微生物学给.pptx

環境微生物學許美芳副教授 大仁科技大學環境資源管理系mfshuemail.tajen.edu.tw教師個人介紹1981 1986逢甲大學環境科學系講師1986迄今 大仁科大 環境資源管理系副教授專長:微生物、環境監測技術、ISO 17025實驗室認證研究領域:環境監測技術生物、化學、儀器分析：水、土壤污染監測，食品及農產安全性、保健產品功能性評估、離體外生物檢測技術(In Vitro Bioassay)。專業服務:實驗室認證輔導、社區營造、環境教育、環保署代檢測機構現場評鑑專家、消基會檢測組委 員、地方環保局委員、環境教育輔導委員、德國杜夫萊茵TUV公司Life-care line大中華區技術總監微生物(Microorganisms)定義：存在於自然界中，構造簡單、個體微小，能獨立生存，通常無法以肉眼觀察到需藉助顯微鏡觀察之一群生物。而研究這些微小生物的相關科學稱之為 微生物學(Microbiology)種類：細菌、真菌、藻類、病毒、原生動物及 多細胞寄生蟲生物界的分類1866年 Haeckel 發表了三界說：三界說動物界植物界原生生物界(顯微鏡下的微小生物)1963年 Whiatter 提出五界說：五界說 真核生物界 原核生物界 動物界 植物界 真菌界 原生生物界 藍綠藻 細菌酵母菌(yeast)：無絲狀體 黴菌(mold)：有絲狀體 植物性：藻類(矽藻、紅藻)動物性：原生動物(草履蟲)巴斯德奠定了生源論後，與顯微鏡的問世，人們方知除了動植物外尚有肉眼所無法觀察的微小生物。1930s 電子顯微鏡被發明問世，提升顯微鏡的放大倍率，於是發現原生生物界內的各類生物細胞內部構造不同,配合生物化學科技的發展下，也了解相同的細胞構造間成份也可能不同。微生物演進史最早發現：1665年，英國人虎克(Hooke)，製作單眼顯微鏡觀察軟木栓薄片之細胞。1676年，荷蘭人雷文霍克(Leeuwenhoek)，製成雙眼顯微鏡觀察池水，揭開了包括細菌、藻類、真菌及原生動物之神秘面紗。細菌學之父。生命發生說的爭論：自然發生說-亞里斯多德(希臘)生源論-巴斯德(法)-微生物學之父黃金時期：19世紀後半 1850年1880年，巴斯德發現水果發酵及酒的 酸敗是由微生物引起。巴氏消毒法：62,30秒；71.5,15秒 1878年李斯特(Lister)以連續稀釋法得到純培養 菌株。1876年德國柯霍(Koch)醫生，從患有炭疽菌病 之患者身上分離出炭疽桿菌(Bacillus anthrax)。由此微生物與疾病關係，奠定了病原論。並提出柯霍假說。1892年，伊凡諾司基(Iwanosky)，最先發現病毒的人。發現菸草鑲嵌病毒，並證明其可通過細瓷濾器。濾過性病毒。1929年，佛來明(Alexander Fleming)，發現青黴菌的代謝物能抑制葡萄球菌的增殖，此代謝物為青黴素(penicillin)。1944年，魏斯曼(Waksman)，發現鏈黴素(streptomycin)。命名1735年，瑞典生物學家林奈氏(Carolus Linnaeus)的二名法。學名：屬名+種名，表示法：斜體或畫底線。例：Escherichia coli Escherichia coli學名命名原則(常見學名表示法)屬名屬名+種名種名 屬名屬名+Species Bacillus sp.產生黃色素,意指枯草桿菌屬內之某一個種會產生黃色素 Bacillus spp.有產胞能力,意指枯草桿菌屬內的所有種都具有產胞能力 屬名屬名+種名種名+發現者發現者+et.al Escherichia coil Castellani et.al 屬名屬名+種名種名+（原發現者）（原發現者）+現發現者現發現者 Bacillus subtilus(Ehrenberg)Cohn 屬名屬名+新種名新種名+（原發現者）（原發現者）+現發現者現發現者 屬名屬名+種名種名+var.+變種名變種名 Bacillus subtilus var.niger,意指Bacillus niger由Bacillus subtilus 變異而來命名的依據形態形態 Lactobacillus(乳酸桿菌屬)；Sarcina(八聯球菌屬)；Micrococcus(微球菌屬)；Streptococcus(鏈球菌屬)；Clostridium(梭狀桿菌屬)來源或生存處來源或生存處 Escherichia coli 指存在大腸中生理狀態生理狀態 Aerobacter aerogenes-生氣體；Acetobacter aceti-生醋酸；Clostridium butyrium-生丁酸。形成顏色形成顏色 Staphylococcus aureus 生”金黃色”病原性病原性 Salmonella typhosa 表”傷寒熱”習性習性 Streptococcus(鏈球菌)mesenteroids(腸系膜）發現人名發現人名 Escherichia(艾歇利希氏菌屬)；Neisseria(奈氏菌)；Erwinia(歐文氏桿菌)研究範疇範疇內容微生物形態學 研究微生物體外部形狀及內部構造之科學。微生物生理學 研究微生物體各胞器機能和生理之科學。微生物分類學 依微生物的特性分門別類研究的科學微生物遺傳學 研究微生物體遺傳、變異的科學微生物演化論 研究微生物在地球上之發生及演變之科學微生物生態學 研究微生物在環境中生活史及其所扮演之角色應用微生物學 研究微生物在不同領域之應用科學微生物與生活名稱弊利細菌污染食物、引發疾病(沙門氏菌、金黃色葡萄球菌)食品工業(醋酸菌-醋；黃麴菌-醬油)污染物生物處理法低成本、高效率、無二次公害 自然界物質循環病毒致病(日本腦炎、疱疹病毒)基因轉殖及遺傳工程干擾素製作真菌生化武器、致病、食物腐敗(毒菇、麵包上的黑黴菌)食用菌、製造抗生素；食品釀造(青黴菌-青黴素；酵母菌-釀酒)藻類污染環境(甲藻-紅潮，污染水質)供養分及氧氣供其他生物使用(綠藻、昆布之食用顯微鏡的種類放大原理使用特性光學顯微鏡明視野顯微鏡暗視野顯微鏡紫外光顯微鏡螢光顯微鏡位相差顯微鏡電子顯微鏡穿透式顯微鏡(TEM)掃描式顯微鏡(SEM)掃描穿透式顯微鏡(STEM)電子微探分析顯微鏡(EPMA)種類原理明視野顯微鏡以自然光或電源光線為光源，使檢體本身呈現暗的狀態，視野則呈現明亮態。暗視野顯微鏡加裝特殊聚光器，誘導透光途徑，使光線自標本偏離，造成鏡檢物呈現明亮態，背景呈現暗影。紫外光顯微鏡以紫外線為光源，因其波長(180400nm)較可見光短，所以可提高解像力。紫外光會傷害眼睛，不能直接目視需投影至螢幕。螢光顯微鏡以水銀燈為光源，其所放出波長較短的紫外光線通過被觀察的物體以激發檢體放出綠色螢光物質。位相差顯微鏡在一般光學顯微鏡上加特殊之位相差物鏡及聚光器，利用菌體各部位密度的差異，對光線折射的不同，藉以分辨活細胞內不同的構造。電子顯微鏡以電子束為光源，當檢體暴露於電子束內時可呈現三度空間(立體)的影像，或用以觀察檢體之內部構造。種類應用對象明視野顯微鏡 未染色之細菌、黴菌、酵母菌、藻類及原生動物。暗視野顯微鏡 觀察活菌體在活的狀態懸浮液中特殊形態之觀察。螢光顯微鏡檢視螢光反應，可應用於螢光抗體技術，因具有相當高之專一性,有助於臨床診斷技術。位相差顯微鏡檢視較大活菌體之細胞結構，如酵母菌、藻類、原生動物及一些細菌。電子顯微鏡檢視很小的菌體，如病毒及菌體之超微小構造。無法檢視活細胞。各類顯微鏡用途標本製作法：標本製作法：塗抹法：觀察形狀，大小，構造。懸滴法：可檢視活細胞。可觀察出：菌體細胞正常排列方式；細胞分裂時細胞的變化及其速率；運動性的鑑別：自主運動：鞭毛；路線呈直線規則，速度快速。布朗運動：為粒子與周圍流體的分子產生不平衡的碰撞而做 不停的攪動。路線呈不規則，速度緩慢。鏡檢方式鏡檢方式：乾式：放大600倍以下時使用。油浸式：需行高倍率放大時使用。避免光被空氣折射掉,在物鏡與玻片間滴油。染色技術由於微生物之細胞很小，因此一般光學顯微鏡並不容易觀察，所以常需藉助染劑(Dye)與細胞間的物理或化學作用，使細胞上色、增加對比以便於觀察。原理：細胞表面或細胞內活化位置與染劑發生離子交換。作用方式：低濃度作用長時間較高濃度作用短時間較好。染色目的：鑑別不同菌體的型態、結構，及提高放大效果 並作為分類之依據染劑的種類依帶電荷分種類組成染劑例子鹼性染劑帶顏色之陽離子與不帶顏色之陰離子組成甲烯藍細胞核及細胞粒等酸性部位染色酸性染劑由無色之陽離子與帶顏色之陰離子組成伊紅或剛果紅的鈉鹽細胞質等鹼性物質之染色中性染劑由酸性與鹼性染劑形成的複合鹽類，所以不含可解離的基團。甲烯藍與伊紅形成之複合體可自由進出死細胞之細胞膜，與死細胞結合常用鑑別染色技術染色法使用染劑用途結果革蘭氏染色法(Grams stain)結晶紫、碘液、95%酒精、番紅分G(+)與G(-)G(+)紫色G(-)紅色芽胞染色(spore stain)孔雀綠、番紅分 芽胞及菌體芽胞綠色菌體紅色鞭毛染色(flagella stain)明礬、鹼性洋紅觀察鞭毛鞭毛紅色菌體藍色抗酸性染色(acid fast stain)石碳酸洋紅、酸酒精、甲烯藍觀察分枝桿菌屬與非抗酸細菌抗酸菌紅色非抗酸菌藍色莢膜染色法(capsule stain)印地安墨觀察莢膜莢膜淡藍色透明菌體藍紫色微生物的培養菌體化學組成份水分水分 主要作為代謝時的溶媒。細胞增殖期含量較高，孢子含量較少。醣醣類類 多存在黏質層、莢膜(多醣體)、細胞壁(胜肽聚醣)及細胞質中；作為 能量貯存物質(如酵母菌的肝醣)及構造物質(纖維素-藻類細胞壁)用。蛋白質蛋白質 為細胞之基本構成分(核蛋白、脂蛋白、醣蛋白)，及生化反應中酵素 的組成份。脂質脂質 主要構成細胞膜、核膜、粒腺體膜之成分(磷脂質)。核酸核酸 為DNA及RNA之構成份，DNA(遺傳物質)含量一定，存在細胞核內；RNA則於蛋白質合成旺盛之生長對數期時最高。維生素維生素 以維生素B群最多，作為輔酵素之構成份，重要者有B1、泛酸、菸鹼 酸 等。灰份灰份 含量較多者Na,K,Ca,Mg,P,S,Cl,Fe，在細胞中以有機或無機態存在影響微生物生長的因子外在因子外在因子(環境因子環境因子)氣體 溫度 pH Aw或滲透壓 微生物間的相互作用內在因子(營養要求)能源 碳源 氮源 無機鹽類 維生素 影響微生物生長的因子外在因子(環境因子)溫度種類生長溫度(最適溫度)實例嗜低溫菌020(15)冷藏食品腐敗菌嗜中溫菌2040(37)人體和動植物病原菌、腐敗菌嗜高溫菌 40100或以上(55)溫泉及堆肥影響微生物生長的因子外在因子(環境因子)pH種類生長範圍實例嗜酸性1.55.5醋酸菌、乳酸菌、酵母菌、黴菌(pH46)嗜中性6.57.5一般細菌(pH6.87.2)腐敗菌(pH6.57.5)；病原菌(pH68)嗜鹼性8.511.5霍亂弧菌(pH8.59.5)、硝化菌、根瘤菌、尿素分解菌、放線菌細胞代謝養料會產生酸或鹼，造成pH的變化。pH的改變會影響細胞內酵素活性，因而影響細胞的生長。通常會添加緩衝溶液，可使培養基不因酸或鹼的形成而改變pH值。影響微生物生長的因子外在因子(環境因子)Aw或滲透壓微生物種類Aw實例一般細菌0.9金黃色葡萄球菌一般酵母菌0.88麵包酵母菌一般黴菌0.80醬油黑麴菌好鹽性細菌0.75腸炎弧菌生長在含3%NaCl之培養基中耐旱性黴菌0.70Xeromyces bisoporus 存在半乾性食品耐滲透壓酵母菌0.63Zygosaccharomyces蜜餞、果醬 等之腐敗菌培養基含微生物生長所需之養分的培養液培養基種類依組成分天然培養基：天然培養基：牛奶、馬鈴薯等含有多樣天然營養素者。化學合成培養基：化學合成培養基：依微生物營養之需求，以一定含量之特定化學成分所 配製而成者。複合培養基：複合培養基：於化學合成培養基中，再添加一些有機抽出物的成分 (如：酵母萃取液、牛肉萃取液、血清)而組成者。種類配方天然培養基脫脂乳粉100g；蒸餾水1000mL化學合成培養基檸檬酸培養液：磷酸氫銨鈉 1.5g；檸檬酸鈉 3g；磷酸氫二鉀 1g；硫酸鎂 0.2g；蒸餾水1000mL複合培養基營養肉湯(NB)：蛋白腖10g；牛肉抽取物3g；氯化鈉5g；蒸餾水1000mL培養基種類依形態分液體培養基：液體培養基：培養基中無添加洋菜或明膠等硬化劑，以利於微生物 的大量繁殖及化學藥劑加入的直接反應。半固體培養基：半固體培養基：培養基中含0.5%或更少的洋菜，使培養基變成半固體 狀態，方便觀察微生物在培養基中的運動或產氣體的 情形。固體培養基：固體培養基：培養基中添加1.22%洋菜，當培養基冷凝後會變成 固體狀態，以利於微生物的純化、計數及保存。培養基種類依作用分基礎培養基基礎培養基(basical medium)：含微生物生長之基本營養素者。滋養培養基滋養培養基(enriched medium)：在基礎培養基中添加特殊成分，使難於一般培養基生長的菌體能生長。如血清。選擇培養基選擇培養基(selective medium)：於培養基中添加特殊物質，選擇性的抑制某些種類菌體 生長，使欲分離培養的菌體藉此篩選出來。如：培養基中加入高濃度鹽、抗生素 等。鑑別培養基鑑別培養基(differential medium)：培養基中加某種特殊物質，用來區分微生物對它利用情形，也藉以鑑定特殊菌體。如：加血液-測該菌有無溶血能力。配方Lactose broth BGLB brothEMB agar蛋白腖(Peptone)乳糖(Lactose)牛肉抽出物(Beef extract)蛋白腖乳糖膽粉(Oxgall powder)煌綠(Brilliant green)蛋白腖乳糖伊紅(Eosin Y)甲烯藍(Methylene blue)磷酸氫二鉀(K2HPO4)洋菜微生物的培養法液態培養液態培養：將菌株接種在液體培養基中。(可動態)斜面培養斜面培養：將菌株接種在製成斜面之固體培養基中。穿刺培養穿刺培養：將菌株以接種針穿刺接種至固體培養基中。半固態穿刺培養半固態穿刺培養：將菌株以接種針穿刺接種至半固體 培養基中。平板培養 劃線培養劃線培養：利用接種環在培養皿平盤上之固態培養基 表面逐次劃直線，每次起始點均含蓋上次 直線之末段，使達到逐漸稀釋之效應。塗抹培養塗抹培養：將預先稀釋好的菌液滴在固體培養基上，再使用塗抹棒將之塗抹開。混合倒皿培養混合倒皿培養：將預先稀釋好的菌液加在含有溶融洋 菜培養基的試管中，經充分混合後，倒入培養皿中。微生物的生長世代時間(generation time)：母細胞經二分裂生殖形成兩個子細胞 所需之時間。g=t=tn3.3(log N-log N0)g:世代時間 t:某一培養時間 n:經過n代繁殖 N:開始培養時之菌數 N0:子代細胞總數 N=N02n 2n=N/N0 log2n=log(N/N0)0.3n=logN-logN0 n=(logN-logN0)/0.3=3.3(logN-logN0)微生物之生長測定計數測定：計數測定：平盤測定：平盤測定：在培養基中培養之後，測定樣品中的活菌數。每一平盤(9cm)菌落數以30300個為原則。(計活菌)特殊玻片顯微鏡測定：特殊玻片顯微鏡測定：用血球計數器檢視之。(死活菌均計)過濾法：過濾法：以濾膜過濾菌液，待培養後估算菌落數。(計活菌)以濾膜過濾菌液，乾燥後計數。(死活菌均計)主要是用來測定在某一環境下微生物的生長狀況及了解其特性計量測定：計量測定：乾燥菌體恆重測之：乾燥菌體恆重測之：將菌液經離心使菌體沉下或經過濾處理後，菌體以低 溫真空烘乾後，加以秤乾重。一般細菌為例：10-1210-13g/個。濁度法：濁度法：要完成檢量線。利用濁度計：菌數越多濁度越高，菌液透光率越低，透光率與細菌數成反比。利用吸光計：利用固定波長(500或650)照射，測其 光學密度(OD值)，值越高菌數越多。氮量測定：氮量測定：測定總氮量，以推估粗蛋白質量並換算成菌體量。生化活性測定：生化活性測定：如ATP高則菌數含量高。(計活菌)菌體內含有大量蛋白質，而氮是組成胺基酸必需成分。不同生物種類的含量則不同。一般生物的蛋白質中約含16%的氮蛋白質量16%=氮量總氮量0.16單一細胞蛋白質量細菌數例：今測得E.coli 細胞之總氮量為1.6mg 單一E.coli之細胞蛋白質量為1ng則有 1.6mg0.161ng/個10-2g10-9g/個107個每一活細胞所含 ATP 量是固定值。如食品上測牛奶內是否有菌可採用此法。利用螢火蟲發螢光的原理，而螢火蟲會發光的原因有：螢光物質 螢光酵素 將螢光物質、螢光酵素加在細菌(提供ATP)上，利用超音波振盪，反應後測知螢光量(光子捕捉器)微生物培養方式同步培養：同步培養：應用不同生理調節方式或物理法，使同一 菌齡之細胞增殖以供使用。例：利用溫度的改變：大腸桿菌在37下培養，可進行正常的分裂，但 各細菌之生長速率不同，當改變培養溫度為25 時，細菌分裂會受影響，此時所有細胞全部暫停 分裂，經一段時間後再移至37，則所有細胞皆 同時分裂，達同步生長目的。同步培養所得知結果，其能維持的時間非常有限。經幾代的培養之後，菌中之生長速率又會不同。微生物的控制 防治微生物的目的，在有效控制微生物的生長及其影響，對有益者則加以利用，對有害者則加以設法滅除之。實驗室常用滅菌方法溼熱滅菌法乾熱滅菌法火焰法過濾除菌法紫外線殺菌法酒精超音波(或+清潔劑)滅菌滅菌(sterilization)：徹底的殺菌方法。用物理或化學方式殺死物體上所有微生物，永久性的喪 失其活力包括營養型及孢子型。消毒消毒(disinfection)：消毒劑 利用物理或化學方式殺死所有病原性微生物，主要是破 壞正在生長之微生物營養細胞，孢子型則仍存在。防腐防腐(antisepsis)：防腐劑 利用物理或化學方式使物體內外之微生物暫時處於不生 長繁殖但又未死亡的狀態。清潔清潔(sanitizing)：清潔劑 以化學藥劑處理物品，降低其所帶之微生物含量。商業滅菌商業滅菌(commercial sterilization)食品經殺菌處理後，按其所規定的微生物檢驗法，在其 所檢之商品中未檢出超出規定之微生物的一種殺菌法。殺菌殺菌(bactericidal)：殺菌劑 利用物理化學方法殺死微生物的作用。含滅菌及消毒。影響作用之因素作用對象：作用對象：不同微生物對不同抗菌劑有不同反應，所以必須先考慮要除去的 微生物種類，才能決定最適當之方法。濃度：濃度：不論物理或化學藥劑，使用的劑量或濃度都會影響作用之效果。溫度：溫度：因溫度會影響化學反應之進行，提高溫度可加強殺菌效果。時間：時間：當細菌死亡時，菌數隨時間之增加而降低，菌數越多所需時間越長。pH值值：除影響抗菌劑本身之效能外，也會加強或降低對菌體之效能。其他環境因子：其他環境因子：一些環境因子會干擾或影響抗菌劑之作用，須先除去。微生物生長的控制類別方法物理方法溫度過濾放射線滲透壓乾燥超音波化學方法防腐劑及殺菌劑重金屬防腐劑抗生素溫度高溫 乾熱殺菌法：熱傳導方式：以空氣為介質 作用原理：利用高溫使微生物體內的水分蒸發及 蛋白質因高溫產生氧化變性而達滅菌 作用。乾燥箱乾燥箱(oven)滅菌法：滅菌法：在乾燥箱中利用熱空氣進行滅菌，作用條件：160180、24小時。火焰法：火焰法：利用酒精燈或本生燈之火焰除去微生物，達完 全滅菌之作用。灰化法及焚燒法：灰化法及焚燒法：利用600以上高溫燃燒，以殺死微生物。溼熱殺菌法 熱傳導方式：以水為介質 作用原理：利用產生之高溫及水中的氧氣與胺基酸 裡的氫氣產生氫鍵以破壞蛋白質，使蛋 白質變性而達滅菌作用。高溫高溫高壓滅菌法高壓滅菌法(autoclave)：利用密閉鍋(滅菌釜)產生之高溫高壓，經一段時間後可達 殺菌之目的。條件：121、1.2kg/cm2、2030mins。不適用：蒸氣無法穿透之物品；易受熱破壞之物品。開放蒸氣開放蒸氣(steam)：蒸汽溫度為攝氏95105度，因此滅菌的時間需 68小時才 能達到效果。煮沸法煮沸法(boiling)：將物品在100沸水中加熱15分鐘以上，將不形成芽孢 的細菌消滅之方法。間歇滅菌法間歇滅菌法(tyndallization)：通常溫度不超過100，每日一次，每次加熱時間30分 鐘，每次滅菌後保溫在2530，促使殘留的孢子體萌 發成營養體。如此反覆連續三次，即可達到完全滅菌 的效果。巴斯德滅菌法巴斯德滅菌法(pasteurization)：由巴斯德所提出，以不造成物質變性之低溫，殺死微 生物的營養體，不過不能達完全滅菌之目的。低溫：，分 高溫：or，秒 超高溫瞬時滅菌法超高溫瞬時滅菌法(UHT)：滅菌條件：135137、35秒，可殺死微生物的營養 體和耐熱性強之芽胞細菌。乾熱：玻璃製品、金屬製品及耐乾熱的器材 醫院中現在正須要剪刀、鑷子來開刀，但剪刀、鑷子須先滅菌，則拿一個鐵盤放入剪刀、鑷子等，再倒入酒精用火燒 一燒，即達滅菌！例如:微生物實驗時少一個培養皿,則拿一個洗淨的培養皿倒入些酒精後,用火燒一燒,即可將之滅菌了！濕熱 煮沸：沒有遭受特別污染的製品（奶瓶消毒)巴氏消毒法：飲料、酒、牛奶間歇消毒法：可能受到會產生內生胞子污染之物品如花生麵筋罐頭高溫高壓：對熱不敏感的有機物如各種培養基及不耐乾熱的塑膠製品等。溫度低溫作用原理：靜菌作用，非殺菌作用。利用低溫使微生物之代謝與生長變慢，此只能抑制微生物活性，不會完全死亡。冷藏：冷藏：在47的冷藏溫度下，一些細菌、黴菌、酵母菌可存活好幾個月。冷凍：冷凍：-80、-196(液態氮)可使微生物之代謝完全停止；可用於庫存微生物、組織細胞。低溫造成菌數的減少，是由於冰晶對細胞造成物理性的破壞所致。放射線利用放射線容易被細胞內核酸所吸收，造成DNA結構之改變，產生突變甚至引起斷裂現象，以達控制微生物生長目的。輻射光源：無線電波：波常最長；對生物效應最弱。紅外線：8001000nm；可被光合細菌作為能源。可見光：380760nm；藍細菌等藻類進行光合作 用之能源。紫外光：136400nm；有殺菌作用。-,-,-,-射線；會引起水或物質之解離。紫外光：紫外光：波長介於240280nm之紫外線，容易為DNA所吸收而 造成其結構之改變，因而影響DNA之複製，對微生物 之生長有嚴重影響。紫外線穿透力有限(對清水約30cm)，無法穿透玻璃等 物體，因此只適用於物體表面之滅菌。細菌具有特殊之修復系統，例如 可利用光分解酵素 (photolysase)將紫外光所造成之DNA受損(形成二聚體 (dimer)修復而回復原狀，所以需選用適當波長、劑量 和足夠作用時間，避免修復現象發生。適量的紫外光照射可使DNA架構發生些微變化，利 用此方法可培育新性狀的菌種，因此紫外線常作為 誘變劑用於培育新菌種的工作。射線、射線、射線：射線：此帶有高能量之離子化射線作用使細胞 內之水分子游 離出電子，形成離子(如氧分子形成超氧化自由基)，作用於DNA使其斷裂細胞無法存活，以達到完全滅菌。-、-射線穿透力強，包裝完成之藥品、點滴 均可用此法達完全無菌效果。滲透壓滲透壓 微生物對滲透壓有一定的承受範圍，改變滲透壓使 細胞不能生長，甚至死亡。高滲透壓環境(20%NaCl溶液)，水將從細胞內通過細胞膜進入溶液中，造成細胞脫水而引起質壁分離，使細胞不能生長甚至死亡。在低滲透壓環境(0.01%NaCl溶液)或純水中，外環境的水從溶液中進入細胞內引起細胞膨脹，甚至破裂致死。除部份耐高滲透壓(魯氏酵母)及嗜鹽性微生物(海中)外一般微生物在鹽濃度515%、糖濃度在5070%時生長受到抑制。蜜餞等是利用利用滲透壓原理,以鹽漬法或糖漬法來保存食物 乾燥乾燥低水含量下，使微生物代謝減緩或終止。微生物之生長必需在有水的環境下才能進行，利用乾燥法除去物體的水分，會直接影響微生物生長。乾燥僅能停止微生物的生長(靜菌作用)，但不能殺滅微生物，當物質重新復水，微生物又可生長 微生物對乾燥之抵抗力：細菌芽胞黴菌、酵母菌胞子G(+)球菌酵母菌營養細胞黴菌菌絲方法：各種去除水分之方法如煙燻法.等超音波超音波利用高頻率(2萬赫茲以上)震動法，可將菌體震破，使細胞之內容物流出，達到殺菌的效果。病毒和細菌芽胞有較強之抗性。一般實驗室使用目的：萃取：震破細胞，以萃取細胞內之物質。清潔：震落玻璃器皿等設備上之雜物或菌落，以達清潔之效果。化學控制法利用化學製劑殺死微生物，以達控制的目的。不同微生物對化學藥劑之感受度不同，作用 效果會因藥劑之濃度、溫度、pH值、時間、所處環境而異。選擇理想應考慮因素：只對欲作用之微生物有效，對人或動物無害；溶於水；常溫下有作用；不會著色；無異味；低濃度下有作用；效果多樣；作用範圍廣；性質穩定，可久存；價錢便宜。重金屬類：重金屬類：機制：金屬離子與微生物之蛋白質結合而發生變性或 沉澱，使其失去活性，所以具有殺菌效果。汞、砷等離子對微生物之親合力大，會與蛋白 質或酵素的-SH基作用，使其失去活性。應用：硫酸銅：抑制藻類生長 0.5mg/L 氯化汞(紅藥水)：傷口殺菌優碘取代。砷606：治療梅毒抗生素取代因除對病原菌有效外，對人體組織亦有毒性。酚及其衍生物酚及其衍生物(石炭酸石炭酸)：作用：具有表面活性劑之作用，可破壞微生物細胞膜之通透性，當藥劑進入細胞後，引起蛋白質變性。低濃度時為抑菌劑；高濃度時為殺菌劑。在極低(25%)濃度下具有殺菌作用，但因具腐 蝕性，不能用於生物體(如皮膚)。一般用於衛 生用具、環境之消毒。食品加工用具及食品生 產廠所不適用。酚係數最早使用的有機殺菌劑是酚(因此有機物的殺菌效率以酚係數(石碳酸係數)來表示採用金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為試驗菌接觸時間15分鐘後求出具殺菌效果的最高稀釋倍數的比值。石碳酸係數愈大則殺菌力愈強 醇類：醇類：屬於脫水劑、蛋白質變性劑、脂溶劑，可使蛋 白質變性、脫水，損害細胞膜而達殺菌作用。醇類殺菌能力隨分子量之增加而增強，但分子量大之 醇類水溶性較差，因此醇類中常使用乙醇當消毒劑。乙醇以7075%的濃度殺菌效果最佳。無法破壞芽胞 7075%酒精溶解脂肪破壞細胞膜，造成細胞脫水的 同時，酒精進一步滲入細胞內完全凝固細胞體的蛋 白質，達到殺菌效果。高濃度的酒精(95%)與菌體接觸後，使細胞表面之蛋 白質急速凝固，形成硬膜，此硬膜對菌體造成保護作 用，阻止酒精進一步滲入細菌體。醛醛類：類：與細胞內之蛋白質的胺基酸或核酸作用，使蛋白質變性而失去活性。常用的有甲醛；是一種殺細菌及殺真菌劑。可破壞芽胞。0.10.2%的甲醛溶液殺死細菌繁殖體。5%的甲醛溶液 殺死細菌芽胞體。3740%的甲醛溶液 市售福馬林溶液。可作為燻蒸消毒劑，對空氣及物體表面有消毒 效果，可作為醫院或實驗室空間消毒劑，因對 皮膚及組織有毒，不適用於生物物品及食品生 產廠所的消毒。鹵素：鹵素：為一種氧化劑，可使蛋白質氧化(-SH氧化成-S-S-、細胞膜破裂(氯氣、漂白水)；與蛋白質結合(碘 酒)而達殺菌之效果。24%的點溶於酒精溶液中碘酒。氯氣通入水中次氯酸自來水、泳池消毒。0.51%次氯酸鈉5分鐘殺死大多數細菌。5%次氯酸鈉1小時可殺死細菌芽胞。清潔劑：清潔劑：利用降低表面張力之作用，將物體表面之菌體與污物一同除去，一般清潔劑由親水基及疏水基所組成，疏水基與細菌細胞膜結合，親水基與水結合。溶解細胞膜內之脂質。陽離子清潔劑：四級銨化合物 皮膚、一般用具消毒 陰離子清潔劑：肥皂。殺菌效果差，用於清潔。氣體化學滅菌劑：氣體化學滅菌劑：如ethylene oxide 與細胞內之蛋白質和核酸結合，達殺菌目的，除營養型外，芽胞亦可被破壞。作用條件：在溼度4050%的密閉容器中通入濃度1020%的 環氧乙烷，於37，作用58小時，或於54，作用34小時，可達完全滅菌。適用對熱敏感之物品殺菌，塑膠培養皿、注射筒等抗生素抗生素作用原理：抑制細胞壁的合成抑制細胞壁的合成：細菌細胞壁主要是由胜肽聚醣所組成，尤其是G(+)菌，而胜肽聚醣最後合成步驟需藉助transpeptidase(胜肽轉移 酵素)作用才能完成，而此類藥物的分子結構與此酵素 類似，因此會干擾此酵素作用，使細胞壁合成受阻，細 菌因而無法存活。抗生素：青黴素(penicillins)、頭胞菌素(cephalosporins)、萬古黴素(vancomycin)由於人體細胞沒有細胞壁，所以此類化學藥劑對於細菌 便具有選擇性毒性。抑制蛋白質的合成抑制蛋白質的合成：細菌合成蛋白質的主要場所在核醣體，將抗生素作用 於核醣體，則會干擾細菌蛋白質的合成。抗生素：鏈黴素(streptomycin)、四環黴素(tetracycline)、gentamicin 作用在細菌的30S的小次單元核糖體 氯黴素(chloramphenicol)、紅黴素(erythromycin)作用在細菌的50S的大次單元核糖體核糖體由大次單元體、小次單元體組成完整核糖體。原核細胞大次單元體為50S、小次單元體為30S，兩的次單元體組合會形成70S的完整核糖體。真核細胞大次單元體為60S、小次單元體為40S，兩的次單元體組合會形成80S的完整核糖體。抑制核酸的合成抑制核酸的合成：抗生素作用在DNA，造成DNA結構改變進而造成複製 受影響(抑制轉錄作用)，終致微生物無法生存。抗生素：立放黴素(rifamycin)破壞細胞膜破壞細胞膜：抗生素和微生物細胞膜上的磷脂結合，造成菌體細胞 結構混膜亂，而改變細胞膜原有之功能。抗生素：多黏桿菌素(polymyxin)作用在細菌的細胞膜 polyene antibiotics作用真菌細胞膜 干擾葉酸的新陳代謝干擾葉酸的新陳代謝：葉酸為核苷酸及氨基酸合成的重要原料，細菌合成核苷酸所需之葉酸是由對胺基苯甲酸(p-aminobenzoic acid;PABA)來合成，而抗生素與PABA結構類似，造成競爭 性抑制，或能抑制葉酸合成過程中所需酵素的作用，進而干擾細菌所需葉酸之合成。抗生素：磺胺藥劑：競爭性抑制 二甲氧基苯嘧啶：抑制酵素抗生素使用種類及適用對象種類生產菌株對象penicillinPenicillium chrysogenumPenicillium notatumG()streptomycinStreptomyces griseusG()、G()chlortetracyclineStreptomyces aureofaciensG()、G()gentamicinMicromonospora purpureaG()、G()、mycoplasmaAmphotericinStreptomyces nodosusyeast and moldnystatinStreptomyces nourseiyeast and moldfungizoneyeast and mold水媒病害(Water-borne Diseases)細菌性:細菌性的疾病是水媒病害中最常見的,造成生命及財產的損失也 最嚴重,如:病 原 體 名 稱 症 狀 1.Salmonella typhosa 沙門氏菌 傷寒 2.Shigella dysentery 志賀氏菌 細菌性痢疾 3.Vibrio comma 霍亂弧菌 霍亂 症狀：下痢.嘔吐.噁心,嚴重時電解質流失,而昏迷死亡。三種病原菌都是革蘭氏陰性(G“-”);前兩者皆為桿形 (rod)，而 另一為弧形；1.具周生鞭毛，且 1.2 皆不醱酵乳醣 水媒細菌性病害指標為何以大腸桿菌當指標生物?細菌在水中如何被傳播?=靠糞便-下水系統-飲水系統這些病原菌殘存力大概有7天,最長為沙門氏菌,最短為霍亂菌,但三者皆引起嘔吐及下痢,將排洩物排入下水道系統,如果與飲水系統未分離 好則疾病易造成流行。現因這些病原菌殘存力弱,難監測(不好找到或已死了)故失去當指標生物的條件,因此採用同是存於腸內且殘存力長,易檢測的大腸桿菌當指標生物。一般水質檢驗 coliform方法預擬試驗presumptive test)確定試驗(confirmed test)完全試驗(complete test)E.coli IMViC試驗 I(indole test)E.coli可將tryptophan 分解為indole。M(Methyl red test)E.coli將glucose分解產酸而使指示劑(甲基紅)變色。Vi(Voges-Proskauer test)C(Citrate test)E.coli 不能利用檸檬酸鹽生長(不能將檸檬酸鹽當碳源)。IMViCE.coli(紅色)(紅色)Enterobacter aerogenes(黃色)(桃紅色)(混濁)何謂 coliforms 特徵:1.在人或動物中的腸管內生 2.乳醣醱酵 3.最適溫度是 37 度 4.G-，rod，無內生胞子（non-Endospore）Coliforms 之檢測法:A:傳統的多管醱酵法(multiple tube fermenatron)=即 MTF法(省錢、耗時、人工)=求水中 Coliform 的最大可能數目(MPN值)MTF 之步驟：a：假定試實驗:將水樣加入 Lactose Broth 內於 37度下培養 24小時後，視產酸產氣否有者為正反應 b：確定試驗:將在 a.中呈正反應的培養液部份移入BGLB內 於37度下培養24小時後，視產酸產氣否,有者為正反應 c：完成試驗:將在 b.中呈正反應的培養液部份移入 EMB內於 37度下培養24小時後,視綠色金屬光澤之菌落出現否，並作 鏡檢:G-,桿形無內生胞子。MTF steps水樣取時必有3個系列：1.水不太髒=10，1.0，0.1ml 2.水太髒 =1，0.1，0.01ml 3.水很乾淨=100，10，1ml 取樣愈少誤差愈大，愈不容易測到大腸桿菌。步驟 a.呈正反應只能假設有大腸桿菌 b.呈正反應驗證有大腸桿菌 c.呈正反應則確定有大腸桿菌(可加鏡檢確認特徵)利用Thomas Equation（陶姆斯氏公式)可以求出 MPN 值 正發酵管數 100 MPN=-(水樣總體積 未發酵水樣體積)MTF 結果MTF 醱酵法的缺點1.時間要很長（約五天）2.取樣會有誤差3.數據根據公式去換算，求出的MPN不是直接計數而是公式換算值具有統計的誤差 濾膜法（membrane filtration）MF法,採醋酸纖維膜(0.45um/孔或 0.22um/孔)用磁性過濾器濾過後,培養在 EMB上視金屬綠色光澤菌落產生數，並計數之。MF 法的好處=1.沒有採樣誤差 2.時間短、省時 3.數目是直接計數不是換算值 無統計誤差 MF 法的缺點=很昂貴由於T.C中部分菌屬是存在於自然界的(水、土壤中)因而欲將之與來自污水的污染區分時,則需進一步探討:人體內的大腸桿菌需經過糞便進入水體才會產生污染,而糞便的溫度高於體溫(約經過45度的衝擊),因此可由糞便型大腸桿菌(fecal coliform)的檢測,以了解污水的污染狀況。又豬等排出的污水量約為人的 5-10 倍,其污染量頗大,欲區分人或畜之污染時可採用動物的腸道系統特有的 Fecal Streptococcus(糞便型鏈球菌,F.S)作指標,由F.C及F.S的存在比率,進一步區分污染源。根據統計：F.CF.S 若 4=主要污染者為人 F.CF.S 若4-1.6=主要污染者為溫血性動物（豬）F.CF.S 若 1.6=主要污染者為雞、鴨、魚（家禽）TC/FC/FS