体感特别强, 适合于显微操作。
( 三) 荧光显微镜
荧光显微镜技术是当前在光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位研究最有力工具之一。
( 四) 激光扫描共焦显微境
激光扫描共焦显微镜既的应用: 细胞内生化组分的定位及动态变化分析。

二、 电子显微镜
用途:
· 用来观察标本内部( 透射电镜) 或表面细微结构( 扫描电镜) 。

第二节 细胞及其组分的分析方法
一、 用超离心技术分离细胞组分( 略)
二、 细胞成分的细胞化学显示方法( 细胞化学技术)
基本原理:
细胞化学染色( histochemical or cytochemical staining) 是利用显色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理, 对某种成分进行定性、 定位和相对含量分析的技术。
细胞内核酸、 蛋白质、 酶、 糖与脂类的显示方法举例:
核酸反应
Feulgen反应: DNA+Shiff试剂 紫红色
多糖反应
PAS反应: 多糖+过碘酸+无色品红 紫红色
可用于多糖、 粘多糖、 粘蛋白的检测。
脂类反应
四氧化锇+脂肪酸( 不饱和) 黑色
苏丹Ⅲ可使脂滴着红色, 苏丹黑可使磷脂和胆固醇着黑色。
三、 特异蛋白抗原的定位与定性( 免疫细胞化学技术)
基本原理:
免疫细胞化学( immunocytochemistry) 是根据免疫学原理, 利用标记抗体( 如荧光素、 酶、 胶体金耦连) 同特定抗原专一结合, 在光镜或电镜下对该抗原在组织、 细胞中进行定位测定的技术。
包括免疫荧光技术、 免疫酶标记技术、 免疫胶体金技术等。
免疫荧光技术用荧光素对抗体进行标记, 常见的萤光素有异硫氰酸荧光素( fluorescein isothiocyanate) 、 罗丹明( rhodamine) 等。包括直接免疫荧光标记和间接免疫荧光标记, 直接标记对抗原的抗体直接进行标记, 间接标记对抗原的抗体( 第一抗体) 的抗体( 第二抗体) 进行标记。免疫荧光技术检测需用荧光显微镜或激光扫描共焦显微镜。
免疫酶标记技术, 常见的酶有辣根过氧化物酶( horseradish peroxidase) 和碱性磷酸酶, 利用酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物, 从而显示出抗原存在的部位。能够在普通光镜或电镜下观察检测。
免疫胶体金技术是当前深受细胞生物学研究者亲睐的免疫电镜技术。

四、 细胞内特异核酸的定位与定性( 原位杂交技术)
基本原理:
具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段, 在适当条件下, 经过氢键结合, 形成DNA-DNA, DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。原位杂交就是用标记的核酸探针经过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法。
探针标记方法: 放射性标记、 荧光标记、 小分子标记等。
放射性标记探针具有放射性, 经过显微放射自显影来显示位置。
荧光标记探针用荧光素进行标记, 用荧光显微镜或激光扫描共焦显微镜观察。
小分子标记探针用生物素或地高辛等小分子标记, 杂交反应后, 用荧光标记或胶体金标记的抗生物素或抗地高辛的抗体检测, 用荧光显微镜或电子显微镜观察。
原位杂交技术在显微和亚显微水平上研究基因定位、 特异mRNA表示等方面具有重要作用

五、 定量细胞化学分析与细胞分选技术( 流式细胞术)
当前, 流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。
应 用:
定量测定细胞中DNA、 RNA、 特异标记蛋白质的含量, 以及细胞群体中某种成分不同含量的细胞的数量。
分选细胞、 细胞核、 染色体、 细胞器等。( 如分选含X和Y染色体的精子等)
包被细胞( 一般经过特异的荧光染色) 的液流称为鞘液, 所用仪器称为流式细胞计( flow cytometer) 。

第四节 细胞内生物大分子的动态变化

一、 荧光漂白恢复技术
1．概念
荧光漂白恢复( fluorescence photobleaching recovery, FPR) 技术是使用亲脂性或亲水性的荧光分子( 如荧光素、 绿色荧光蛋白等) 与蛋白或脂质耦联, 用于检测所标记分子在活体细胞表面或细胞内部的运动及其迁移速率, 有助于解决细胞内脂质和蛋白质的动态变化及其与其它成分的相互作用等一系列问题。
2．原理
利用高能激光束照射细胞某特定区域, 使该区域内标记的荧光分子发生不可逆的淬灭( 荧光漂白过程, 这一区域称为光漂白区) 。随后, 由于细胞中脂质或蛋白质分子的运动, 周围非漂白区的荧光分子不断向光漂白区迁移, 结果使光漂白区的荧光强度逐渐恢复到原有水平( 荧光回复过程) 。
二、 单分子技术与细胞生命活动的研究
三、 酵母双杂交技术
四、 荧光共振能量转移技术
荧光共振能量转移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) 技术用于检测细胞内2种蛋白质之间是否存在直接的相互作用。
其基本原理是:
当2个荧光发色基团的距离很近( 小于10nm) , 而且一个基团发出的荧光光谱与另一个基团的吸收光谱相互重叠时, 它们之间会发生能量转移现象, 即一个基团发出的荧光被另一个基团吸收, 另一个基团发出了荧光。

五、 放射自显影术
放射自显影术( radioautography; autoradiography) 是利用放射性同位素的电离射线对乳胶(含AgBr或AgCl)的感光作用, 对细胞内生物大分子( DNA、 RNA、 蛋白质、 多糖等) 进行定性、 定位和半定量分析的一种技术。
可用于研究生物大分子在机体、 组织和细胞中的分布、 合成动态和作用机理等等。

第四节 模式生物与功能基因组的研究

模式生物一般具有个体小、 容易培养、 操作简单、 生长繁殖快的特点。
没有什么直接的经济价值。
模式植物少。