β-防御素-3在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌呼吸机相关性肺炎大鼠肺组织中的.docx

-防御素-3在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌呼吸机相关性肺炎大鼠肺组织中的表达 作者单位：430022 武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科，武汉 430022武庆平 桂平 姚尚龙【摘要】 目的 研究大鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA呼吸机相关性肺炎VAP时肺组织中-防御素-3BD-3的表达，以探讨其在VAP发病机制中的作用。方法 20只清洁级雄性SD大鼠随机分为2组n=10，非通气肺炎组N组和呼吸机相关性肺炎组V组。N组大鼠经口气管插管后立即接种2109菌落形成单位cfu的MRSA，V组大鼠经口气管插管并进行4h保护性机械通气后气管内接种相同数量的细菌。接种后48 h处死大鼠，测定肺湿重与体重比WW/BW，记录肺肉眼和病理学评分，并进行肺组织细菌计数和脾培养，免疫组化检测肺组织BD-3的表达。结果 与N组比拟，V组WW/BW，肺病理学积分，肺组织细菌含量和菌血症发生率均显著升高P均0.01，而BD-3的表达显著降低P0.01。结论 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌呼吸机相关性肺炎MRSA VAP显著重于非通气肺炎，这可能与机械通气降低了BD-3的表达有关。【关键词】耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；呼吸机相关性肺炎；防御素Expression of beta-defensin-3 in lungs of rats with methicillin-resisitant Staphylococcus aureus ventilator-associated pneumonia GUI Ping Department of Anesthesiology , Union Hospital , Tongji Medical College , Huazhong University of Science and Technology , Wuhan 430022 , China Abstract Objective To study the expression of beta-defensin-3(BD-3) in lungs of rats with methicillin-resisitant Staphylococcus aureus(MRSA) ventilator-associated pneumonia(VAP) and to investigate the role of BD-3 in the pathogenesis of VAP. Twenty specific pathogen-free male Sprague-Dawley rats weighing 242286g were randomly divided into 2 groups: nonventilated pneumonia group(group N, n=10) and ventilator-associated pneumonia group(group V, n=10). Rats in group N were infected intrabronchially with 2109 colony-forming units(cfu) MRSA immediately after oral intubation while rats in group V were infected intrabronchially with the same amount of MRSA after oral intubation and 4 hours, protective mechanical ventilation. Rats from both groups were killed 48 h after inoculation. Lung wet weight to body weight ratios(WW/BW) were measured, lung macroscopic and microscopic scores were recorded, lung bacterial counts and spleen culture were also done. Expression of BD-3 in lung of rats was detected by immunohistochemistry staining. Results WW/BW, lung microscopic score, bacterial pulmonary concentration and the incidence of bacteremia in group V were significantly higher than in group N(P0.01), while expression of BD-3 was significantly lower than in group N(P0.01). Conclusion Ventilator-associated pneumonia is more severe than nonventilated pneumonia，this may be related to the reduced expression of BD-3 by mechanical ventilation.Key words methicillin-resisitant Staphylococcus aureus; pneumonia, ventilator-associated; defensin呼吸机相关性肺炎VAP是重症监护室最重要的感染并发症，接受机械通气的病人8%-28%会并发VAP，其死亡率高达24%-50%1。VAP治疗失败率如此之高的原因之一就是多重耐药病原体的感染，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA是VAP常见的多重耐药病原体2。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌呼吸机相关性肺炎MRSA VAP已成为重症监护室里的一大挑战。-防御素-3BD-3是防御素家族中的一个成员，是上皮细胞分泌的一种重要的固有免疫效应分子，具有广谱高效的抗微生物活性，包括多重耐药的金黄色葡萄球菌，BD-3还能趋化单核细胞3。本实验拟建立MRSA VAP的大鼠模型，观察BD-3表达的变化，探讨BD-3在MRSA VAP发病机制中的作用。材料与方法MRSA临床别离株华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科；蛋白胨、酵母粉、琼脂粉Oxoid公司，英国；小鼠抗人BD-3单克隆抗体immundiagnostik公司，德国；SABC免疫组化试剂盒武汉博士德生物工程公司；683型小动物容量控制呼吸机Harvard Apparatus公司，美国；HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统武汉千屏影像技术有限责任公司。MRSA临床别离株接种于液体LB培养基1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化钠，于37C 220rpm的恒温摇床振荡培养79 h，取菌液0.1ml，用液体LB培养基进行10倍系列稀释，各取0.1 ml接种于固体LB培养基1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化钠、2%琼脂粉，于37C的细菌培养箱培养24 h后计算菌液的浓度，用生理盐水稀释成1010 cfu/ml备用。清洁级雄性SD大鼠20只，体重242286 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，随机分为2组n10：非通气肺炎组N组和呼吸机相关性肺炎组V组。腹腔注射20%乌拉坦1.3 g/kg麻醉后，N组大鼠直视下应用额镜经口气管插管16G211的静脉套管针代替气管导管，确认导管在气管内后，经气管导管注入0.2 ml 1010cfu/ml的菌液，拔出气管导管；V组大鼠直视下应用额镜经口气管插管，确认导管位置正确后，连接到683型小动物容量控制呼吸机进行保护性机械通气，通气参数设置如下：潮气量6 ml/kg，呼吸频率88次/min，呼气末正压5 cmH2O，吸入氧浓度21%，大鼠口腔填塞纱布条以防止漏气，通气4 h后经气管导管注入0.2 ml 1010cfu/ml的菌液，拔出气管导管。2组大鼠均于接种后48 h处死。处死大鼠前称体重BW，开胸完整别离出肺并称重WW，计算肺湿重与体重比WW/BW。记录肺肉眼评分，每一叶的评分按以下标准进行：正常0，瘢痕1，轻度充血2，红色充血3，灰色充血4和浅黄色充血54。从每一叶肺左肺、右肺前叶、右肺中叶、右肺后叶和右肺副叶固定位置各取1 cm左右大小的组织块，用于组织病理学和免疫组织化学检测，肺组织浸于4的多聚甲醛固定，于一系列浓度梯度的乙醇中脱水，石蜡包埋、切片，一局部切片HE染色，光镜下观察肺组织病理学改变，组织病理学评分按以下标准进行：正常0，脓性粘液栓1，支气管炎2，支气管肺炎3，融合性支气管肺炎4和肺脓肿55。另一局部切片用于免疫组化法检测肺组织BD-3表达， DAB染色，阳性染色为胞浆染成棕黄或棕褐色。阴性对照采用PBS代替一抗。每张切片随机选取5个视野200，图象采用HMIAS-2000型全自动彩色图像分析系统进行蛋白半定量分析，以光密度反映BD-3蛋白含量。余下的肺组织称重后加1 ml生理盐水匀浆，取匀浆液0.1 ml 10倍系列稀释后培养计数，肺组织细菌浓度以log10 cfu/g肺组织表示。别离出脾脏后，无菌生理盐水冲洗，匀浆后涂抹接种于LB琼脂平板，如有菌落生长，挑取菌落革兰染色，排除假阳性，真阳性说明发生了菌血症。采用SPSS10.0统计软件分析数据，计量资料以均数标准差表示，组间比拟采用独立样本t检验，菌血症发生率的比拟采用u检验，P0.05为差异有统计学意义。结果2组大鼠发生的都是双侧不对称多病灶性肺炎，病变多以右肺后叶最为严重，见图 1。V组肺炎较N组重，无论是组织病理学方面还是细菌学方面。与N组比拟，WW/BM和病理学评分显著升高P均0.05，见表 1，肺细菌浓度和菌血症发生率也显著升高P均0.01，见表2。图 1 2组右肺后叶病理学结果HE染色，200表 1 2组WW/BM，肉眼评分和病理学评分的比拟n=10，组别WW/BW102肉眼评分病理学评分N组0.990.1112.11.511.71.2V组1.210.10*12.61.313.41.2*与N组比拟，* P0.01表 2 2组肺细菌浓度和菌血症发生率的比拟n=10，组别肺细菌浓度log10cfu/g菌血症发生率N组8.70.420%(2/10)V组12.20.9*90%(9/10)*与N组比拟，* P0.01BD-3主要表达于支气管上皮细胞和肺上皮细胞，见图2。N组和V组的平均光密度值分别是1.160.10和0.770.11，与N组比拟，V组的BD-3表达显著降低P0.01。图 2 2组右肺中叶BD-3的表达DAB显色，200讨论VAP是重症监护室最重要的感染并发症，MRSA VAP成为一重大挑战。VAP的病理学特点是双侧不对称多局灶性肺炎，尤以下肺最为严重，不同阶段的病变共存6。VAP是感染和呼吸机相关性肺损伤共同作用的结果。预实验发现经气管接种108或109 cfu的MRSA引起的肺炎病变较轻，而经气管接种2109 cfu的MRSA引起的肺炎病理学改变符合VAP病理学特点，所以本实验采用经气管接种2109 cfu的MRSA。本实验采用的通气模式在原先的根底上7进行了改良，采用的是小潮气量加呼吸末正压通气保护性通气，一是因为大潮气量通气能导致明显的肺损伤，小潮气量加呼吸末正压通气是重症监护室最常用的通气模式，因而更贴近临床，二是因为新的小动物呼吸机能到达这种要求。VAP的评估主要从病理学和细菌学两方面进行，与N组比拟，WW/BM，病理学评分，肺细菌浓度和菌血症发生率均显著升高，说明4 h 的保护性通气后经气管接种2109 cfu的MRSA能成功制作MRSA VAP大鼠模型。BD-3是重要的抗微生物肽，在肺的固有免疫中发挥重要作用。低浓度的BD-3能杀灭革兰阴性细菌大肠埃希菌，铜绿色假单胞菌，革兰阳性细菌金黄色葡萄球菌，化脓性链球菌，白假丝酵母菌甚至多重耐药的金黄色葡萄球菌和耐万古霉素的屎肠球菌，表现出广谱的抗微生物活性，在生理范围内增加盐浓度并不会降低BD-3的抗微生物活性，BD-3的浓度即使到达500 g/ml也不会产生明显的溶血3,8。BD-3还能趋化单核细胞，在正常肺组织中表达很少，BD-3基因5，端有转录因子STAT结合位点，BD-3的表达调节呈非NF-B依赖形式，所以TNF-，IL-1和IL-6都不能上调其表达9。而IFN-发挥效应的信号传导通路主要是JAK-STAT途径10，所以其能上调BD-3的表达。侵入机体细菌的组分革兰阴性细菌的脂多糖和革兰阳性细菌的脂磷壁酸通过Toll样受体和CD14分子激活肺巨噬细胞分泌IFN-11，IFN-进而上调气道上皮细胞和肺泡上皮细胞表达BD-3，所以N组BD-3的表达呈强阳性。上皮细胞分泌的BD-3和BD-3趋化来的巨噬细胞有助于杀灭细菌或者限制细菌的蔓延。V组的肺炎显著重于N组，2组接种的MRSA数量相同，唯一的不同是V组在接种前进行了4 h的保护性机械通气，说明4 h的保护性机械通气已经造成了一定程度的肺损伤。在机械通气的患者，气管插管使有菌的上呼吸道和无菌的下呼吸道直接相通，口咽部定植的细菌和胃肠道返流的细菌从气管套囊周围渗漏到下呼吸道引起VAP12。本实验使用的是清洁级大鼠，并引入外源性的细菌，与实际的病理生理过程有一定的区别。先期的离体研究发现4 h 的机械拉伸能显著抑制IFN-诱导的肺泡上皮细胞BD-3的表达13，本在体实验说明4 h的保护性机械通气也能显著减少支气管上皮细胞和肺上皮细胞BD-3的表达。BD-3表达减少不利于细菌的局限和去除，所以V组的肺细菌浓度和菌血症的发生率显著高于N组。综上所述，4 h的保护性机械通气后经气管接种2109 cfu的MRSA能成功制作MRSA VAP大鼠模型，BD-3表达减少可能是MRSA VAP显著重于非通气肺炎的原因之一。参考文献1 Chastre J , Fagon JY. Ventilator-associated pneumonia . Am J Respir Crit Care Med , 2002 , 165:867-903.2 Dominguez AA , Arango MV , Torres A. Treatment failure in patients with ventilator-associated pneumonia. Semin Respir Crit Care Med , 2006 , 27:104-114.3 Harder J , Bartels J , Christophers E , et al. Isolation and characterization of human beta -defensin-3, a novel human inducible peptide antibiotic. J Biol Chem , 2001 , 276:5707-5713.4 Menten M , Bailey S , Debone F , et al. Pneumonia in children. J Infect Dis , 1932 , 51:254-267.5 Rouby JJ , Martin De Lassale E , Poete P , et al. Nosocomial bronchopneumonia in the critically ill. Histologic and bacteriologic aspects. Am Rev Respir Dis , 1992 , 146:1059-1066.6 Torres A , Fabregas N , Arce Y , et al. Histopathology of ventilator-associated pneumonia (VAP) and its clinical implications. Infection , 1999 , 27:71-76.7 武庆平 , 姚尚龙 , 方向明. -防御素-2在呼吸机相关性肺炎中的表达. 中国危重病急救医学 , 2005 , 17:353-356.8 Maisetta G , Batoni G , Esin S , et al. In vitro bactericidal activity of human beta-defensin 3 against multidrug-resistant nosocomial strains. Antimicrob Agents Chemother , 2006 , 50:806-809.9 Garcia JR , Jaumann F , Schulz S , et al. Identification of a novel, multifunctional beta-defensin (human beta-defensin 3) with specific antimicrobial activity. Its interaction with plasma membranes of Xenopus oocytes and the induction of macrophage chemoattraction . Cell Tissue Res , 2001 , 306:257-264.10 Takaoka A , Yanai H. Interferon signalling network in innate defence .Cell Microbiol , 2006 , 8:907-922.11 Martin TR, Frevert CW. Innate immunity in the lungs. Proc Am Thorac Soc , 2005 , 2:403-411.12 Safdar N , Crnich CJ , Maki DG. The pathogenesis of ventilator-associated pneumonia: its relevance to developing effective strategies for prevention. Respir Care , 2005 , 50(6):725-741.13 桂平 , 武庆平 , 姚尚龙 , 等. 机械拉伸对-干扰素诱导肺泡上皮细胞人-防御素-3表达的影响.中华急诊医学杂志 , 2022 , 17:606-609.内容总结1-防御素-3BD-3是防御素家族中的一个成员，是上皮细胞分泌的一种重要的固有免疫效应分子，具有广谱高效的抗微生物活性，包括多重耐药的金黄色葡萄球菌，BD-3还能趋化单核细胞3