单核细胞增生李斯特氏菌检验.pdf

GB 4789.30-2016 Listeria monocytogenes 单核细胞增生李斯特氏菌检验 菩提 实验需在二级生物安全柜内进行。实验过程废弃物均由专用医疗废物袋收集，专人经高温121，高压0.1Mpa，灭菌30min后收集于危险废弃物箱内，妥善保存并尽快交专业危废处理公司处置。实验人员均配备安全服，无粉乳胶手套，口罩、眼罩，头套等实验用品。1 祸乱人间及降妖除魔的必要性 单核细胞增生李斯特氏菌 美国CDC每年报告单增李斯特氏菌感染约1600例，其中约260人死亡。2002年污染的火鸡导致9个州54例中8例死亡和3例流产。1998年21人因热狗中香肠污染死亡。1985年52人死于污染的软奶酪。美国的单增李斯特氏菌爆发事件 2011 United States listeriosis outbreak 2011年美国甜瓜李斯特氏菌爆发事件 2011年,美国甜瓜（cantaloupe,哈密瓜）发生单增李斯特菌疫情,导致波及全美的疾病爆发。最后共导致147人生病,33人死亡,1名孕妇流产,其中死亡的人很多是独居在家的老人。这是美国历史上最严重的一次食源性疾病爆发。食源性疫情应对小组(CORE)成立 the Coordinated Outbreak Response and Evaluation FDA应对疫情需临时抽调人员指派任务。2011年8月，FDA局长建议采用新的疫情应对方式。2011年8月，针对科罗拉多州Jensen 农场单增李斯特氏菌疫情，成立食源性疫情应对小组（CORE），成员包括流行病学专家、兽医、公共和环境卫生专家、消费者安全官员和政策分析专家。爆发事件调查 2011 United States listeriosis outbreak 一些患者能回忆起实用的甜瓜来自科罗拉多州Jensen Farms，检测发现甜瓜瓜与病例标本发现的单增李斯特氏菌分类株DNA指纹图谱相同。2011年10月18日美国FDA给该农场发出警告信。事件调查结果 the Coordinated Outbreak Response and Evaluation FDACORE A food Safety Network 2011-2012 在包装厂检测到李斯特氏菌大规模传播，显示该厂卫生措施做得很差（食源性报告随后做了总结）。1、在哈密瓜生长的地方，可能会出现低水平的单核增生李斯特氏菌，这可能会被引入到包装设施中。2、一辆拉运甜瓜的卡车停在比邻牛棚旁包装，可能将污染物引入设施。3、包装厂设计允许水靠近设备和员工通道的地板。4、包装厂的地板建设方式难以彻底清洁。5、包装设备不易清洗消毒；用于哈密瓜包装的洗涤和干燥设备是改装的，本身是为别的农产品设计的。6、哈密瓜冷藏前没有预冷却步骤。冷藏时随着香瓜的温度下降（2011.8月爆发），可能造成Listeria monocytogenes 生长繁殖。在这次调查中发现，单增不只是污染甜瓜表面，还深入甜瓜内部，污染整个甜瓜。美国FDA下属机构食源性疫情应对小组(CORE)2011-2012工作报告 Michael Taylor（食物及兽医副专员）Kathleen Gensheimer 首席医疗官 美国甜瓜李斯特氏菌爆发事件的来龙去脉来源于：食源性疫情应对小组 除李斯特菌疫情外，CORE小组还成功应对了寿司中冷冻金枪鱼、芽菜、冷冻牡蛎和土耳其松仁引发的疫情，以及宠物食品引发的疫情。小组成功应对了多起食源性疫情，大大提升了美国的食品安全状况。我国李斯特氏菌检出及中毒情况 2、中国食物中毒细菌（房海，陈翠珍主编 科学出版社，2014）书中记载 1、2001年11月，我国质检部门多次从美国、加拿大、法国、爱尔兰、比利时、丹麦等二十多家肉类加工厂进口的猪腰、猪肚、猪耳、小排等三十多批近千吨猪副产品中检出单增李斯特氏菌等致病菌。李斯特氏菌病原学意义 美国人食物单一，可以追溯一周以上食谱。中国人食系比较复杂，三天前吃了什么可能都想不起来，无法追溯致病来源，国内报道很少，没有一份完整的调查报告。在引起细菌性食源性中毒事件方面，目前国外多发生，我国虽已有有单核细胞增生李斯特氏菌引起的报告，但尚为罕见。通常不会发生大规模流行，人类李斯特氏菌病的发病对象主要是：新生儿，孕妇，免疫力低下者，以及老年人群。无毒放射性李斯特菌是一种有效的治疗转移性胰腺癌的方法 美国，阿尔伯特爱因斯坦医学院，微生物与免疫学系，Claudia Gravekamp 等人。将弱毒李斯特氏菌和元素铼（Re）结合，利用弱毒李斯特氏菌兼性厌氧与Re的放射性，治疗转移性胰腺癌。李斯特氏菌穿过小鼠小肠段肠道屏障的光学显微照片（只有细菌与肿瘤细胞相遇后，才会发出荧光）Listeriaat 积极的、可利用的一面 Gravekamp 博士在荷瘤小鼠尾静脉中注入一定数量的李氏菌后观察，数天之内其他部位的细菌就会被动物自身的免疫系统清除殆尽，而在肿瘤组织附近和内部却依然存在。图 A和B 所示：在原发性肿瘤中，Listeriaat在转移中增殖较少，而在正常组织中则较少；C图所示：共聚焦显微镜证实。弱毒李斯特氏菌（红色小点），细胞核（蓝色），细胞质(绿色、肌动蛋白染色)。图D所示：单增在肿瘤细胞内繁殖。培养1 h，添加庆大霉素，进一步培养，终止。不同时间测定李斯特菌量。三个独立实验的平均值。李斯特氏菌菌落总数CFU/每106个肿瘤细胞细胞。(E)共聚焦显微镜证实肿瘤细胞内存在弱毒李斯特氏菌。Spleen：胰腺，Metastasis：转移性胰腺癌，Tumor：肿瘤。2 的发现及其细菌分类学地位 单核细胞增生李斯特氏菌 李斯特氏菌（Listeria）的发现 Joseph Lister（1827.4.5-1912.2.10），照片摄于1912年。为纪念英国的生理学家，近代消毒手术之父约瑟夫.李斯特（1827-1912），1940年第三届国际微生物学大会由皮里提出（Pirie）命名为李斯特氏菌属。1926年，英国南非裔科学家Murray、Webb和Swann在病死的兔子和豚鼠体内首次发现李斯特氏菌。Bacterium monocytogens（单核细胞增生杆菌）Family科（Subfamily）Order目（Suborder）Genus属（复数genera）phylum门（复数phyla）Domain域；Kingdom界 Class纲（Subclass）Species种（Subspecies）Tribe族（Subtribe）科 目 属 门 域；界 纲 种 族 细菌分类系统 https:/ Listeria monocytogenes的细菌分类学地位 cellular organisms细胞有机体 Bacteria细菌界 Terrabacteria group Firmicutes厚壁菌门 Bacilli 芽孢杆菌纲 Bacillales 芽孢杆菌目 Listeriaceae 李斯特氏菌科 Listeria 李斯特氏菌属 Listeria monocytogenes 单核细胞增生李斯特氏菌种 分类 英文名称 拉丁语名称 域 Domain Domain 界 Kingdom Regnum 门 phylum（复数phyla）Dividion 纲 Class Classis 目 Order Ordo 科 Family Familia 族 tribe tribe 属 Genus（复数genera）Genus 种 Species Species 介绍一些微生物分类学专业词汇 Taxonomic rank分类排列分类排列 Suffix reference后缀 Subtribe*亚族-inae Tribe*族-eae Subfamily*亚科-oideae Family科-aceae Suborder亚目-ineae Order目-ales Subclass亚纲 Proposed suffix idea Class纲 Proposed suffix-ia Division or phylum*门-Domain or empire*域/界-（根据细菌法典第9条(1990年修订版)，在属和类之间的分类的名称是由在类型属的名称中加入适当的后缀而形成的。1997年，E.Stackebrandt等提出了表示类和子类的后缀。下表中提供了后缀。微生物分类学专业词汇 1 Listeria aquatica 水李斯特氏菌 2 Listeria booriae 布尔李斯特氏菌 Listeria denitrificans 反硝化李斯特氏菌（已转移）3 Listeria cornellensis 康奈尔李斯特氏菌 4 Listeria fleischmannii 弗氏李斯特氏菌（含2个亚种：科罗拉多亚种，弗氏亚种）4.1 Listeria fleischmannii subsp.coloradonensis 4.2 Listeria fleischmannii subsp.fleischmannii 5 Listeria floridensis 佛罗里达李斯特氏菌 6 Listeria grandensis Grand美国小县 Grand县，隶属于美国科罗拉多州 7 Listeria grayi 格氏李斯特氏菌 7 Listeria murrayi 默氏李斯特氏菌 8 Listeria innocua 英诺克李斯特氏菌（无害L）9 Listeria ivanovii 伊氏李斯特氏菌（绵羊L）（包含2个亚种：伊凡诺夫亚种，加伦敦亚种）9.1 Listeria ivanovii subsp.Ivanovii 9.2 Listeria ivanovii subsp.Londoniensis 10 Listeria marthii 莫氏李斯特氏菌 Rocourt法国巴斯德研究所细菌研究中心研究人员 11 Listeria monocytogenes 单增李斯特氏菌 12 Listeria newyorkensis 纽约李斯特氏菌 13 Listeria riparia 河岸李斯特氏菌 14 Listeria rocourtiae Rocour李斯特氏菌 15 Listeria seeligeri 斯氏李斯特氏菌（西尔L）16 Listeria weihenstephanensis（维森李斯特氏菌）17 Listeria welshimeri 威尔斯李斯特氏菌 18 Listeria costaricensis 哥斯达黎加李斯特氏菌 18个种个种 按照字母排序 李斯特氏菌属下面有18个种（本部分信息个人分析整理，暂时国内领先）李斯特氏菌属（Listeria）11 1926 Listeria monocytogenes 单核细胞增生李斯特氏菌(Murray et al.1926)Pirie 1940(Approved Lists 1980)7 1966 Listeria grayi 格氏李斯特氏菌 Errebo Larsen and Seeliger 1966(Approved Lists 1980)emend.Rocourt et al.1992.7 1971 Listeria murrayi 默氏李斯特氏菌（L.grayi同菌异名,以格氏李斯特氏菌为菌名。）Welshimer and Meredith 1971(Approved Lists 1980),species.8 1979 Listeria innocua 英诺克李斯特氏菌（无害李斯特氏菌）(ex Seeliger and Schoofs 1979)Seeliger 1983,sp.nov.,nom.rev.15 1983 Listeria seeligeri 斯氏李斯特氏菌（西尔李斯特氏菌）Rocourt and Grimont 1983 17 1983 Listeria welshimeri 威尔斯李斯特氏菌 Rocourt and Grimont 1983.9 1984 Listeria ivanovii 伊氏李斯特氏菌（伊万诺夫李斯特氏菌，绵羊李斯特氏菌）Seeliger et al.1984 1926年-2009年 按照发现年代排序（2-1）李斯特氏菌属 2009年现在 10 2010 L.marthii 莫氏李斯特氏菌 Graves等 14 2010 L.rocourtiae Rocourt，人名；法国巴斯德研究所细菌学研究中心 Alexandre Leclercq（亚历山大.勒克莱尔）等 16 2013 L.weihenstephanensis 维森李斯特氏菌（地名，德国最古老的啤酒厂产地）Lang Halter等 4 2013 L.Fleischmannii 弗氏李斯特氏菌（弗莱施曼李斯特氏菌）Bertsch等 6 2014 L.Grandensis Grand，美国小县 den Bakker等 13 L.riparia 河岸李斯特氏菌 5 L.Floridensis 佛罗里达李斯特氏菌 1 L.aquatica 水李斯特氏菌 3 L.cornellensis 康奈尔李斯特氏菌 2 2015 L.Booriae 布尔李斯特氏菌 Weller 等 12 L.newyorkensis 纽约李斯特氏菌 18 2018 Listeria costaricensis 哥斯达黎加李斯特氏菌 Kattia N ez-Montero et al.2018 注意：注意：中文名目前没有专业机构翻中文名目前没有专业机构翻译，以拉丁文为准。译，以拉丁文为准。按照发现年代 排序（2-2）二个种合并。Listeria grayi 和Listeria murrayi合并后，叫：Listeria gray Evi Lang Halter等人发现 慕尼黑工业大学/生物科学基础部/微生物生态学系 公元725年，修道院的僧侣们开始在这里结社，从768年起种植啤酒花。最早的啤酒酿造出现在1040年。这家啤酒坊在900年毁于战火。重建后又在1600年被拿破仑关闭，最终被巴伐利亚的一个皇室收购。现在的Weihenstephan是国有的酿酒公司，有现代化的厂房和由修道院改造成的餐厅。这里有世界上最先进的专业大学和酵母实验室。该啤酒坊酿造大约10款Lager和小麦啤酒，后者尤其著名。其中Hefe-Weissbier是一款非常出色的啤酒，有浓厚的香气，细致的气泡非常赏心悦目，除了扎实的麦香，引人注目的还有香蕉味，另外带有少许的柠檬与香草的气息，麦香的回甘非常强烈，气泡的辛辣感也属上乘，整体而言，非常清爽顺口。Listeria weihenstephanensis维森（或译唯森）李斯特氏菌 Weihenstephane（维森小镇）；最古老的啤酒产地 2009年后，那些发现新种的可敬可爱的科学家们！den Bakker 2014，L.grandensis,L.riparia,L.floridensis,L.aquatica,L.cornellensis Department of Food Science,Cornell University,Ithaca,NY 14853,USA康奈尔大学食品科学学院 Weller 2015，L.booriae，L.newyorkensis Department of Food Science,Cornell University,Ithaca NY 14853,USA David Bertsch 2013，L.Fleischmannii Laboratory of Food Biotechnology,Institute of Food,Nutrition and Health,ETH Zurich,8092 Zurich,Switzerland瑞士营养和健康研究所 Evi Lang Halter 2013，L.weihenstephanensis Lehrstuhl f r Mikrobielle kologie,Department f r Grundlagen der Biowissenschaften,WZW，Technische Universitat Munchen,Weihenstephaner Berg 3,D-85354 Munchen,Germany慕尼黑工业大学生物科学基础部微生物生态学系 Lewis M.Graves 2010,L.marthii Enteric Diseases Laboratory Branch and Bacterial Zoonoses Branch,Division of Foodborne,Bacterial,and Mycotic Diseases,National Center for Zoonotic,Vector-borne and Enteric Diseases,Coordinating Center for Infectious Disease,Centers for Disease Control and Prevention,Atlanta,GA 30333,USA美国佐治亚州亚特兰大疾病控制和预防中心传染病协调中心肠道疾病实验室分支和细菌人畜共患病分支食品，细菌和霉菌病分部，动物传染病，病媒传染和肠道疾病国家中心，美国（注：den Bakker也是发现者之一）Alexandre Leclercq亚历山大 勒克莱尔 2010，L.rocourtiae Institut Pasteur,Groupe Microorganismes et barrieres de lhote,WHO Collaborating Center for Foodborne Listeriosis and French National Reference Center for Listeria,Paris,France巴斯德研究所，Microorganismes et barrieres de lhote组，WHO合作中心食源性李氏杆菌病与李斯特氏菌法国国家参考中心，法国 Kattia N ez-Montero et al.2018，Listeria costaricensis 美国 致病性菌种介绍 人畜共患菌。李斯特氏菌属里面对人有害的只有单增李斯特菌一个种。土壤菌（腐生菌），食死亡的/正在腐烂的有机物。某些食物（主要是鲜奶产品）中的污染物。症状：败血症、脑膜炎和单核细胞增多。4的环境中仍可生长繁殖冷藏食品威胁。致病性动物（老鼠和其他动物）。1、降解磷、降解钾。2、活化土壤中硅、钙、镁中量元素作用。3、富集铁锰铜锌钼硼。4、提高或延长肥效，减少化肥用量（从123可知）。5、提高作物抗逆性，预防或减轻病害。Listeria monocytogenes 单增李斯特氏菌 Listeria ivanovii 伊氏李斯特氏菌 3 各水平上的特点 单核细胞增生李斯特氏菌 一、Listeria monocytogenes的形态学水平特点（染色、显微镜下、糖发酵管）1、G+，两端钝圆的规则的短小杆菌，单个、呈字排列、或成从排列；生理盐水菌悬液或肉汤培养物在显微镜下可见旋转或翻滚样运动；2、无芽胞、一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成夹膜；3、20 25培养时能形成4根周身鞭毛，有动力，穿刺培养（下图有真相）；36 培养时无鞭毛或1根鞭毛，动力弱或无。1天沿穿刺线生长；2-5天随之出现不规则的云雾状，扩展于培养基并可慢慢布满整个培养基，呈现一伞状的环，在表面往下3.05.0mm处呈最丰盛生长。25-30培养（左图25下培养）。二、Listeria monocytogenes的培养特点 1、需氧或兼性厌氧（最适在含有CO2的微需氧环境中生长），生长温度 2 42（有报道0能缓慢生长），最适温度 30 37，耐盐能力很强（所以增菌液LB1、2增菌肉汤中氯化钠浓度：2%）；2、直径0.2-0.4mm，半透明，边缘整齐，未带珠光的露水样菌落，在斜射光下呈典型的蓝绿色光泽。3、血液葡萄糖琼脂：圆形、光滑、淡蓝色、透明、露滴状菌落（18h-24h），狭窄溶血，有菌落下溶血；再培养至48h或以上（生长时间长短因平板而异），菌落不透明状；3、4 可生长，故称“冰箱菌”；4、麦康凯上不生长。三、Listeria monocytogenes的生化特点 1、可发酵分解多种糖（发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、蔗糖（迟发酵），接触酶（过氧化氢酶）：，甲基红：，V-P：，水解七叶苷：；、水解马尿酸钠：。2、不能发酵利用的糖（不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖）；氧化酶：；尿素酶：；H2S：；吲哚：，尿素水解：，明胶水解：，酪蛋白和牛乳：。硝酸盐还原：。3、发酵糖时，产酸：+，产气：。四、Listeria monocytogenes的抵抗力 1、在土壤、牛奶、青贮饲料和粪便中能长期存活；2、对消毒剂的抵抗力不强：2.5%来苏尔（10min），2.5%的氢氧化钠或甲醛（20min）、70%乙醇（5min）、10%石灰乳（10min），2.5%苯酚（5min）2.5%福尔马林均可有效杀灭。3、典型的耐冷耐盐性细菌，4 可生长 4、耐热，50、40min不能杀死，63加热15-20min死亡；5、酸、碱条件下都能适应。五、Listeria monocytogenes的抗原性 六、Listeria monocytogenes的致病性 1、细胞内寄生菌；2、自然感染多种家畜：猪、马、牛、绵羊；3、病畜表现神经症状、妊畜流产、血液中单核细胞增多；4、鸡可全身感染，心肌坏死；5、成人脑膜炎，新生儿脑膜炎(少见，10%)。七、Listeria monocytogenes的微生物学诊断 1、肝、脾、脑组织等涂片、革兰氏染色镜检可见G呈字排列的小杆菌；2、接种血液葡萄糖琼脂，露滴状菌落，溶血；3、病料眼内接种家兔或豚鼠，1d后发生结膜炎，不久败血症死亡；妊娠2周的动物被接种后可发生流产。八、Listeria monocytogenes携带或含有单增菌可能性较高的食品 1、牛奶和乳制品；2、肉类（特别是牛肉）。3、蔬菜，沙拉 4、海产品；5、冰淇淋。五、Listeria monocytogenes的抗原性 六、Listeria monocytogenes的致病性 1、细胞内寄生菌；2、自然感染多种家畜：猪、马、牛、绵羊；3、病畜表现神经症状、妊畜流产、血液中单核细胞增多；4、鸡可全身感染，心肌坏死；5、成人脑膜炎，新生儿脑膜炎(少见，10%)。七、Listeria monocytogenes的微生物学诊断 1、肝、脾、脑组织等涂片、革兰氏染色镜检可见G呈字排列的小杆菌；2、接种血液葡萄糖琼脂，露滴状菌落，溶血；3、病料眼内接种家兔或豚鼠，1d后发生结膜炎，不久败血症死亡；妊娠2周的动物被接种后可发生流产。4 致病机制及毒力因子 单核细胞增生李斯特氏菌 1胃肠道感染 2进入宿主细胞 3单核吞噬胞 4进入宿主细胞胞浆 5增殖 6极向运动 7形成双膜结构 并逃逸二级吞噬体 内化（入侵）被包裹 逃逸吞噬 吸收宿主营养 聚集、激活肌动蛋白 细胞间传递 致病机制流程图 致病相关机制 1、入侵细胞机制 2、逃离吞噬机制 3、细胞间传播机制 4、调节机制 5、毒力因子介绍 1、入侵细胞机制 LM表面粘附分子与细胞膜上相应的受体结合，像拉拉链一样促使细胞膜内陷，形成完整的吞噬体进入细胞。当LM进入细胞后，在吞噬体内主要靠LLO和PC-PLC破坏吞噬体膜进而进入细胞质中生长繁殖。在细胞质内生长的LM在actA作用下能向各个方向运动，靠近细胞膜的LM能在actA的作用下，使感染细胞的细胞膜形成指装突出伸向另一个细胞，而LM则位于指装突起顶点，最终在另一个细胞内形成2层膜包裹的吞噬体。同样LM可以从有二层膜的吞噬体逃逸进入细胞质繁殖。一般情况下，当LM细菌被內吞后，被包裹的宿主的吞噬小泡中，吞噬泡很快和溶酶体结合，使吞噬泡迅速被酸化从而降解菌体，但LM会通过LLO和plcA的裂解作用，溶解吞噬体膜，从而阻止或延迟吞噬泡酸化时间，并使细菌逃离吞噬体中的杀菌物质，进入宿主细胞胞浆。为了进一步了解李斯特氏菌的逃逸吞噬机制，后面会对毒力基因簇和主要毒力因子的性质、作用分别介绍。2、逃逸吞噬机制 3、细胞间传播机制 1、肌动蛋白actA。细菌运动性是肌动蛋白聚集在细菌尾部而获得的，单一的菌体蛋白就足以引起肌动蛋白聚集形成聚合物，为细菌运动提供动力。2、运动肌动蛋白的形成及细菌的极向运动。Daniel Portnoy研究发现，当进入宿主细胞质时，肌动蛋白微丝在LM的周围，当此细菌向细胞膜运动时，肌动蛋白微丝在细菌后面形成彗星状尾巴。此肌动蛋白尾巴以某种方式跟着细菌移动。研究发现，当用肌动蛋白抑制剂处理掉该彗星尾巴时，LM停止运动。3、逃离二级吞噬体 LM进入宿主细胞胞浆，在hpt蛋白（已糖磷酸盐转运蛋白）的作用下摄取细胞质中的营养成分，进行增殖。并通过一种复杂的机制使宿主细胞中的肌动蛋白聚集，极性分布于细菌表面的actA蛋白，实行细菌在细胞内运动及向邻近细胞的传播之后，感染细胞伸出伪足状（指状）结构，被邻近的细胞內吞，形成一个双层膜结构，成为二级吞噬体，其中内层膜源于母细胞。在LLO和特异性磷脂酶C的作用下，LM逃离二级吞噬体，直接进入邻近细胞，实现细胞间的感染。prfA-转录激活调节蛋白基因：编码prfA（转录激活调节）蛋白。是LM所有基因簇转录激活必需的转录因子。转录激活调节蛋白（prfA蛋白）是单增唯一的毒力调节蛋白，感染宿主过程对于许多毒力因子的等位表达起着关键调控因子的作用。prfA-转录激活调节蛋白基因 4、调节机制 LM入侵，逃逸吞噬泡，增殖以及在细胞和细胞之间的传播过程都受到prfA基因产物的调控。prfA能整合一系列的环境和自身来源的信号，保证其短暂和适应性正确表达。prfA可使LM更适应生存环境。5、毒力因子介绍 毒力岛概念以及与毒力基因的关系 毒力岛LIPI-1基因簇 （pLcA，pLcB，actA，mpl，hly，prfA）毒力岛LIPI-2基因簇 （内化素小岛，internalin islet）毒力岛与毒力基因的关系，紧密联系又有区别。毒力岛是基因组岛，群体概念，是对基因群体的研究，携带致病基因群，来源于细菌基因的水平转移（参考Hacker、Kaper等人文献）；而毒力基因是个体概念，着眼于单个基因。分布上，毒力岛基因群是连续的；缺失或转移同时发生。功能上，基因群内基因相互作用，形成毒力表达。例如 Salmonella 的 SPI2编码的III型分泌系统。过去以为细菌的毒力是单因素决定的。比如霍乱弧菌的毒力主要来自于产生霍乱毒素的能力，而VPI-1和VPI-2这两个毒力岛的发现使科学家认识到霍乱弧菌的毒力比原先想象的要复杂得多。毒力岛概念帮助我们探索细菌毒力进化和来源，进而帮助我们从基因组的水平上抓住新病原发生、发展的规律。毒力岛概念以及与毒力基因的关系 毒力岛LIPI-1基因簇 prs idh prfA plcA hly mpl actA plcB pLcA基因，编码plcA磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C。pLcB基因，编码2种磷脂酶C：1、磷脂酰肌醇磷脂酶C（PI-PLC），PI-PLC辅助PC-PLC，毒性较小 2、磷脂酰胆碱磷脂酶C（PC-PLC），PC-PLC功能复杂，在细胞间扩散，能破坏宿主细胞的信息通路，调节细胞因子和化学因子合成，能通过二酰基甘油、神经酰胺、肌醇磷酸盐调节细胞生长、分化、凋亡等。mpl基因：编码mpl蛋白加工酶。mpl蛋白加工酶是锌依赖蛋白酶，具有外毒素作用。prfA-转录激活调节蛋白基因：编码prfA（转录激活调节）蛋白，是单增所有基因簇转录激活必需的转录因子，是单增唯一的毒力调节蛋白，感染宿主过程对于许多毒力因子的等位表达起着关键调控因子的作用。actA基因编码actA（机动蛋白聚合蛋白），诱导细胞肌动蛋白分子聚合作用，促进细菌在细胞间传递，同时也与细菌被宿主细胞内化有关。hly-李斯特氏菌溶血素O基因，编码李斯特氏菌溶血素O（LLO）磷脂酰胆碱磷脂酶C（PC-PLC）磷脂酰肌醇磷脂酶C（PI-PLC）毒性相对小，对细菌在细胞间扩散作用不大 具有磷脂酰肌醇特异性 由pLcB基因编码 由pLcB基因编码 可水解鞘磷脂在内的各种磷脂 功能复杂 PC-PLC使细菌从吞噬泡中逃逸出来，能破坏宿主细胞的信号通路，能调节细胞因子和化学因子的合成。pLcB基因，编码磷脂酶C 重要的毒力因子 肌动蛋白聚合蛋白（actA）细菌动力源泉 细菌运动性是肌动蛋白聚集在细菌尾部而获得的，单一的菌体蛋白就足以引起肌动蛋白聚集形成聚合物，为细菌运动提供动力，这个菌体蛋白就是actA，成熟的actA由610个氨基酸残基组成，分成3个功能区：（1）N端区域，1234个氨基酸残基，关键区域。含有肌动蛋白聚集和细菌在细胞内运动的所有信息。（2）中间区域，235-394位氨基酸残基。（3）C端区域，315-610位氨基酸残基，586-606位氨基酸残基形成一个疏水区，从而将actA蛋白固定在细菌表面。肌动蛋白聚合蛋白（actA）actA的表达受LIPI-1毒力岛actA基因严格控制，只有在宿主细胞的胞液中才能被强烈诱导表达。2个不同的启动子调节，一个在actA基因上游198bp，另一个mpl基因。actA基因突变后，细菌虽然仍能进入细胞并进入胞浆，但不能在细胞内运动，也不能形成微菌落，也不能爱细胞间扩散，这表明actA与LM的侵袭力密切相关。actA蛋白在英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua）的表达能充分引起这个没有侵袭力的菌种侵入上皮细胞，说明actA引导一个对上皮细胞内化的通路。actA是多功能毒力因子，主要表现为以肌动蛋白为基础的运动、对宿主细胞的趋向和入侵有关。蓝色部位勾画出了出于细胞最边缘的肌动蛋白微丝，用高倍电子显微镜观察到肌动蛋白微丝很浓稠，且高度分支。（Jane Marx，2003）hly基因，编码李斯特氏菌溶血素O（Listeriolysin O，LLO）prs idh prfA plcA hly mpl actA plcB 李斯特氏菌溶血素O（LLO），5860KDa，对热不稳定，在血液营养琼脂培养基上能产生溶血区，也是被主要研究的抗原物质。LLO是单核细胞增生李斯特氏菌分泌的主要毒力因子，依赖胆固醇（与靶细胞膜上的胆固醇结合，30-40个LLO分解一个红细胞，分解细胞的活性在于溶血素的半胱氨酸残基结构），在细胞膜上成孔，LLO同类溶血素结构上有70%以上相似性；毒力菌株都带有LLO，非毒力菌株有些产生LLO；不产生LLO的李斯特氏菌可在胞液（非吞噬细胞）内生存一段时间，但无法逃逸吞噬体，无感染性。李斯特氏菌溶血素O（Listeriolysin O，LLO）prs idh prfA plcA hly mpl actA plcB hly-李斯特氏菌溶血素O基因，编码李斯特氏菌溶血素O（LLO）李斯特氏菌溶血素O（LLO），是一个多功能的毒力因子，能引起宿主细胞诸多反应，如：1、细胞增殖，2、粘膜细胞外渗作用，3、巨噬细胞中细胞因子的表达、4、树突状细胞凋亡，5、磷脂代谢，6、机体免疫反应等。单增李斯特氏菌的致病性和LLO相关，有LLO就具有致病性，没有LLO就不具有致病性。毒力岛LIPI-2基因簇（内化素小岛，internalin islet）内化（入侵）LM进入非吞噬细胞通过拉拉链模式进入（内化），拉拉链是细菌表面配体与宿主细胞受体结合，激发胞内信号通路，造成肌动蛋白骨架重排（聚合或解聚），引发细胞膜对菌体的渐进式包裹吞噬，在这一过程中，LM表面蛋白（内化素小岛）与细胞膜表面蛋白相互作用促使LM促进陷入细胞内，形成一种泡囊结构。内化素（Internalin）是LM侵入不同组织细胞的关键因素。内化素作为LM的表面粘附配体与组织细胞的表面受体结合，使LM粘附在细胞表面，从而完成入侵过程。（例：小肠中，LM分泌IntA与肠上皮细胞的上皮细胞钙粘蛋白（E-Cadherin）发生特异性结合，进而穿过肠道屏障。）粘附配体有：IntA，IntB，IntC，actA，P60，膜蛋白ami、自溶素、Lap蛋白、纤维素结合蛋白、凝集素等。毒力岛LIPI-2基因簇（内化素小岛，internalin islet）内化素小岛是一个富含亮氨基酸重复序列的蛋白质家族，分2型：内化素1型和内化素2型。内化素1型：分子量相对较大的蛋白质组成，C端区附于菌细胞壁上。代表：由InlAB编码的InlA 和InlB多肽。InlA 和InlB是LM被非吞噬细胞内化所必需的。InlA是LM第一个被认知的表面蛋白，穿入非吞噬细胞（如上皮细胞）必需的；InlB在侵袭肝细胞起重要作用。内化素II型：分子量相对较小的蛋白质组成，无锚定于菌细胞壁的C端区，释放后游离于菌细胞外环境中。致病机理研究方面还存在的问题 为什么LM容易感染脑部和胎盘？为什么在孕妇LM更倾向于感染胎盘？prfA到底怎么调控基因表达，收到那些因素影响、通过何种信号通路调控等？LM内是否还存在其他调节系统？如果存在，和宿主先天性免疫有何关系？单核细胞增生李斯特氏菌检验的卫生学意义 单核增生李斯特氏菌是胞内寄生菌，致病性与摄入量和宿主的细胞免疫功能有关。易感人群新生儿，孕妇，免疫力低下者，以及老年人群。发达国家多发。发达国家人类李斯特氏菌病发生率约每100万2-15例，死亡率13-34%。致病特点：普通人群：眼及破损皮肤、粘膜进入体内;新生儿，孕妇，免疫力低下者，以及老年人群。孕妇：感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿。检测人员防护：要带口罩，护目镜，注意保护眼角膜，手套箱内进行。5 检验标准的版本过往 单核细胞增生李斯特氏菌 GB 4789.30-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB 4789.30标准 GB 4789.30-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB/T 4789.30-2008 食品卫生微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB/T 4789.30-2003 食品卫生微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 1994 GB 4789.30-1994 食品卫生微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 2016 2008 2003 2010 GB 4789.30-1994 1994 GB 4789.30-1994 食品卫生微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB/T 4789.30-2003 食品卫生微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 2003 GB/T 4789.30-2003 GB/T 4789.30-2003 无实质修改。6.8致病力试验做了更改 GB/T 4789.30-2008 食品卫生微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 2008 GB/T 4789.30-2008 标准变化很大。GB/T 4789.30-2008 食品卫生微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 2008 GB/T 4789.30-2008 标准变化很大。GB/T 4789.30-2008 食品卫生微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 2008 GB 4789.30-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 2010 GB 4789.30-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验。与GB/T 4789.30-2008 相比，主要变化如下 ：删除“第二法 全自动酶链荧光免疫分析仪筛选法”；删除“第三法 全自动病原菌检测系统筛选法”。GB 4789.30-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 2016 现行有效 标准主要变化：增加“第二法 单核细胞增生李斯特氏菌 平板计数法”；增加“第三法 单核细胞增生李斯特氏菌 MPN计数法”。版本变化的总结 5版，1994，2003，2008，2010，2016版。2008版增加2个自动化方法；2010年出了新的食品安全法，改版。2010版删除了（2008年增加的）2