采用高级微生物基因分型系统对食品中单核细胞增生李斯特菌进行同源性分析.pdf

532中国食品卫生杂志CHINESE JOUNAL OF FOOD HYGIENE2014 年第 26 卷第 6 期耐药性研究J 实用预防医学，2011，18(6):994-9978吕素玲，韦程媛，姚雪婷，等 2010 年广西食品中沙门菌污染状况和血清型分布及耐药谱的研究J 应用预防医学，2012，18(3):137-1409陈玲，张菊梅，杨小鹃，等 南方食品中沙门菌污染调查及分型J 微生物学报，2013，53(12):1326-1332 10席昭雁，张阿峰，吴荣，等 陕西省食品中沙门菌监测研究J 中华疾病控制杂志，2011，15(8):671-673 11陈玉贞，邵坤，关冰，等20032010 年山东省食源性沙门菌血清分型及药敏分析 J 中国食品卫生杂志，2012，24(1):9-12 12马妮，孙葳，郑洪，等 辽宁省食源性沙门菌血清分布及耐药分析J 中国卫生检验杂志，2013，15(23):3144-3146 13Centers for Disease Control and Prevention Surveillance forfoodborne disease outbreaks-United States，2008J MMWMorb Mortal Wkly ep，2011，60(35):1197-1202 14Analysis of the baseline survey on the prevalence of Salmonella inholdings with breeding pigs in the EU，2008 Part A:Salmonellaprevalence estimates J EuropeanFoodSafetyAuthorityJournal，2009，7(12):1377-1457 15Boxrud D，Monson T，Stiles T，et al The role，challenges，andsupport of PulseNet laboratories in detecting foodborne diseaseoutbreaks J Public Health eports，2010，125(Suppl 2):57-62 16梅玲玲，罗芸，叶菊莲，等 浙江省 209 株沙门菌 PFGE 指纹图谱研究J 中国卫生检验杂志，2009，11(19):2478-2482 17王岚，贾华云，张红，等 湖南省食源性德尔卑沙门菌耐药谱及 PFGE 分型研究J 实用预防医学，2013，8(20):915-918论著采用高级微生物基因分型系统对食品中单核细胞增生李斯特菌进行同源性分析曾静1，周雪婷1，2，张锡全1，张琳3，张西萌1，魏海燕1，周熙城1，马丹1，倪元颖2(1 北京出入境检验检疫局，北京100026;2 中国农业大学，北京100193;3 河北出入境检验检疫局，河北 石家庄050051)摘要:目的采用高级微生物基因分型系统(DiversiLab 系统)对食品中单核细胞增生李斯特菌进行基因型分析，将分型结果与血清型和菌株的耐药性进行比对研究。方法DiversiLab 系统是基于 rep-PC 原理对微生物进行分型，将分型结果与菌株的血清型进行比较研究，同时对菌株的耐药性与 rep-PC 型别进行研究。结果采用DiversiLab 系统将 46 株单核细胞增生李斯特菌分为 9 个型别 A I。血清型为 1/2a 的分离株以 A 型为主，所测试的 6 株血清型为4b 的分离株均为 H 型;14 株呋喃妥因耐受菌株9 株为 A 型、1 株为 B 型、3 株为 C 型、1 株为 F 型，除 2 株血清型为 3a 外，其余均为 1/2a。结论DiversiLab 系统分析结果，揭示了 46 株从食品中分离的单增细胞增生李斯特菌间的亲缘关系，rep-PC 分型结果与 H 抗原结合位点存在一定联系，呋喃妥因耐受菌株的 DNA 指纹图谱相似度高，与耐药基因有关。关键词:单核细胞增生李斯特菌;DiversiLab 系统;同源性分析;食源性致病菌中图分类号:155;378文献标志码:A文章编号:1004-8456(2014)06-0532-05DOI:10.13590/j cjfh 2014.06.004收稿日期:2014-08-04基金项目:国家质检总局公益性行业科研专项(201110034)作者简介:曾静女研究员研究方向为食品微生物检验方法E-mail:jingzeng_cn163 comTyping Listeria monocytogenes isolated from food by DiversiLab systemZENG Jing，ZHOU Xue-ting，ZHANG Xi-quan，ZHANG Lin，ZHANG Xi-meng，WEI Hai-yan，ZHOU Xi-cheng，MA Dan，NI Yuan-ying(Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China)Abstract:ObjectiveL.monocytogenes isolates were typed by DiversiLab system The result was compared with theresults of serotype and the antibiotic resistance MethodsThe DiversiLab system was based on the principle of rep-PCesultsThe 46 isolates were classified as nine types，type A to I The 1/2a serotype isolates mainly belonged to A typeSix 4b serotype isolates belonged to H type Among 14 nitrofurantoin resistance isolates，nine of them were A type，oneisolate was B type，three isolates were C type，and one isolate was F type Most of the nitrofurantoin resistance isolates采用高级微生物基因分型系统对食品中单核细胞增生李斯特菌进行同源性分析 曾静，等533were 1/2a serotype，except two of them were 3a serotypeConclusionDiversiLab system typing results revealed thegenetic characters and relationship of 46 foodborne L monocytogenes The typing results related to the H sites of serotypeThe similarity of 14 nitrofurantoin resistance isolates was high，and related to anti-nitrofurantoin resistance genesKey words:Listeria monocytogenes;DiversiLab system;homologous analysis;foodborne pathogen单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)属于李斯特菌属，为革兰氏阳性短杆菌。其在自然界中分布广泛，可以在低温、酸性、高盐的环境中生长1 2，抗逆性强，主要引起人类败血症、脑膜炎、肺炎、流产等多种疾病。其易感人群多为 60 岁以上老人、孕妇、新生儿及患有免疫缺陷症的人群。该菌的致病性强，致死率高达 20%30%3。细菌基因组重复序列 PC 技术(rep-PC)是一种细菌基因组指纹分析方法，通过扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，对电泳条带进行比较分析，揭示基因组间的差异4 6。本研究采用基于rep-PC 原 理 的 高 级 微 生 物 基 因 分 型 系 统(DiversiLab)对从食品中分离的 46 株单核细胞增生李斯特菌进行基因分型，并将分型结果与分离株的血清型和耐药性进行比较研究。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株来源46 株单增细胞增生李斯特菌均分离自食品，是北京出入境检验经法国生物梅里埃有限公司的VITEK 鉴定卡进行鉴定，菌株详细信息见表 1。表 146 株单增细胞增生李斯特菌菌株来源Table 1Origins of 46 L monocytogenes strains菌株来源菌株编号菌株数/株三文鱼BJ-LMO-3，6，7，17，19，20，21，24，25，26，30，32，34，36，38，39，40，41，42，43，44，45，50，51，55，56，58，59，60，61，64，65，6633蚌BJ-LMO-51冻牛筋串BJ-LMO-81鸡肉BJ-LMO-11，37，463猪肉BJ-LMO-181冻肋排BJ-LMO-311金枪鱼头BJ-LMO-351鳌龙虾BJ-LMO-471冻牛肉BJ-LMO-48，542多宝鱼BJ-LMO-491海鲈鱼BJ-LMO-6211.1.2主要仪器与试剂Agilent Bioanalyzer 2100 型 DiversiLab 分型系统(美国 Agilent)，PE 9700 型 PC 仪(美国 life)。VITEK 生化鉴定卡、Ultra Clean Microbial DNA提取试剂盒、rep-PC 指纹图谱试剂盒、DNA Chipeagents and Supplies 试剂盒、微流体芯片均购自法国梅里埃。1.2方法1.2.1DNA 提取挑选单个菌落于羊血琼脂培养基上 37 过夜培养。用 MO BIO Ultra Clean Microbial DNA 提取试剂盒提取细菌 DNA。按照说明书推荐步骤提取DNA，DNA 浓度控制在 25 50 ng/l。1.2.2rep-PC 分型以提取的单增细胞增生李斯特氏菌 DNA 为模版，使用 DiversiLab 配套的 rep-PC 试剂盒，按照说明书进行 PC 扩增，PC 循环参数为:94 2 min;94 30 s，50 30 s，70 90 s，35 个循环;72 3 min，反应体积为 25 l。PC 扩增产物注入微流体芯片，放入 DiversiLab 分型系统进行电泳，其自动生成分析报告。DiversiLab 根据 Pearson 相关系数确定菌株间的距离矩阵，用非加权配对算术平均法(UPGMA)建立树状图。2结果2.1单核细胞增生李斯特氏菌 rep-PC 分型结果利用 DiversiLab 系统，相似度系数为 94%时，46 株单核细胞增生李斯特菌被分为 4 个群;相似度系数为 97%时，进一步分为 9 个型别即 A I 型。其中，1 群包括 A 型(21 株)、B 型(3 株)和 C 型(5 株)，共 29 株;2 群包括 D 型(1 株)、E 型(1 株)和 F 型(2 株)，共 4 株;3 群仅 G 型，1 株;4 群包括H 型(10 株)和 I 型(2 株)，共 12 株，见图 1。2.2单核细胞增生李斯特菌 rep-PC 分型结果与血清型根据鞭毛(H)抗原和菌体(O)抗原，单核细胞增生李斯特菌分为 13 个血清型，分别是 1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”7。根据我们实验室以前的研究结果，本研究采用的 46 株单核细胞增生李斯特菌分离株的血清型包括 1/2a、4b、1/2b、1/2c、3a 和 4d8。对比血清分型和分子分型结果显示，血清分型将 46 株单核细胞增生李斯特菌划分为 6 个血清型，rep-PC 分子分型以相似度系数 97%将其划分为 9 个基因型，相同血清型可被分为不同的基因型。值得注意的是，主要的血清型中，1/2a 以 A 型为主;4b 以 H 型为主;其他血清型中，不同基因型分布不一，见表 2。534中国食品卫生杂志CHINESE JOUNAL OF FOOD HYGIENE2014 年第 26 卷第 6 期图 146 株单核细胞增生李斯特菌 rep-PC 分子分型树状图及虚拟凝胶图Figure 1ep-PC dendrogram and gel images for 46 L.monocytogenes strains2.3单核细胞增生李斯特菌耐药性和 rep-PC 分子分型根据本实验室以前的研究结果，本研究采用的菌株中有 14 株对呋喃妥因存在耐药性9。rep-PC分子分型结果显示，其相似度在 91.0%99.6%之间。以相似度 94%为分割线，13 株(92.9%)呋喃妥因耐受菌株属于 1 群;以相似度 97%为分割线，9 株(64.3%)呋喃妥因耐受菌株属于 A 型，1 株 B型，3 株(21.4%)C 型，另有 1 株为 F 型，见图 2。通过对比 14 株呋喃妥因耐受菌株 DNA 指纹图谱发现，rep-PC DNA 扩增片段间只有少数(1 2 条)条带存在细微差异，见图 3、4。3讨论DiversiLab 系统基因组重复序列 PC(repetitivesequence-based PC，rep-PC)，是在随机引物 PC基础上发展的 DNA 指纹图谱分析的一种新方法。利用细菌基因组中广泛分布的、小的、高度保守的特点且重复的寡居核苷酸序列为引物扩增 DNA，并通过电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异和判定细菌间的亲缘关系10。DiversiLab 系统是基于rep-PC 技术发展出的一种新的分子分型方法。通过 rep-PC 扩增细菌基因组的非编码重复序列后根据扩增片段长度差异，形成由多条带组成的、强弱不一的 rep-PC DNA 指纹图谱，从而比较菌株间的相似性。该系统已被逐渐应用于分子流行病学研究，目前国内的相关报道尚不多见。可重复性强，数据标准化是 DiversiLab 系统最大的优势。由于采用了标准化的操作、高分辨率的微流体芯片和荧光检测系统及统一的数据处理软件，克服了重复性采用高级微生物基因分型系统对食品中单核细胞增生李斯特菌进行同源性分析 曾静，等535表 246 株单核细胞增生李斯特氏菌血清分型和分子分型结果Table 2Serotype and genotyping results of 46 L monocytogenes strains菌株编号菌株来源血清型基因型菌株编号菌株来源血清型基因型BJ-LMO-3三文鱼1/2aABJ-LMO-40三文鱼1/2aABJ-LMO-5蚌4bHBJ-LMO-41三文鱼4bHBJ-LMO-6三文鱼1/2aABJ-LMO-42三文鱼4bHBJ-LMO-7三文鱼1/2aABJ-LMO-43三文鱼1/2bIBJ-LMO-8冻牛筋串4bHBJ-LMO-44三文鱼1/2bABJ-LMO-11鸡肉1/2aHBJ-LMO-45三文鱼1/2aABJ-LMO-17三文鱼1/2aABJ-LMO-46鸡肉4bHBJ-LMO-18猪肉1/2aABJ-LMO-47鳌龙虾1/2cIBJ-LMO-19三文鱼1/2aABJ-LMO-48冻牛肉1/2bGBJ-LMO-20三文鱼1/2aABJ-LMO-49多宝鱼1/2aABJ-LMO-21三文鱼1/2aABJ-LMO-50三文鱼1/2aFBJ-LMO-24三文鱼1/2aABJ-LMO-51三文鱼3aABJ-LMO-25三文鱼1/2aABJ-LMO-54冻牛肉3aABJ-LMO-26三文鱼1/2aDBJ-LMO-55三文鱼1/2aABJ-LMO-30三文鱼1/2aCBJ-LMO-56三文鱼1/2aBBJ-LMO-31冻肋排1/2aFBJ-LMO-58三文鱼1/2aABJ-LMO-32三文鱼1/2aABJ-LMO-59三文鱼4dHBJ-LMO-34三文鱼1/2aCBJ-LMO-60三文鱼3aBBJ-LMO-35金枪鱼块4bHBJ-LMO-61三文鱼3aCBJ-LMO-36三文鱼1/2aCBJ-LMO-62海鲈鱼1/2aHBJ-LMO-37鸡肉1/2bHBJ-LMO-64三文鱼3aCBJ-LMO-38三文鱼1/2aABJ-LMO-65三文鱼1/2bEBJ-LMO-39三文鱼1/2aABJ-LMO-66三文鱼1/2aB图 214 株呋喃妥因耐受菌株 rep-PC 相似度矩阵图Figure 2ep-PC similarity analysis ziggurat of 14L.monocytogenes resistant strains差的缺点，且不同操作者对结果分析的差异性小11，而且不同地区的数据上传到中心数据库，便于不同实验室间的结果比较。本实验室采用 Diversilab 系统，对 46 株从不同食品中分离的单核细胞增生李斯特氏菌进行了基因分型。相似度系数为 94%时，46 株单核细胞增生李斯特菌被分为 4 个群;相似度系数为 97%时，分为9 个型别。1 群包括 A、B 和 C 型，包含29 株分离图 39 株 A 型呋喃妥因耐受菌株 DNA 指纹图谱对比图Figure 3Overlay of rep-PC fingerprints of genomic DNA for9 out of 9 F300-resistant L.monocytogenes strainsbelonging A type图 45 株 B、C 和 F 型呋喃妥因耐受菌株 DNA 指纹图谱对比图Figure 4Overlay of rep-PC fingerprints of genomicDNA for 5 of 14 F300 resistant L.monocytogenes strainsbelonging B，C and F type536中国食品卫生杂志CHINESE JOUNAL OF FOOD HYGIENE2014 年第 26 卷第 6 期株，其中 26 株从进口三文鱼中分离;2 群包括 D 型(1 株)、E 型(1 株)和 F 型(2 株)，共4 株;3 群仅 G型，1 株;4 群包括 H 型(10 株)和 I 型(2 株)，共12 株。本文对 rep-PC 分型结果与血清型之间的关系进行了分析。对 46 株单核细胞增生李斯特菌进行血清分型，通过比较研究发现 21 株 A 型分离株有18 株的血清型是 1/2a，另外 3 株分离株的血清型为3a 和 1/2b，有 16 株分离株为 A 型，且血清型为 1/2a 的菌株来自进口三文鱼。1/2a、1/2b和 3a 血清型 O 抗原结合位点不尽相同，但它们有相同的 H 抗原结合位点(A 和 B);6 株血清型为 4b 的分离株，rep-PC 型别为 H 型，其他 4 株分离株的血清型为1/2a、1/2b 和4d，血清型1/2b、4b 和4d 的 H 抗原的结合位点完全相同。因此，推论 rep-PC 分型方法和 H 抗原结合位点存在一定联系。Brosch 等12 对176 株单核细胞增生李斯特菌株进行 PFGE 分型和血清型结果之间的分析结果表明，PFGE 分型结果与 H 抗原密切相关。比较分析了 14 株单核细胞增生李斯特氏菌呋喃妥因耐受菌株的 rep-PC 图谱。9 株 A 型 DNA 指纹图谱及其相似(图 3)，5 株其他基因型的 DNA 指纹图谱的相似度也很高(图 4)，可能与这些菌株具有相同的耐药基因有关。综上所述，采用 DiversiLab 分型系统对从食品中分离的 46 株单核细胞增生李斯特菌进行基因分型。共分为 4 个群，9 个基因型;将分型结果与血清型鉴定结果进行了比较，rep-PC 分型结果与 H 抗原结合位点存在一定联系;呋喃妥因耐受菌株的DNA 指纹图谱相似度极高，与耐药基因有关。参考文献1Duche O，Trempulet F，Glaser P，et al Salt stress proteinsinduced in Listeria monocytogenesJ Appl Environ Microbial，2002，68(4):1491-14982Sergelidis D，Abrahim A Adaptive response of Listeria monocy-togenes to heat and its impact on food safetyJ Food Control，2009，20(1):1-103Mead P S，Slutsker L，Dietz V，et al Food-related illness anddeath in the United StatesJ Emerg Infect Dis，1999，5(5):607-6254许龙岩，袁慕云，林文丽，等 DiversiLab 系统沙门氏菌分子分型评价J 食品科学，2012，33(3):203-2065劳华均，李如松，孙萍，等 DiversiLab 系统用于食品中单增李斯特菌同源性分析J 食品工业，2013，33(8):154-1566刘静宇，凌莉，陈思强，等 用 DiversiLab 系统对食品中分离的金黄色葡萄球菌进行分型溯源研究J 食品科技，2012，37(12):310-3167Doumith M，Cazalet C，Simoes N，et al New aspects regardingevolution and virulence of Listeria monocytogenes revealed bycomparative genomics and DNA arraysJ Infect Immun，2004，72(2):1072-10838周雪婷，张西萌，曾静 食品中单核细胞增生李斯特氏菌血清型分析J 中国公共卫生，2012，28(12 增刊 1):95-979周雪婷，张西萌，曾静 食品中单核细胞增生李斯特氏菌耐药性分析J 中国公共卫生，2012，28(12 增刊 1):1-3 10金莉莉，王秋雨，侯潇 EIC-PC 技术在李斯特氏菌种、菌株鉴定中的应用J 遗传，2003，25(2):195-197 11Wise M G，Siragusa G，Plumblee J，et al Prediciting Samonellaenterica serotypesbyrepetitivesequence-basedPC JMicrobiol Methods，2009，76(1):18-24 12Brosch，Brett M，Catimel B，et al Genomic fingerprinting of 80strains from the WHO multicenter international typing study ofListeriamonocytogenesviapulsed-fieldgelelectrophoresis(PFGE)J International Journal of Food Microbiology，1996，32(3):343-355欢迎订阅 2015 年肉类研究 杂志肉类研究 杂志创刊于 1987 年，主办单位为中国肉类食品综合研究中心。肉类研究 是经国家新闻出版总署正式批准，面向国内外公开发行的中文科技期刊，国际标准刊号:ISSN1001-8123，国内统一刊号:CN11-2682/TS。月刊。本刊自 2011年开始由 食品科学 杂志的编辑团队全新打造，2011 2013 年连续入选 中国科技核心期刊，影响因子持续上升。本刊还被 中国核心期刊(遴选)数据库 中国期刊全文数据库 中文科技期刊数据库 中国期刊网 等数据库全文收录。肉类研究 融学术研究、产品开发和技术创新为一体，致力于肉类科研和技术推广，构筑学者交流平台，培养科技研发人才，记录行业发展历程，展示国际前沿成果，对推动中国肉类行业健康、快速发展具有重要作用。本刊主要面向全国各大高等院校、科研院所、各级党政机关、企事业单位的广大专家学者、工程技术人员、硕士博士研究生、管理人员等。2015 年 肉类研究 杂志继续改版升级:政策法规、国际科技资讯、优质实业、名师论坛、肉类联盟专栏等新创栏目以服务企业、贴近读者为目标，内容更加精彩;基础研究、加工工艺、质量安全、包装贮运、分析检测、专题论述等科研论文将更具权威与实用性，引领肉类行业科技创新发展。发行部常年办理邮购，月刊，定价:15 元/册，全年定价 180 元现金订阅:直接通过邮局汇款至北京市西城区禄长街头条 4 号 肉类研究 编辑部收。邮政编码:100050手机:[phone]联系电话:[phone]/49/50 转 8010传真:[phone]联系人:李向芳网址:www chnfood cn电子邮箱:chnfood chnfood cn银行汇款:账户:中国食品杂志社开户行:工行阜外大街支行账号:0200049209024922112