HPLC法测定饮料中色素柠檬黄、日落黄前处理方法的比较.pdf

作者简介?蔡增轩(1974-),男,博士,副研究员,主要从事理化检验研究。?化学测定方法?HPLC法测定饮料中色素柠檬黄、日落黄前处理方法的比较蔡增轩,黄百芬,王天娇,冯靓,任一平(浙江省疾病预防控制中心,杭州?310051)摘要?目的:对 HPLC法测定饮料中人工合成色素柠檬黄、日落黄时两种前处理方法进行比较。方法:分别以稀释和聚酰胺吸附处理样品,经色谱分离后对计算结果进行统计处理,对结果进行 F 检验和 t检验。结果:经对两种前处理方法的结果进行 F检验,F计 F表。经对回收率校正后的结果进行 t检验,t计 t表。结论:两种前处理方法的精密度和平均值无显著性差异。关键词?高效液相色谱;色素;前处理中图分类号?O657.7+2?文献标识码?A?文章编号?1004-8685(2011)01-0069-03Comparison of preparativemethod during determination of tartrazine and sunset yellowwater-solubility colour by HPLC in drinksCAI Zeng-xuan,H UANG Bai-fen,WANG T ian-jiao,FENG Liang,REN Yi-ping(Zhejiang Centre for Disease Control and Prevention,H angzhou 310051,China)Abstract?Objective:Co mparison of two preparativemethod during deter m ination of tartrazine and sunset yellow water-solu?bility colour by HPLC in drinks.M ethods:Preparation sa mples with two method respectively,and test the resultw ith F-testand t-test after separationw ithHPLC.Rsesults:F-testwere perfor med on the results of twomethods,Fc Ft.t-testwereperfor med on the result after adjust mentw ith recovery,tc tt.Conclusion:Therewere no significant difference between t wo pre?parative methods.Keywords?HPLC;Colore;Preparation?食品饮料中人工合成色素是重要的监测指标,我国卫生标准中对食品中人工合成色素的允许量有明确的规定。GB/T5009.35-2003推荐了食品中色素的测定方法,分别为高效液相色谱法、薄层色谱法、示波极谱法。由于高效液相色谱法具有灵敏度高、分离能力好、速度快等优点,并且高效液相色谱仪器已经在基层实验室得到普及,现已经被广泛采用。在GB/T 5009.35-2003中,食品饮料样品的前处理采用经典的聚酰胺吸附法,但操作较为繁琐。SN/T 2105-2008 和 SN/T1743-2006对液体样品采用直接稀释法处理。本文对两种方法予以比较,认为两种方法的检测结果无显著性差异,具有一致性。1?材料与方法1.1?仪器A lliance 2695高效液相色谱仪(W aters公司),2996二极管阵列检测器(W aters公司),循环水式真空泵(SHZ-D(III)型,予华仪器公司),旋转蒸发仪(RE-52AA,上海亚荣),pH计(雷磁 PHSJ-4A型,上海精科),高速离心机(microfuge 18型,Beckman Coulter公司)。1.2?试剂与材料1.2.1?标准储备溶液?柠檬黄:中国计量科学研究院,批号:07003,浓度:0.50mg/m,l 不确定度为 1%,有效期至 2010年 8月,等级标准号为 GBW(E)100001a。日落 黄:中 国 计 量 科 学 研 究 院,批 号:08001,浓 度:0.50mg/m,l不确定度为 1%,有效期至 2011年 3月,等级标准号为 GB W(E)100003a。1.2.2?试剂?甲醇(色谱纯,M erck公司),乙酸铵、柠檬酸、甲酸、无水乙醇、氨水为分析纯,实验用水均为超纯水,电阻率为18.2M?c m(M illipore公司超纯水器制备)。1.2.3?材料?聚 酰胺粉(柱层析 用,200目),微 孔滤膜(0.45?m,水系)。1.2.4?标准溶液的配置?准确吸取标准储备溶液 2.0 m l到10.0m l容量瓶中,用水稀释至刻度,配制成标准工作溶液,浓度为系列溶液 100.0?g/m,l浓度为 10.0?g/m l、25.0?g/m l、50.0?g/ml、75.0?g/m l、100.0?g/ml。1.3?色谱条件色谱柱:SymmetryShieldRP18色谱柱(250mm?4.6mm.id.,5?m),柱温:40?,检测波长:254 nm,进样体积:10.0?;l流动相 A为含 20mM 醋酸铵的水溶液,流动相 B为甲醇,流速69中国卫生检验杂志 2011年 1月 第 21卷 第 1期?Chinese Journal ofHea lth Laboratory Technology,Jan 2011;Vol 21?No 1为 1.0m l/min。线性流动相梯度洗脱条件:0 5 m ins,B:15%20%,5 10 mins,B:20%98%;10 12.5 mins,B:98%98%;12.5 13 m ins,B:98%15%;13 20 m ins,B:15%15%。标准样品谱图如图 1所示。图 1?标准样品色谱图(50?g/m l)1.4?样品处理1.4.1?稀释法(方法一)?准确称取样品 5 g于 10m l容量瓶中,以水定容至刻度,混匀后置于塑料离心试管中,12000 RP M离心 3 mins,取上清液过微孔滤膜后进样分析。样品色谱图见图 2。图 2?直接稀释法处理样品色谱图1.4.2?聚酰胺吸附法(方法二)?取试样溶液 10 m l于试管中,加热至 60?,将 1 g聚酰胺粉加少许水调成糊状,倒入试样溶液中,搅拌片刻,以 G3垂熔漏斗抽滤,用 60?的水洗涤 5次,然后用甲醇-甲酸混合溶液洗涤 5次,每次 5m,l再用水洗涤至中性,用乙醇-氨水混合溶液解吸 5次,每次 5m,l收集解吸液,加乙酸中和,蒸发至近干,加水溶解,定容至 5 m,l 经滤膜过滤后进样分析。样品色谱图见图 3。图 3?聚酰胺吸附法处理样品色谱图2?结果与讨论2.1?精密度以上述两种前处理方法,对两个不同浓度的饮料样品分别平行处理 5份样品,考察两种前处理方法的精密度。结果见下表 1。两个不同浓度、不同处理方法的相对标准偏差在0.56%2.23%之间,由表中数据可知,经稀释法处理的两个样品的相对标准偏差均小于聚酰胺吸附法处理的,原因在于稀释法处理简单,与聚酰胺法相比,少了很多中间吸附、淋洗、解吸、蒸干、溶解、定容的操作,减少了操作误差的产生,因此样品的平行性较好。表 1?两种方法的精密度比较方法 1(稀释)柠檬黄(mgkg)日落黄(mg/kg)方法 2(吸附)柠檬黄(mg/kg)日落黄(mg/kg)样品 1116.0592.27111.1585.97117.0293.89108.6283.32117.3394.22109.3282.11115.7991.70110.9586.44116.7493.03110.9285.74?RSD(%)0.561.141.042.23样品 224.88144.9824.42144.7525.24147.0824.21142.6225.17148.4824.28142.5825.38149.2124.66147.3625.29150.1124.59147.36?RSD(%)0.771.360.791.642.2?样品回收率在做平行样品的同时,另取一份样品,向其中加入标准样品做加标试验,处理方法与平行样品相同,添加量见表 2。以平行样品结果的平均值作为样品中色素的原含量。两种方法、不同浓度的回收率在 95.42%105.24%之间。经回收率校正后,分别利用两种方法对两个样品的检测结果具有一致性。表 2?两种方法的回收率比较方法 1(稀释)柠檬黄(mg/kg)日落黄(mg/kg)方法 2(吸附)柠檬黄(mg/kg)日落黄(mg/kg)样品 1 原含量116.5893.02110.1984.72加入量100.00100.00100.00100.00加入后220.13195.60208.76180.14回收率(%)103.55102.5998.5695.42回收率校正112.5990.69111.8088.78样品 2 原含量25.19147.9724.43144.93加入量20.00100.0020.00100.00加入后46.24252.8045.04247.42回收率(%)105.24104.82103.01102.49回收率校正23.94141.1723.72141.412.3?实验结果显著性检验70中国卫生检验杂志 2011年 1月 第 21卷 第 1期?Chinese Journal ofHealth Laboratory Technology,Jan 2011;V ol 21?No 1表 3?两种方法结果的显著性检查平均值方法 1方法 2标准差方法 1方法 2合并标准差tF计算结果样品 1柠檬黄116.58110.190.651.150.9310.843.12日落黄93.0284.721.061.891.538.563.17样品 2柠檬黄25.1924.430.190.190.196.191.01日落黄147.97144.932.012.382.202.181.41回收率校正 样品 1柠檬黄112.59111.800.651.150.931.343.12日落黄90.6988.781.061.891.531.963.17样品 2柠檬黄23.9423.720.190.190.191.791.01日落黄141.17141.412.012.382.200.171.41?对两种前处理方法的精密度进行 F 检验,查 F 值表知F0.05,(4,4)=6.39,对两个不同浓度的两种色素,均为 F计 t表;样品 2的日落黄虽然 t计 t表,也已经与 t表相接近。但经回收率校正后,两个不同浓度的两种色素,均为 t计 t表,说明经过回收率校正,两组的测定结果之间的差异无显著性,表明两组测定值的差异在统计允许的误差范围之内,可以认为两种前处理方法的测定结果具有一致性。3?结论?本文对两个不同色素含量的果汁饮料样品,以两种不同的前处理方法测定其中的柠檬黄和日落黄的含量,并对方法进行比较。经 F检验,直接稀释法和聚酰胺吸附法的精密度无显著性差异;经 t检验,两种前处理方法之间存在显著性差异,但经回收率校正处理后,两种前处理方法的测定结果无显著性差异。直接稀释法具有操作简单,精密度好的优点,但在谱图中有明显的杂质峰出现,需注意色谱分离条件,把色素峰与杂质峰分离开,在本文色谱条件下,杂质峰能与色素峰完全分离,不影响测定。聚酰胺吸附法操作过程繁琐,但处理完的样品比较干净,色谱图中几乎没有杂质峰出现,在处理复杂基质的样品时具有优越性。参考文献 1 GB/T 5009.35-2003.食品中合成着色剂的测定 S.2 SN/T 2105-2008.化妆品中柠檬黄和桔黄等水溶性色素的测定方法 S.3 SN/T 1743-2006.食品中诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测 高效液相色谱法 S.4 胡曼玲.卫生化学 M.第 5版.北京:人民卫生出版社,2003:8.(收稿日期:2010-10-09)(上接第 68页)基磺酸钠 10mg。准确吸取 1.00m l环己基氨基磺酸钠标准溶液于 100 m l带塞比色管中,加水 20 ml。置冰浴中,加入 5 m l50 g/L亚硝酸钠溶液,5m l100 g/L硫酸溶液,摇匀,在冰浴中放置 30m in,并经常摇动,然后准确加入 10 m l正己烷,5 g氯化钠,摇匀后置旋涡混合器上振动 1m in,待静止分层后吸出己烷层于 10m l带塞离心管中进行离心分离,每毫升己烷提取液相当 1 mg环己基氨基磺酸钠,将标准提取液进样 1?l 5?l于气相色谱仪中,根据响应值绘制标准曲线。1.2.3?试样处理?称取 2.0 g已粉碎的试样于研钵中,加少许层析硅胶研磨至呈干粉状,经漏斗到入 100m l容量瓶中,加水冲洗研钵,并将洗液一并转移至容量瓶中。加水至刻度,不时摇动,1 h后过滤,即得试样,准确吸取 20.00m l于 100m l带塞比色管,置冰浴中。1.2.4?测定?试样管按 1.2.2自?加入 5 ml 50 g/L亚硝酸钠溶液?起依法操作,然后将试料同样进样 1?l 5?,l测得响应值,从标准曲线图中查出相应含量。1.2.5?结果计算X=10m1*V1/(mV*V2)式中:X-试样中环己基氨基磺酸钠的含量,g/kg;m-试样质量,g;V-进样体积,单位为?;l10-正己烷加入量,m;lV1-处理液总体积,m;lV2-分体积,m;lm1-测定用试样中环己基氨基磺酸钠的质量,?g。2?结果与讨论2.1?色谱条件的选择按?食品中环己基氨基磺酸钠的测定?GB/T5009.97-2003的方法,采用填充柱,峰形不够尖锐,且易造成环己醇亚硝酸酯的峰架在正己烷的拖尾上,给积分定量造成一定误差。结合食品中甜蜜素测定方法的相关报道和个人的实际工作经验,采用TR-1型毛细管色谱柱代替填充柱,取得了较好的效果。2.2?校准曲线在最佳色谱条件下,结果在 1?g 5?g范围内呈良好的线性关系(r=0.9998),检出限为 4 ng。2.3?重复性和加标回收率对 14个品种的酱腌菜进行了环己基氨基磺酸钠的测定。检测结果在 0.028 g/kg至 0.76 g/kg之间。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的 10%,实际测定在 3.0%6.7%之间。加标回收率在 95.4%100.6%之间。?本方法简单、快速、准确、易于操作,适用于酱腌菜等食品中环己基氨基磺酸钠的测定。参考文献 1 GB/T5009.97-2003.食品中环己基氨基磺酸钠的测定 S.2 GB2760-2007.食品添加剂标准 S.(收稿日期:2010-10-09)71中国卫生检验杂志 2011年 1月 第 21卷 第 1期?Chinese Journal ofHea lth Laboratory Technology,Jan 2011;Vol 21?No 1