第6章蛋白质分离技术.pptx

Chapter 7 蛋白质的分离、纯化和蛋白质的分离、纯化和表征表征一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质 两性电解质两性电解质 可解离基团：可解离基团：-NH3+-COO-侧链上的功能基团见（书侧链上的功能基团见（书P290）氨基酸有的化学性质蛋白质就有。氨基酸有的化学性质蛋白质就有。PI=正负电荷相等，净电荷为零时的正负电荷相等，净电荷为零时的pH.（见书（见书P291表表7-2）二、蛋白质分子大小与形状二、蛋白质分子大小与形状从从60001000000Dalton(道尔顿）道尔顿）为纪念原子学说（为纪念原子学说（1803年）创始人年）创始人John Dalton.Dalton=12C原子绝对质量原子绝对质量1/12=1.66033 10-27（一）最低分子量测定（一）最低分子量测定（二）滲透压（二）滲透压（Osmotic pressure）测分子量）测分子量在理想的溶液中在理想的溶液中Osmotic pressure 与溶质浓度的关系为；与溶质浓度的关系为；=C=溶质浓度溶质浓度 R=气体常数（气体常数（0.082)T=绝对温度绝对温度 =渗透压渗透压CRTMM=RTLim cco截距C/c分子量分子量1万万10万范围内，结果可靠万范围内，结果可靠（三）蛋白质的扩散（三）蛋白质的扩散扩散系数（扩散系数（diffusion coeffecient)(四）四）蛋白质的沉降分析蛋白质的沉降分析超速离心（超速离心（Ultracentrifuge)测定蛋测定蛋白质分子量白质分子量1.沉降速度法（沉降速度法（Sedimentation velocity）沉降系数（沉降系数（Sedimentation coeffecient)10-13=Svedberg 用用 S 表示，生物分子在表示，生物分子在1 10-13200 10-13秒范秒范围。围。Hoemglobin 沉降系数沉降系数4.46S=4.46 10-13秒秒M=RTSD（1-）（1-）为浮力因子，其中）为浮力因子，其中 为偏为偏微比容微比容=0.74cm3/g；=容剂密度容剂密度（g/cm3)D=扩散系数扩散系数R=气体常数（气体常数（8.314J/(k.mol)T=绝对温度（绝对温度（K）S=沉降系数沉降系数2.沉降平衡法沉降平衡法 M=2RTln(C2/C1)(1-)2(x22-x21)(五）凝胶过滤法（五）凝胶过滤法（gel filtration)分子筛效应：分子筛效应：大分子先洗脱下来大分子先洗脱下来 小分子后洗脱下来小分子后洗脱下来(五）凝胶过滤法五）凝胶过滤法（gel filtration)分子筛效应：分子筛效应：大分子先洗脱下来大分子先洗脱下来 小分子后洗脱下来小分子后洗脱下来(六）六）SDS-PAGE 蛋白质测分子量蛋白质测分子量（sodium dodecyl sulfate polyacylamide gel electrophoresis)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-蛋白质形成复合物，蛋白质形成复合物，1.4克克SDS与与1克蛋白质结克蛋白质结合，相当于每两个氨基酸残基结合一个分子的合，相当于每两个氨基酸残基结合一个分子的SDS。这样，蛋白质的原有电荷效应被覆盖，带有相同密度这样，蛋白质的原有电荷效应被覆盖，带有相同密度负电荷，分子量大小与迁移率成正比。负电荷，分子量大小与迁移率成正比。SDS改变蛋白质分子单体构象，全部变成似雪茄改变蛋白质分子单体构象，全部变成似雪茄烟形的长椭圆棒型。烟形的长椭圆棒型。肌球蛋白肌球蛋白半乳糖苷酶半乳糖苷酶 糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶 牛血清白蛋白牛血清白蛋白卵清蛋白卵清蛋白 碳酸酐酶碳酸酐酶 大豆胰蛋白酶抑制剂大豆胰蛋白酶抑制剂溶菌酶溶菌酶三、蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀三、蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀（一）蛋白质的胶体性质（一）蛋白质的胶体性质蛋白质溶液是一种分散系统（蛋白质溶液是一种分散系统（disperse system),蛋白质蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质（分子颗粒是分散相，水是分散介质（disperse medium)。属胶体系统（。属胶体系统（colloidal system)蛋白质1.质点大小在质点大小在1-100nm范围内作范围内作Brown movement.2.质点带有相同电荷，相互排斥质点带有相同电荷，相互排斥3.质点与溶剂形成水化层（质点与溶剂形成水化层（hydration mantle),有了水化层，相互间不易靠拢而聚有了水化层，相互间不易靠拢而聚集集。分散相质点在胶分散相质点在胶体系统中保持稳体系统中保持稳定的条件定的条件（二）蛋白质的沉淀（二）蛋白质的沉淀破坏了上述胶体溶液的稳定条件就会沉淀。破坏了上述胶体溶液的稳定条件就会沉淀。方法：方法：1.盐析法盐析法(salt out)(NH2)4SO4,Na2SO4,NaCl 2.有机溶剂有机溶剂 甲醇，乙醇，甲醇，乙醇，丙酮丙酮 3。重金属盐重金属盐 pH pIpH pI时时 P P带负电荷与带负电荷与 HgHg2+2+,Pb,Pb2+2+,Cu,Cu2+2+,Ag,Ag+形成不溶性形成不溶性盐盐 4.4.生物碱生物碱 pHpIpHpI时，时，P P+生物碱生物碱 沉淀沉淀 5.加热变性沉淀法加热变性沉淀法 少量盐加速蛋白质加热凝固。少量盐加速蛋白质加热凝固。四、蛋白质分离提纯的一般原则四、蛋白质分离提纯的一般原则（separation and purification)1.Pretrestment（匀浆，匀浆，研磨，超声波研磨，超声波）2.Rough fractionation（盐析，等电点，（盐析，等电点，有机溶剂）有机溶剂）3.Fine fractionation （层析）（层析）五、蛋白质混合物的分离方法五、蛋白质混合物的分离方法（一）根据分子大小不同（一）根据分子大小不同1.超过滤（超过滤（ultrafiltration)2.密度梯度离心（密度梯度离心（density gradient centrifugal)介质：蔗糖，介质：蔗糖，Ficolls,3.凝胶过滤层析（凝胶过滤层析（gel filtration chromatography)shephadex G-50,G-100（二）利用溶解度差别分离蛋白质（二）利用溶解度差别分离蛋白质1。等电点沉淀。等电点沉淀2。蛋白质的盐溶和盐析。蛋白质的盐溶和盐析3。有机溶剂分级法。有机溶剂分级法（三）根据电荷不同的分离方法（三）根据电荷不同的分离方法1。电泳（。电泳（electrophoresis)滤纸；薄膜滤纸；薄膜 粉末平板（硅胶、纤维素粉）粉末平板（硅胶、纤维素粉）细丝（尼龙丝、人造丝）细丝（尼龙丝、人造丝）凝胶电泳（凝胶电泳（PAGE、Agarose)圆盘电泳（圆盘电泳（disc)平板电泳平板电泳双向电泳双向电泳等电点聚焦（等电点聚焦（isoelectric focusing)2.离子交换层析离子交换层析2.离子交换层析离子交换层析介质：介质：CMCCM-Sephadex G-50DEAE-纤维素纤维素DEAE-Sephadex A-25 A-50QAE-Sephadex A-50原理见动画片原理见动画片原理见动画片原理见动画片(四）蛋白质的选择吸附分离四）蛋白质的选择吸附分离（adsorption chromatography)介质：活性碳介质：活性碳 硅胶硅胶 氧化铝氧化铝 磷酸钙磷酸钙 硅藻土硅藻土（五）亲和层析法（五）亲和层析法 抗原抗原抗体抗体 酶酶辅酶辅酶 酶酶抑制剂抑制剂六、蛋白质含量测定与纯度鉴定六、蛋白质含量测定与纯度鉴定Folin-酚法（酚法（Lowry法）法）凯氏定氮法（标准方法）凯氏定氮法（标准方法）紫外吸收法（紫外吸收法（280nm)Bradford法（考马斯亮蓝结合法）可测法（考马斯亮蓝结合法）可测 g蛋蛋白质白质纯度鉴定：纯度鉴定：PAGE，SDS-PAGE，HPLCA280/A260=1.75