细胞凋亡的检测方法样本.doc

资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。细胞凋亡的检测方法细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式, 根据死亡细胞在形态学、 生物化学和分子生物学上的差别, 能够将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多, 下面介绍几种常见的测定方法。1、 细胞凋亡的形态学检测: 根据凋亡细胞固有的形态学特征, 人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。a、 光学显微镜和倒置显微镜观察: 未染色凋亡细胞体积变小、 变形, 细胞膜完整但出现发泡现象, 细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、 变圆、 脱落; 染色凋亡细胞常见姬姆萨染色、 瑞氏染色、 苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、 边缘化, 核膜裂解、 染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。b、 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜: 一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况, 常见的DNA特异性染料有: 有HO 33342( Hoechst33342) ,HO 33258(Hoechst33258),DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的, 主要结合在DNA的A-T碱基区。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料, 储存用蒸馏水配成1mg/ml的浓度, 使用时用PBS稀释成终浓度一般为2-5ug/ml。DAPI为半通透性, 用常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水溶解为浓度1mg/ml, 使用终浓度一般为0.5-1ug/ml。结果评判: 细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期: 期的细胞核呈波纹状( rippled) 或呈折缝样( creased) ,部分染色质出现浓缩状态; a期细胞核的染色质高度凝聚、 边缘化; b期细胞核裂解为碎块, 产生凋亡小体。c、 透射电子显微镜观察。结果评判: 凋亡细胞体积变小, 细胞质浓缩。凋亡期的细胞核内染色质高度盘绕, 出现许多称为气穴现象( cavitations) 的空泡结构。细胞凋亡的晚期, 细胞核裂解为碎块, 产生凋亡小体。2、 磷脂酰丝氨酸外翻分析: 磷脂酰丝氨酸( Phosphatidyllserine,PS) 正常位于细胞膜的内侧, 但在凋亡早期, PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面, 暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白, 能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素( FITC、 PE) 或biotin标记, 以标记了的Annexin-V作为荧光探针, 利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶( propidine iodide,PI) 是一种核酸染料, 它不能透过完整的细胞膜, 但在凋亡中晚期的细胞和死细胞, PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用, 就能够将凋亡早晚期的及死细胞区分开来。方法: a、 悬浮细胞的染色: 、 将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞( 0.5106) 用PBS洗2次, 加入200lBinding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10l及PI(50ug/ml)5l,室温避光30min,加入400lPBS, 立即用FACScan进行流式细胞术定量检测( 一般不超过1小时) , 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。、 贴壁培养的细胞染色: 先用0.25%的胰酶消化, 洗涤、 染色和分析同悬浮细胞。、 爬片细胞染色: 同上, 最后用荧光显微镜和共聚焦激光显微镜进行观察。结果及注意事项: 整个操作动作要尽量轻柔, 勿用力吹打细胞; 操作时注意避光, 反应完毕后尽快在一个小时内检测; 3、 线粒体膜势能( mt) 的检测: 多种细胞凋亡诱导不同的细胞凋亡时, 皆发生线粒体跨膜电位mt的下降, 而且发现mt下降是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件, 在细胞核出现凋亡特征( 染色质浓缩、 DNA断裂) 之前, 还发现一量线粒体mt崩溃, 则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在, 使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、 3,3-Dihexyloxacarbocyanine odideDiOC6(3)echloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、 Tetramethyl rhodamine methylester(TMRM)等可结合到线粒体基质, 其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。方法: 将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123(1M)终浓度为DiOC6(25M),JC-1(1M),TMRM(100M),37平衡30min,流式细胞计检测细胞的荧光强度。结果及注意事项: 始终保持平衡染液中PH值的一致性, 因为PH值的变化将影响膜电位。与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白, 她们将与部分染料结合, 降低染料的浓度, 引起假去极化。4、 DNA片断化检测: 细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50-300kbp长的DNA大片断或180-200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱( DNA ladder) 。细胞经处理后, 采用常规方法分离提纯DNA后, 进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色, 在凋亡细胞群中则可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少, 还可在分离提纯DNA后, 用32P-ATP和脱氧核糖核酸末端转移酶( TdT) 使DNA标记, 然后进行电泳和放射自显影, 观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。a、 大分子染色体DNA片段的测定: 细胞凋亡的早期, 染色体断裂成为50-300kbp长的DNA大片段, 所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时, 即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量大小来筛分DNA, DNA像经过弯管一样, 以其一凋指向电声一极而经过凝胶, 这种迁移模式称之为”爬行”。因此, 细胞凋亡早期产生的50-300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。一般彩脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后, 大的DNA分子便滞流在爬行管中, 直至新的电场轴向重新定向后, 才能继续向前移动。DNA分子量越大, 这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小电脉冲周期时, DNA就能够按其分子量大小分开。b、 DNA ladder测定: 方法:收获细胞(1107)沉淀细胞裂解液13000rpm,5min,收集上清1%SDS和RnaseA(5mg/ml)56,2h蛋白酶K(2.5mg/ml)37,2h1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA,4C过夜14000rpm,15min最后将沉淀溶解在TE buffer中,加DNA loading Buffer1.2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色并照相。C、 凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析: 方法: 收集细胞70%冷乙醇( in PBS) 4固定过夜PBS洗涤, 1000rpm,10minRnase A(0.5ug/ml)37消化30minPI(50ug/ml)染色, 室温避光15minFACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。D、 ApoalertTM LM-PCR Ladder检测: 参考COLNTECH提供的方法。5、 TUNEL法: 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端, 可在脱氧核糖核苷酸和荧光素、 过氧化物酶、 碱性磷酸酶或生物素形成和衍生物标记到DNA的3-末端, 从而进行凋亡细胞的检测。这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法( terminal deoxynucleotidyltransferase mediated nick end labeling,TUNEL) 。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂, 因而没有3-OH形成, 很少能够被染色。TUNEL法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法, 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色, 能准确反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征, 可用于石蜡包埋组织切片、 冰冻组织切片、 培养的细胞和从组织中分离的细胞的形态测定, 并可检测出极少量的凋亡细胞, 因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。6、 Caspase-3活性的检测: Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用, 其中Caspase-3为关键的执行分子, 它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原( 32KD) 的形式存在于胞浆中, 在凋亡的早期阶段, 它被激活, 活化形式的Caspase-3由两个大亚基( 17KD) 和两个小亚基( 12KD) 组成, 裂解相应的胞浆胞核底物。在细胞凋亡的晚期和死亡细胞, Caspase-3的活性明显下降。a、 Western blot 分析测定: Caspase-3的大小亚基及对底物多聚( ADP-核糖) 聚合酶poly(ADP-ribose) polymerase,PARP等的裂解。b、 荧光分光光度计分析: 方法: 收获细胞正常或凋亡细胞PBS洗涤抽提细胞裂解液加Ac-DEVD-AMC(Caspase-3四肽荧光底物)37反应1h荧光分光光度计( polarstar) 分析荧光强度( 激发光波长380nm, 发射光波长为430-460nm) 。c、 流式细胞术分析: 方法: 收获正常培养或凋亡细胞PBS洗涤加Ac-DEVD-AMC37反应1hUV流式细胞计分析Casspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。 检测细胞凋亡的实验方法比较 TUNEL 与 ELISA 检测凋亡的方法比较TUNEL法 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端, 可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶( TdT) 的作用下, 将脱氧核糖核苷酸和荧光素、 过氧化物酶、 碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端, 从而可进行凋亡细胞的检测, 这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法( terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL) 。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂, 因而没有3-OH形成, 很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法, 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色, 能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征, 可用于石蜡包埋组织切片、 冰冻组织切片、 培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定, 并可检测出极少量的凋亡细胞, 因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.ELISA法测细胞凋亡细胞凋亡时, Ca2+,Mg2+离子依赖的内源性核酸内切酶将双链DNA从各核小体间连接区裂断, 产生单或寡合苷酸小体, 各核小体的DNA与核组蛋白H2A,H2B,H3,H4形成紧密的复合物而对内源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解。主要使用单克隆抗DNA抗体和抗组蛋白抗体直接检测DNA和组蛋白。 几种检测凋亡的方法一、 形态学观察方法1、 HE染色、 光镜观察: 凋亡细胞呈圆形, 胞核深染, 胞质浓缩, 染色质成团块状, 细胞表面有”出芽”现象。2、 丫啶橙( AO)染色, 荧光显微镜观察: 活细胞核呈黄绿色荧光, 胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧, 可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。3、 台盼蓝染色: 如果细胞膜不完整、 破裂, 台盼蓝染料进入细胞, 细胞变蓝, 即为坏死。如果细胞膜完整, 细胞不为台盼蓝染色, 则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性, 区别坏死细胞有一定的帮助。4、 透射电镜观察: 可见凋亡细胞表面微绒毛消失, 核染色质固缩、 边集, 常呈新月形, 核膜皱褶, 胞质紧实, 细胞器集中, 胞膜起泡或出”芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。二、 DNA凝胶电泳( 一) 、 检测原理细胞发生凋亡或坏死, 其细胞DNA均发生断裂, 细胞内小分子量DNA片断增加, 高分子DNA减少, 胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间, 出现180200bpDNA片断, 而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断, 利用此特征能够确定群体细胞的死亡, 并可与坏死细胞区别。( 二) 结果判断正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状( LADDER)条带; 坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。三、 酶联免疫吸附法( ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成, 可由ELISA法检测。( 一) 检测步骤1、 将凋亡细胞裂解后高速离心, 其上清液中含有核小体; 2、 在微定量板上吸附组蛋白体3、 加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合4、 加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合4、 加酶的底物, 测光吸收制。( 二) 用途该法敏感性高, 可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、 大鼠、 小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器, 适合基层工作, 可是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。四、 流式细胞仪定量分析( 一) 检测原理细胞发生凋亡时, 其细胞膜的通透性也增加, 可是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点, 被检测细胞悬液用荧光素染色, 利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、 坏死细胞核凋亡细胞。( 二) 应用价值流式细胞仪检测具有以下特点: 1)、 检测的细胞数量螅 虼似浞从橙禾逑赴 牡蛲鲎刺 冉献既?BR2)、 能够做许多相关性分析3)、 结合被检测细胞的DNA含量的分析, 可确定凋亡的细胞所处的细胞周期检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法细胞发生凋亡时, 其细胞膜的通透性液增加, 但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间, 利用这一特点, 被检测细胞悬液用荧光素染色, 利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、 坏死细胞和凋亡细胞。利用Hoechs-PI染色法, 正常细胞对染料有抗拒性, 荧光染色很浅, 凋亡细胞主要摄取Hoecha染料, 呈现强蓝色荧光, 而坏死细胞主要摄取碘化丙啶( PI)而呈强的红色荧光。DNA片断原位标记法凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞( 或组织) 结构保持不变的情况下, 用荧光素、 地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸( deoxyuridinetriphate, DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3的羟基( OH) 端结合, 经显色反应后检测DNA裂解点的技术。DNA片段原位标记法有二种: 1、 原位缺口转移( in situ nick-translation,ISNT)技术, 它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3OH端2、 原位缺口末端标记技术( in situ end labelling technique,ISEL), 即TUNEL法, 它是利用TdT将标记的DUPT接到3-OH端。研究证明, TUNEL法的敏感性远高于ISNT, 特别对早期凋亡的检测, TUNEL更为合适。检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法1、 原理: 在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸( PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V( Annexin V) 是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白, 它于PS具有高度的结合力。因此, Annexin V能够作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V, 将Annexin V标记上荧光素( 如异硫氰酸荧光素FITC) , 同时结合使用PI拒染法( 因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测, 且对PI高染) 进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。2、 结果判断: 正常活细胞Annexin V 、 PI均低染; 凋亡细胞Annexin V高染、 PI低染; 坏死细胞Annexin V/PI均高染。3、 应用价值: 细胞发生凋亡时, 膜上的PS外露早于DNA断裂发生, 因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V联合PI染色不需固定细胞, 可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此, Annexin V联合PI法更加省时, 结果更为可靠, 是当前最为理想的检测细胞凋亡的方法。 几点参考1.大部分凋亡细胞可能并不见得有非常典型的凋亡表型, 如电镜的染色体边集、 凋亡小体等, DNA电泳也不见得都有DNA ladder, 但对某些指标来说还算稳定, 如PI染色及TUNEL法, 因此如果某个方法效果不好, 能够换用其它方法检测2.坏死与凋亡的区分传统上认为是无序与有序的过程, 楼上所说的线粒体肿大也是以前的一个传统认识, 但现在有很多人认为坏死的发生也是有序发生的, 因此也有了程序化坏死一说, 在很大程度上, 由于凋亡是时间依赖性的过程, 细胞发生凋亡也并非同步化的, 凋亡的晚期与坏死进行区分是困难的, 而且我认为如果不是对于凋亡或是坏死本身通路进行研究的话, 强行区分是没有意义的细胞凋亡检测技术与方法 细胞凋亡( Apoptosis) , 又称细胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death), 是指细胞在一定的生理或病理条件下, 遵循自身的程序, 自己结束其生命的过程。它是一个主动的, 高度有序的, 基因控制的, 一系列酶参与的过程。细胞凋亡概念提出至今还不到30年的时间, 但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色, 对个体的正常发育及细胞凋亡紊乱在病理学研究中的重要作用, 引起了人们对其机制和组分的广泛而深入地研究, 成为当前生命科学界最为热门话题之一, 也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。从近年的SCI排名中我们能够看到, 信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组方面的, 而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究。随着这方面研究的持续升温, 涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测, 其中不少已经有商品化的产品出现, 大大加速了研究的进程。具体来说, 针对凋亡的不同阶段有以下一些方法( 概括如图1) : 1 早期检测: 1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测: PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生, 可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV, 一个钙依赖性的磷脂结合蛋白, 能专一性的结合暴露在膜外侧的PS, 再经过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测( 悬浮细胞和贴壁细胞都适用) , 可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。 美国著名生物试剂公司CLONTECH和INTERGEN公司分别开发了多种标记的Annexin V产品, 简便快速, 10分钟就可完成检测。其中带荧光标记的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC, 灵敏度高, 可作为FACS( 流式细胞分选) 方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白Annexin V-EGFP, EGFP与PS 的结合比例为1: 1, 还可进行定量检测。除此之外, 还提供生物素偶联的Annexin V, 可经过常见的酶联显色反应来检测。另外, MACS公司将磁珠包被Annexin V, 可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。 2) 细胞内氧化还原状态改变的检测: 这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势, 研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit经过荧光染料monochlorobimane(MC 体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化。 正常状态下,谷光苷肽(glutathione: GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物经过被GSH还原而定期去除, 氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要, 许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。在Jurcat和一些其它类型的细胞中, 细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时, 细胞液就由还原环境转为氧化环境, 这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低, 从而使细胞色素C( 三羧酸循环中的重要组分) 从线粒体内转移到细胞液中, 启动凋亡效应器caspase的级联反应。 由于 GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关, 此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外, 还可用于心脏病、 中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如: HeLa 和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化, 不能用此法检测。 3) 细胞色素C的定位检测 细胞色素C作为一种信号物质, 在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下, 它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中, 凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液, 结合Apaf-1 ( apoptotic protease activating factor-1) 后启动caspase级联反应: 细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9, 后者再激活caspase-3和其它下游caspase。 细胞色素C氧化酶亚单位( cytochrome c oxidase subunit : COX4) 是定位在线粒体内膜上的膜蛋白, 凋亡发生时, 它保留在线粒体内, 因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。 ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超离心, 可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分, 再进一步经过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置, 从而判断凋亡的发生。 4) 线粒体膜电位变化的检测: 在凋亡研究的早期, 从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入, 发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分, 发生很多生理生化变化。例如, 在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化, 导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM, 一个阳离子性的染色剂, 对此改变非常敏感, 呈现出不同的荧光染色。正常细胞中, 它在线粒体中形成聚集体, 发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中, 因线粒体穿膜电位的改变, 它以单体形式存在于细胞液中, 发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变化。可是, 这种方法不能区分细胞凋亡或其它原因导致的线粒体膜电位的变化。 2 晚期检测: 细胞凋亡晚期中, 核酸内切酶( 某些Caspase的底物) 在核小体之间剪切核DNA, 产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。对于这一现象的检测一般有以下两种方法: 1) TUNEL( Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling) 经过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP ( 多为dUTP) 间接( 经过地高辛) 或直接接到DNA片段的3-OH端, 再经过酶联显色或荧光检测定量分析结果。美国Intergen公司提供多种标记方法, 直接荧光标记, 地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色, 可做细胞悬液、 福尔马林固定或石蜡处理的组织、 细胞培养物等多种样本的检测。其中, 直接标记步骤少, 操作简便。而间接标记有信号放大的作用, 检测灵敏度高。 2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少( 如活体组织切片) 时, 直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。CLONTECH公司的ApoAlertLM-PCR Ladder Assay Kit经过LM-PCR( ligation-mediated PCR) ,连上特异性接头, 专一性地扩增核小体的梯度片段, 从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。另外, LM-PCR 检测是半定量的, 因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。 上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征, 但细胞受到其它损伤( 如机械损伤, 紫外线等) 也会产生这一现象, 因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。 3) Telemerase Detection (端粒酶检测) 这是相对来说推出较早, 用得较多的一种方法。端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白, 它能够自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列, 使细胞获得”永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的, 每分裂一次, 染色体的端粒会缩短, 这可能作为有丝分裂的一种时钟, 表明细胞年龄、 复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现, 90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物, 分别与底物及端粒重复序列配正确引物。如果待测样本中含有端粒酶活性, 就能在底物上接上不同个数的6碱基( GGTTAG) 端粒重复序列, 通 过PCR反应, 产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的DNA Ladder现象( 参见图4) 。另外, Intergen公司还提供用酶联免疫法( ELISA) 检测的试剂盒. 同样, 这种检测方法也不专对细胞凋亡, 检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生。 3mRNA水平的检测 研究者们发现了很多在细胞凋亡时表示异常的基因, 检测这些特异基因的表示水平也成为检测细胞凋亡的一种常见方法。据报道, Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞( cytotoxic T cells) 等靶细胞。Bcl-2 和bcl-X (长的) 作为抗凋亡( bcl-2 和bcl-X) 的调节物, 它们的表示水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。一般多采用Northern杂交和RT-PCR走胶对它们进行检测。随着近年来荧光定量PCR技术的发展, 用定量PCR技术来检测基因表示水平无疑比之前者更快更准确。Intergen公司的Amplifluor Apoptosis Gene Systems就根据这一新技术原理, 经过检测fas, bax-alpha 和 bcl-X (长的) 基因的 mRNA表示水平来进行细胞凋亡的检测。 以上介绍了针对凋亡不同阶段特征的检测方法, 随着凋亡机制研究的深入, 近年来还发展了许多针对特定的凋亡途径的检测, 如抗体法, 酶活性测定等等, Cell Signeling technology公司, DAKO公司, Santa-Cruz公司, Calbiochem & Oncogene公司都紧跟科研潮流, 开发了大量的抗体及活性测定产品。随着对细胞凋亡的研究和认识的不断深入, 对包括肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本的细胞凋亡的检测已成为一种迫切需要。当前, 多种方法已得到较广泛的应用。然而如何选择适当的方法并对检测的结果作出正确的判断及愉如其分的解释仍是值得探讨的问题。本文简要评述几种常见的细胞凋亡检测方法。一、 细胞凋亡的形态学观察细胞凋亡( apoptosis) 的命名主要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落般的形态学特征。当前对细胞凋亡的认识正不断得到深化, 检测凋亡细胞的方法也逐渐增多, 但形态改变仍是确定细胞凋亡的最可靠的方法。光学显微镜观察凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染, 形成致密质块, 有时可碎裂。在HE染色的组织切片中细胞体积缩小, 胞质致密、 嗜酸性染色增强, 并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在, 凋亡细胞与周围细胞分离, 不引起炎症反应。本方法简便易行, 但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难, 常缺乏较为特征的指标, 具有较强的主观性, 重复性差。本方法可用于调亡现象的初步观察, 作为分析指标之一。检测方法: 细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色, 在高倍物镜下观察凋亡细胞的形态改变, 结合显微测量工具可作凋亡细胞计数。视频时差显微技术( video time-lapse microscopy) 本方法用于细胞培养, 经过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程, 特别是观察细胞表和外形的变化。凋胞与基质分离, 胞体变圆、 收缩、 出泡, 有的细胞拉长, 出现钉状突起, 特续数小时后细胞膜破裂, 细胞溶解, 经过连续观察, 本方法可养壑培养中的凋亡细胞, 但不能用于病理组织。检测方法: 收集2105细胞/ml培胞, 置于多孔培养板, 加入凋亡诱导剂, 在带有自动摄像装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变, 每隔分钟30秒作序列摄影, 连续24小时。如同进进行荧光染色, 可参荧光晃微镜下观察和摄影。电子显微镜观察关于凋亡细胞的超微结构特征, 包括透射电镜和扫描电镜下的改变, 在许我文献中已有详尽描述。凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩, 染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜, 核的碎裂和凋亡小体形成等, 在透射电镜下得到最佳的体现。为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。本方法的缺点是样品制作过程较复杂, 且仪器、 设备的费用昂贵, 较难广泛大量开展。由于样品范围局限, 在凋亡细胞数较少时需进行大量的观察才能观察到典型的凋亡改变。还应指出的是, 在观察体外培养的凋亡细胞时, 常可见到各阶段的改变, 并可见到较多典型的凋亡细胞时, 常可见到各阶段的改变, 并可见到较多典型的凋亡小体很少见到, 出现较多的是凋亡初期胞体收缩、 染色质边聚和后期凋亡小体( 或整个凋亡细胞) 被吞噬和降解的现象。一些不典型的改变容易被忽略, 在观察时要特别予以注意。检测方法: 透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定, 丙酮脱水, 环氧树脂包埋, 超薄切片, 醋酸枸椽酸电子又重染色, 透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定, 乙醇逐级脱水, CO2临界点干燥, 真空喷金, 扫描电镜观察。流式细胞技术流式细胞仪检测凋亡细胞是经过检查其光射特征及荧光参数时行的。细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射, 分析散射光能够提供细胞大小及结构的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光两种, 前向散射光的强度与细胞大小、 体积相产, 右向角射光的强度与细胞结构的析射性、 颗粒性( granu-larity) 有关。细胞凋亡过程中出现的形态改变如细胞皱缩、 胞膜起泡、 核浓缩和碎裂等能够使光散射特性发生改变。早期凋亡细胞主要表现为前向散射光减弱而右向角散射光增强或不变, 前者反映了细胞的皱缩, 后者反映了细胞的核逐缩及碎裂。晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射光均减弱。由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标, 细胞的机械性损伤和细胞坏死也能够使前向散射光减弱。因此, 只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡细胞。细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解, 导致小分子DNA漏出, 核DNA含量下降, 细胞荧光染色后作流式细胞仪分析, 能够发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰( xub-G1峰, 即AP峰-apoptotic peak) ,代表凋亡细胞。根据此亚二倍体峰能够计算凋亡细胞的百分率。另外, 流式细胞术还能够经过测定线粒体膜的电位、 溶酶体质子泵的活性及细胞DNA/总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞。检测方法: 获取密度1106细胞/ml左右的细胞悬液, 精洗, 固定, 荧光染料染色, 上流式细胞仪分析。 TUNEL 与 ELISA 检测凋亡的方法比较TUNEL法 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端, 可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶( TdT) 的作用下, 将脱氧核糖核苷酸和荧光素、 过氧化物酶、 碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端, 从而可进行凋亡细胞的检测, 这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法( terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL) 。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂, 因而没有3-OH形成, 很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法, 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色, 能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征, 可用于石蜡包埋组织切片、 冰冻组织切片、 培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定, 并可检测出极少量的凋亡细胞, 因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.ELISA法测细胞凋亡细胞凋亡时, Ca2+,Mg2+离子依赖的内源性核酸内切酶将双链DNA从各核小体间连接区裂断, 产生单或寡合苷酸小体, 各核小体的DNA与核组蛋白H2A,H2B,H3,H4形成紧密的复合物而对内源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解。主要使用单克隆抗DNA抗体和抗组蛋白抗体直接检测DNA和组蛋白。 几种检测凋亡的方法一、 形态学观察方法1、 HE染色、 光镜观察: 凋亡细胞呈圆形, 胞核深染, 胞质浓缩, 染色质成团块状, 细胞表面有”出芽”现象。2、 丫啶橙( AO)染色, 荧光显微镜观察: 活细胞核呈黄绿色荧光, 胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧, 可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。3、 台盼蓝染色: 如果细胞膜不完整、 破裂, 台盼蓝染料进入细胞, 细胞变蓝, 即为坏死。如果细胞膜完整, 细胞不为台盼蓝染色, 则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性, 区别坏死细胞有一定的帮助。4、 透射电镜观察: 可见凋亡细胞表面微绒毛消失, 核染色质固缩、 边集, 常呈新月形, 核膜皱褶, 胞质紧实, 细胞器集中, 胞膜起泡或出”芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。二、 DNA凝胶电泳( 一) 、 检测原理细胞发生凋亡或坏死, 其细胞DNA均发生断裂, 细胞内小分子量DNA片断增加, 高分子DNA减少, 胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间, 出现180200bpDNA片断, 而坏死细胞的DNA断裂点