DB15∕T 3147-2023 番茄颈腐根腐病病原菌鉴定规程(内蒙古自治区).pdf

ICS 65.020 CCS B 16 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 31472023 番茄颈腐根腐病病原菌鉴定规程 Technical code of practice for identifying pathogen of fusarium crown and root rot in tomato 2023-08-25 发布 2023-09-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 31472023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古农业大学。本文件主要起草人：杨永青、刘燕、高婧、张磊、宋培玲、皇甫海燕、贺小勇、史志丹、孙琴霞、张欣昕、李秀萍、莎娜。DB15/T 31472023 1 番茄颈腐根腐病病原菌鉴定规程 1 范围 本文件规定了番茄颈腐根腐病样品采集分离和保存、病原菌的致病性测定、病原菌的鉴定方法、结果判定的技术要求。本文件适用于番茄颈腐根腐病病原菌的室内鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T 2589 植物病原真菌检测规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。番茄颈腐根腐病 fusarium crown and root rot 由尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型（Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici，FORL）引起的一种土传病害，主要症状表现为在土壤与植株茎基部交接处、环绕茎基部有明显的深褐色病斑，染病植株直立但长势明显缓慢且下部叶片出现变黄、萎蔫的症状，病株的主根、侧根严重褐变、腐烂脱落，维管束褐变，被侵染的植株在35片叶的幼苗期从发病部位折倒而萎蔫死亡。致病性 pathogenicity 病原物所具有的损害寄主并引起病害的特性。4 鉴定依据 以番茄颈腐根腐病发病症状、病原菌形态学特征、PCR 产物及测序结果等为鉴定依据。番茄染病植株的发病症状及尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型的形态学特征参见附录 A。5 主要仪器和试剂 主要仪器 DB15/T 31472023 2 高压灭菌锅、超纯水系统、恒温培养箱、超净工作台、光学显微镜、高速冷冻离心机、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像系统、旋涡振荡器、电子天平等。主要试剂 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）、绿豆琼脂培养基（绿豆粉 6 g，琼脂粉 4 g，溶于 200 mL 蒸馏水）；真菌基因组提取试剂盒、2PCR Mix、琼脂糖、50TAE 电泳液、DL2000 DNA Marker，次氯酸钠、无水乙醇、硫酸链霉素等均为国产分析纯试剂。6 样品采集、分离和保存 样品采集及分离 在番茄种植地采集疑似病株，用于病原菌的分离，冷藏保存备用，同时记录采样地点和时间。按照 SN/T 2589 进行发病组织分离培养，将表面消毒的 10 个组织块置于 PDA 平板（含 500 g/mL硫酸链霉素），于 25 恒温培养。5 d 后待培养皿中组织块周围长出菌丝，从菌落边缘挑取少量菌丝体和分生孢子置于无菌水中制成分生孢子悬浮液，取 100 L 涂布于 PDA 培养基，连续纯化 23 次获得病原菌的纯培养物。以“年份-采样地-序号”进行编号，备用。菌种保存 在长满菌丝的 PDA 培养基 3/4 处，用打孔器取直径为 5 mm 的菌丝块，装入 1.5 mL 的无菌离心管或菌种保存管中（48 个菌丝块/管），加入 1.0 mL2.0 mL 已灭菌的 40%甘油或 20%二甲基亚砜，液氮速冻后-80 低温冰箱中保存 612 个月；或将病原菌的 PDA 平板用封口膜密封，保存于 4 8 冷藏 12 个月。7 病原菌的致病性测定 种子处理及育苗 播种前，种子放入 50 55 的温水中浸种 15 min20 min,基质提前在 105 烘箱中干热处理 2 h，使用灭菌基质在 72 孔穴盘中育苗。病原菌回接 病原菌于 PDA 平板上活化培养 5 d，接种于马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）中，25、150 r/min振荡培养 7 d，4 层无菌纱布过滤，用血球计数板计数并调节孢子液浓度至 1107 个/mL；番茄幼苗长至 34 叶期，每株幼苗根系周围灌入 30 mL 孢子液，同一病原菌接种 10 株番茄幼苗，以接种无菌水的5 株幼苗为对照。置于 20 2、16 h 光照/8 h 黑暗人工气候室中。接种 30 d 后，观察并记录发病情况。若植株发病症状与田间症状一致，需从发病植株上再次分离、鉴定病原菌。8 病原菌的鉴定方法 形态学鉴定 25 恒温条件下培养 7 d，病原菌在 PDA 培养基或绿豆培养基上气生菌丝发达，菌丝呈白色绒毛状、容易挑起，菌落圆形、背面产生紫色色素；PDB 振荡培养条件下，病原菌产生卵圆形的小型分生孢DB15/T 31472023 3 子，无隔或 1 个隔膜；大型分生孢子呈镰刀型，多为 12 个隔膜；连续培养 5 d 后可见顶生、间生或串生的厚垣孢子，厚垣孢子多数呈球形，半透明。参见附录 A。PCR 鉴定 8.2.1 基因组 DNA 的提取 将 20 mL PDB 装入 50 mL 三角瓶，121 高压灭菌 15 min，冷却后接种病原菌，25、150 r/min振荡培养 3 d4 d，收集菌丝，采用真菌基因组提取试剂盒提取 DNA。1%琼脂糖电泳检测后，保存于-20，备用。8.2.2 PCR 检测鉴定 利用真菌核糖体基因转录间隔区 ITS 通用引物 ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和 ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)扩增病原菌的 rDNA-ITS 区，同时采用翻译延长因子 TEF-1的扩增引物ef1(5-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3)和 ef2(5-GGAGGTACCAGTCATCATGTT-3)扩增 TEF-1序列，PCR 扩增的目的片段长度分别为 530 bp、750 bp，测序结果在 NCBI 数据库中进行 BLAST 比对，待测菌株扩增片段的序列与尖孢镰刀菌的相应序列相似性均超过 99%。PCR 反应体系及扩增条件参见附录 B。再采用尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型特异性引物进行 PCR 扩增，根据目的条带将番茄颈腐根腐病菌（FORL）和番茄枯萎病菌（FOL）的不同生理小种进行区分，引物序列及 PCR 扩增方法参见附录B。9 结果判定 经形态学鉴定，与附录A 描述的形态相似的分离物可初步判断为镰刀菌属；病原菌的ITS和TEF-1基因扩增产物与目的片段大小一致，且测序结果与数据库中尖孢镰刀菌的相似度超过99%，可判定为尖孢镰刀菌；通过特异性引物PCR扩增，引物unif/unir和sprlf/sprlr分别扩增得670 bp和947 bp目的条带，而sp13f/sp13r、sp23f/sp23r无条带，则判定为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型（FORL）。DB15/T 31472023 4 A A 附录A （资料性）番茄颈腐根腐病的典型症状及病原菌形态学描述 番茄定植后出现植株直立但长势明显缓慢且下部叶片出现变黄、萎蔫的症状（红色虚线框内）见图A.1 中 A。植株主根、侧根严重褐变、腐烂脱落，不长新根（C图为B图红色框内区域放大）见图A.1中B、C。图A.1 番茄颈腐根腐病田间发病植株及症状 颈腐根腐病菌分离株在PDA培养基上的菌落正面（A）和反面（B）见图A.2。图A.2 颈腐根腐病菌分离株在 PDA 培养基上的菌落正面（A）和反面（B）DB15/T 31472023 5 PDB培养条件下厚垣孢子，间生、顶生或串生，圆形略透明见图A.3中A、D、E、F。绿豆培养基上产生大量分生孢子，形状呈镰刀状；大型分生孢子多为12个隔膜，小型分生孢子呈卵圆形，通常无隔或有1个隔膜；图B中标尺a表示50 m，其余均为20 m，如图C中标尺b所示，见图A.3。图A.3 颈腐根腐病菌分离株的孢子形态 DB15/T 31472023 6 B B 附录B （资料性）PCR 反应体系及扩增条件 PCR 扩增病原菌 ITS 和 EF-1基因的 PCR 反应体系（25 L）为：2PCR master Mix 12.5 L,正向引物、反向引物（10 M）各 0.5 L，DNA 模板（50100 ng/L）1.0 L，ddH2O 10.5 L。PCR 扩增条件:94 预变性 5 min；94 变性 1 min，55 退火 30 s，72 延伸 1 min，35 个循环；72 延伸 10 min。B.1 尖孢镰刀菌专化型特异性引物见表 B.1 中所示：表B.1 引物名称 序列 5-3 片段长度 unif ATCATCTTGTGCCAACTTCAG 670672 bp unir GTTTGTGATCTTTGAGTTGCCA sp13f GTCAGTCCATTGGCTCTCTC 445 bp sp13r TCCTTGACACCATCACAGAG sp23f CCTCTTGTCTTTGTCTCACGA 518 bp sp23r GCAACAGGTCGTGGGGAAAA sprlf GATGGTGGAACGGTATGACC 947 bp sprlr CCATCACACAAGAACACAGGA PCR 反应体系（25 l）同 B1，PCR 扩增条件:94 预变性 5 min；94 变性 1 min，62 退火 30 s，72 延伸 1 min，共 35 个循环；72 延伸 10 min。B.2 PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测目的片段大小，委托测序公司测序。DB15/T 31472023 7 参考文献 1 王梦蕊,刘淑梅,侯丽霞,等.番茄颈腐根腐病抗性鉴定技术的建立及抗性种质资源筛选.中国农业科学,2022，55(4):707-718 2 Hirano Y,Arie T.PCR-based differentiation of Fusarium oxysporum ff.sp.lycopersici and radicis-lycopersici and races of F.oxysporum f.sp.lycopersici.Journal of General Plant Pathology，2006，72(5):273-283