PCR扩增实验操作步骤.doc

PCR扩增反应
一、实验原理
PCR：是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外dNTP分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链DNA；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。
PCR反应分3步：①变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106~7拷贝。
变性
延伸
退火
图 反应历程

二、实验材料
1·模板：细菌DNA 2· TsgDNA聚合酶 3·dNTP混合液
4·10倍浓度PCR缓冲液 5·2.5mmol/LMgCl2 6·RAPD引物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S97 S103 S110 S115 7·提取细菌DNA的相关试剂
三、操作步骤
1．细菌染色体DNA的提取（见上一组）
2．RAPD反应体系的配置
试剂
浓度
加入量
加 样 顺 序 —→
10倍浓度PCR缓冲液

2.5ul
氯化镁溶液
2.5mmol/L
2.5ul
dNTP混合液
各2.5mmol/L
2.5ul
上游引物
2.5umol/L
2.5ul
下游引物
2.5umol/L
2.5ul
细菌DNA

25~50ng 2.5ul
TsgDNA聚合酶

2.5U
超纯水

10ul
总体积
25ul

3·反应程序：
将RAPD反应试剂加入EP管中
轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发，盖好盖子
打开PCR反应仪输入以下反应数据
l 94 摄氏度预变性5min
l 94摄氏度变性40s
l 40摄氏度退火40s
l 72摄氏度延伸1min
将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min
仪器为Model MyGene 25 Plus

三、注意事项
1、PCR反应体系中DNA样品及各种试剂的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。
2、为避免污染凡是用在PCR反应中的Tip尖、离心管、蒸馏水都要灭菌；吸每种试剂时都要换新的灭菌Tip尖。
3、加试剂时先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶。
4、置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应。
5.引物条件 首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。