LC_School_1_液相色谱基础知识A.pdf

Waters中国有限公司培训中心中国有限公司培训中心液相色谱教程液相色谱教程(一一)液相色谱基础知识液相色谱基础知识 A2004 Waters Corporation什么是色谱什么是色谱?色谱法的简称(又叫色层法,层析法),其本质是一种分离分析方法色谱法的简称(又叫色层法,层析法),其本质是一种分离分析方法?常见的分离方法常见的分离方法 蒸馏蒸馏 离心离心 电泳电泳 过滤过滤 超滤超滤?色谱色谱目前最有效的分离方法目前最有效的分离方法2004 Waters Corporation色谱法简介色谱法简介?色谱法(色谱法(Chromatography)溯源)溯源100多年前俄国植物学家100多年前俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用分离植物色素时采用的实验方法的实验方法他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带Tswett用希腊语用希腊语chroma(色)和(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法)(色谱法)2004 Waters Corporation色谱法简介色谱法简介?色谱法是一种现代的分离方法色谱法是一种现代的分离方法-不单是分离有色物质不单是分离有色物质-不单是吸附机理-不单是吸附机理?1906年正式命名(见诸文献)1906年正式命名(见诸文献)?20世纪30年代开始广泛研究和应用20世纪30年代开始广泛研究和应用?高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代2004 Waters Corporation色谱法原理色谱法原理?色谱法的原理色谱法的原理 是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离 两相中有一相是固定的,叫作两相中有一相是固定的,叫作固定相固定相(Stationary Phase),有一相是流动的,称为,有一相是流动的,称为流动相流动相(Mobile Phase),流动相流动相又叫又叫洗脱剂洗脱剂,溶剂溶剂?相相(Phase):物理化学术语物理化学术语,特指在某一系统中特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面2004 Waters Corporation色谱法原理色谱法原理分离是一个物理过程。固定相固定相(Stationary Phase)流动相流动相(Mobile Phase)进样进样(Injection)洗脱洗脱(Elution)相互作用相互作用(Interaction)2004 Waters Corporation色谱法的分类色谱法的分类?按流动相的物态分:按流动相的物态分:气相色谱气相色谱(Gas Chromatography,GC)用气体作为流动相(又叫载气)用气体作为流动相(又叫载气)液相色谱液相色谱(Liquid Chromatography,LC)用液体作为流动相(又叫洗脱剂)用液体作为流动相(又叫洗脱剂)?按固定相的形态分:按固定相的形态分:平面色谱平面色谱?纸色谱纸色谱?薄层色谱薄层色谱 柱色谱柱色谱2004 Waters Corporation色谱法分类示意图色谱法分类示意图色谱液相色谱柱色谱纸色谱薄层色谱高效液相色谱HPLC高效液相色谱HPLC气相色谱2004 Waters Corporation色谱法的分类色谱法的分类?按流动相和固定相的相对极性分:按流动相和固定相的相对极性分:正相色谱正相色谱(Normal Phase Chromatography)?固定相的极性大于流动相固定相的极性大于流动相反相色谱反相色谱(Reversed Phase Chromatography)?固定相的极性小于流动相固定相的极性小于流动相?有机化合物的极性有机化合物的极性分子间作用力分子间作用力(静电引力静电引力,偶极力偶极力,色散力色散力,氢键力氢键力)综合表现的一种描述综合表现的一种描述?注意:此分类法仅适用于液相色谱注意:此分类法仅适用于液相色谱2004 Waters Corporation有机化合物极性示例有机化合物极性示例CH3COOCH3溶剂样品的官能团极性 非极性水 甲醇 异丙醇 乙腈 THF 乙酸乙酯 CH2Cl2CHCl3己烷NH3X/ArOH/RCOOH CNH2ROH RCN 醛/酮 N(R)2 NO2 卤代烷烃 烷烃2004 Waters Corporation色谱法的分类色谱法的分类?按分离过程的机理分:按分离过程的机理分:吸附色谱(吸附色谱(Absorption Chromatography)?根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离 分配色谱(分配色谱(Partition Chromatography)?分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同 离子交换色谱(离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography)?根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC)体积排除色谱(体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography)?GPC(Gel Permeation Chromatography)固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂?GFC(Gel Filtration Chromatography)固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液2004 Waters Corporation什么是什么是HPLC?高效液相色谱法高效液相色谱法 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段:是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段:?高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器 广泛应用于各个领域:广泛应用于各个领域:?医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业 无论在技术上,理论上,还是在应用上仍有较大的发展空间无论在技术上,理论上,还是在应用上仍有较大的发展空间2004 Waters Corporation什么是什么是UPLC?超高效液相色谱超高效液相色谱 UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography)是区别于是区别于HPLC的液相色谱新领域的液相色谱新领域 基于小颗粒填料和基于小颗粒填料和LC原理的一种创新方法原理的一种创新方法 实现超高分离度、灵敏度、分析速度实现超高分离度、灵敏度、分析速度 是是Waters公司对液相色谱的新贡献(2004年3月正式推出)公司对液相色谱的新贡献(2004年3月正式推出)2004 Waters CorporationHPLC的流程的流程 溶剂溶剂(流动相流动相)泵进样器色谱柱泵进样器色谱柱(固定相固定相)检测器废液数据系统检测器废液数据系统2004 Waters CorporationHPLC的图形结果的图形结果色谱图(色谱图(Chromatogram):):色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间色谱峰时间色谱峰时间(分分)基线基线峰高峰高峰宽响应值峰宽响应值2004 Waters Corporation液相色谱图名词术语(1)液相色谱图名词术语(1)?色谱图名词术语:色谱图名词术语:色谱峰色谱峰(Peak):色谱柱流出组分):色谱柱流出组分通过检测器时产生通过检测器时产生的响应信号的响应信号 峰底峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线):峰的起点与终点之间连接的直线 峰高峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离):峰最大值到峰底的距离 切线峰宽切线峰宽(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离峰底相交两点之间的距离 半(高)峰宽半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰高的):通过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧相交两点之间的距离侧相交两点之间的距离2004 Waters Corporation液相色谱图名词术语(2)液相色谱图名词术语(2)?色谱图名词术语:色谱图名词术语:峰面积峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值):峰与峰底之间的面积,又称响应值 标准偏差()标准偏差()(Standard Error):0.607倍峰高对应峰):0.607倍峰高对应峰宽的一半宽的一半 拖尾峰拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰):后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰):前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰):并非由试样所产生的峰,亦称假峰2004 Waters Corporation液相色谱图名词术语(3)液相色谱图名词术语(3)?色谱图名词术语:色谱图名词术语:基线基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号的响应信号 基线飘移基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变化):基线随时间定向的缓慢变化 基线噪声(N)基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的基):由各种因素所引起的基线波动线波动 谱带扩展谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象过程中谱带宽度增加的现象2004 Waters Corporation液相色谱图名词术语(4)液相色谱图名词术语(4)?色谱图名词术语:色谱图名词术语:死时间(死时间(t0)(Dead time):不被固定相滞留的组分,从进):不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的时间样到出现峰最大值所需的时间 保留时间(保留时间(tR)(Retention time):组分从进样到出现峰最):组分从进样到出现峰最大值所需的时间大值所需的时间 死体积死体积(V0)(Dead volume):不被固定相滞留的组分,从):不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的流动相体积进样到出现峰最大值所需的流动相体积 保留体积(保留体积(VR)(Retention volume):组分从进样到出):组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积现峰最大值所需的流动相体积2004 Waters Corporation液相色谱的应用（1）液相色谱的应用（1）?“分析型液相色谱”“分析型液相色谱”?目的:得到数据-定性及定量分析目的:得到数据-定性及定量分析 灵敏度的要求灵敏度的要求 样品的复杂性样品的复杂性 样品量的要求样品量的要求 精度及准确度的要求精度及准确度的要求 容易使用容易使用2004 Waters Corporation液相色谱的应用（2）液相色谱的应用（2）?“制备型液相色谱”“制备型液相色谱”?目的:得到纯品-分离及纯化目的:得到纯品-分离及纯化 化合物的稳定性化合物的稳定性 样品的复杂性样品的复杂性 制备量的要求制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性方法的安全性2004 Waters CorporationHPLC的系统组成-硬件的系统组成-硬件?流路系统:流路系统:泵泵(515,1515,1525,600,616,626)进样器进样器(7725i,717Plus)色谱柱色谱柱(Symmetry C18,NovaPak C18,)检测器检测器(2487,2996,2475,2414,2420,EMD)2695/2795分离单元分离单元(溶剂管理与样品管理集成为一体溶剂管理与样品管理集成为一体)2004 Waters CorporationHPLC的系统组成-软件的系统组成-软件?数据系统数据系统:积分仪积分仪(746)工作站工作站(PC800)数据管理系统数据管理系统(基于基于Oracle关系型数据库和关系型数据库和Windows 2000/XP操作平台操作平台)?Breeze?Millennium32?EmpowerMasslynx4.0软件平台软件平台(用于液质联用系统用于液质联用系统)2004 Waters CorporationWaters的的HPLC系统(1)系统(1)?Alliance 系统系统:2690/5分离单元分离单元 色谱柱色谱柱(Symmetry C18)2996(2487)检测器检测器 Empower 色谱管理系统色谱管理系统2004 Waters CorporationWaters的的HPLC系统(2)系统(2)?1525-717(7725i)-2487-Breeze系统系统2004 Waters CorporationWaters的的HPLC系统(3)系统(3)?液质联用系统液质联用系统:2695-2996-ZQ4000-Masslynx4.02004 Waters CorporationWaters的的HPLC系统(4)系统(4)?氨基甲酸酯分析系统氨基甲酸酯分析系统:2695-柱后衍生装置柱后衍生装置-2475-Empower色谱管理系统色谱管理系统