微生物学实验三.pptx

抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology一、实验目的一、实验目的1.1.掌握抗酸染色方法。掌握抗酸染色方法。2.2.了解抗酸染色的原理和意义。了解抗酸染色的原理和意义。抗抗 酸酸 染染 色色 Acid fast stain抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology分枝杆菌的细胞壁内含有大量的分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分脂质，主要是分枝菌酸枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过一般不易着色，要经过加热和延长染色时间加热和延长染色时间来促来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色抗酸染色。齐齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物石炭酸复红牢固结合成复合物，用用3%3%盐酸酒精处盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为仍然为红色红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色而其他细菌及背景中的物质为兰色。二、实验原理二、实验原理抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology 细菌：卡介苗细菌：卡介苗 （Bacillus Calmette-GuerinBacillus Calmette-Guerin，BCGBCG）染液：石炭酸复红液、染液：石炭酸复红液、3%3%盐酸酒精、碱性美盐酸酒精、碱性美 兰溶液兰溶液 其它：接种环、酒精灯、载玻片等其它：接种环、酒精灯、载玻片等三、实验材料三、实验材料抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology1 1、细菌涂片的制备、细菌涂片的制备 涂片涂片 干燥干燥 固定固定 2 2、染色、染色1 1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红石炭酸复红2-3 2-3 滴滴，在，在火焰高处徐徐加热，火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，加热切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，加热3 35min5min，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，待标本待标本冷却后用水冲洗冷却后用水冲洗。2 2）脱色：）脱色：3%3%盐酸酒精脱色盐酸酒精脱色30s30s1min1min；用水冲洗。；用水冲洗。3 3）复染：用）复染：用碱性美兰溶液复染碱性美兰溶液复染1min1min；用水冲洗后用吸水纸吸干。；用水冲洗后用吸水纸吸干。四、方法与步骤四、方法与步骤抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology五、实验结果五、实验结果未染色未染色 初染后初染后 脱色后脱色后 复染后复染后初染初染脱色脱色复染复染石石炭炭酸酸复复红红盐盐酸酸酒酒精精碱碱性性美美兰兰抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology 结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology六、注意事项六、注意事项1 1、无菌操作、无菌操作2 2、染色时间、染色时间3 3、初染加热的温度，勿沸腾、初染加热的温度，勿沸腾抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology病毒的接种与培养病毒的接种与培养真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察 抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology实验目的实验目的了解病毒的培养方法了解病毒的培养方法掌握病毒的鸡胚接种及动物接种掌握病毒的鸡胚接种及动物接种了解常见真菌的菌落特点了解常见真菌的菌落特点抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology一一.病毒的培养病毒的培养动物接种法动物接种法鸡胚培养法鸡胚培养法组织细胞培养法组织细胞培养法n病毒的分离培养病毒的分离培养病毒结构简单，病毒结构简单，缺乏完整的酶系统缺乏完整的酶系统，不能在无生不能在无生命的人工培养基中生长，必须在命的人工培养基中生长，必须在活的组织细胞活的组织细胞中才中才能增殖。能增殖。抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology1.动物接种（动物接种（Animalinoculation）最早应用的病毒培养法最早应用的病毒培养法。用途：分离鉴定、传代、制备免疫血清。用途：分离鉴定、传代、制备免疫血清。缺陷：带菌，缺敏感动物。缺陷：带菌，缺敏感动物。常用动物：鼠、家兔、猴和羊等。常用动物：鼠、家兔、猴和羊等。接种的途径：脑内、鼻内、皮内、腹腔内和静接种的途径：脑内、鼻内、皮内、腹腔内和静脉注射等。脉注射等。抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology病病 毒毒 分离材料分离材料 实验动物实验动物 接种途径接种途径 接种后症状接种后症状 脑炎病毒脑炎病毒 蚊体悬液、尸蚊体悬液、尸解脑悬液解脑悬液 小鼠小鼠 脑内、腹腔脑内、腹腔 脑炎脑炎 柯萨奇病毒柯萨奇病毒A组组 咽拭子、粪便咽拭子、粪便悬液、脑脊液、悬液、脑脊液、尸解脑悬液尸解脑悬液 乳鼠（小于乳鼠（小于3d）皮下、脑内、皮下、脑内、腹腔腹腔 弛缓性麻痹弛缓性麻痹 柯萨奇病毒柯萨奇病毒B组组 咽拭子、粪便咽拭子、粪便悬液、脑脊液、悬液、脑脊液、尸解脑悬液尸解脑悬液 乳鼠（小于乳鼠（小于24h）皮下、脑内、皮下、脑内、腹腔腹腔 震颤、痉挛震颤、痉挛性麻痹性麻痹 狂犬病病毒狂犬病病毒 唾液、脑悬液唾液、脑悬液 小鼠小鼠 脑内脑内 脑炎脑炎 常用动物接种分离的病毒及接种途径常用动物接种分离的病毒及接种途径 抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology小白鼠的脑内接种小白鼠的脑内接种1、取取病病毒毒悬悬液液：用0.25ml注射器取0.1ml病 毒悬液，去除注射器内的气泡。2、固固定定小小白白鼠鼠：用左手大拇指和食指握住小白鼠的头部，手掌轻轻按住小白鼠的体部。3、消消毒毒注注射射部部位位：右手用棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠的右侧颞部皮毛（不碰到眼）。抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology4、接接种种：右手拿注射器在小白鼠颞部（眼与耳根联线的中点略偏耳朵的方向）注入，进入颅腔即可，（一般进针23mm）不要插得太深。5、观观察察：注射完毕，将用过的注射器放入煮沸消毒器内，煮沸消毒。实验动物置于防蚊设备的室内饲养，逐日观察动物发病情况。抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology处死小白鼠-颈椎脱臼法抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology2.鸡胚接种鸡胚接种接种途径接种途径可根据病毒种类选择适宜接种部位，如分离可根据病毒种类选择适宜接种部位，如分离流感病毒常用羊水囊和尿囊同时接种法，而流感病毒常用羊水囊和尿囊同时接种法，而痘病毒常采用绒毛尿囊膜接种法痘病毒常采用绒毛尿囊膜接种法 n尿囊腔接种法尿囊腔接种法n卵黄囊接种法卵黄囊接种法n绒毛尿囊膜接种法绒毛尿囊膜接种法n羊膜囊接种法羊膜囊接种法 抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology常用鸡胚分离或鉴定的病毒常用鸡胚分离或鉴定的病毒 病病 毒毒 接种途径接种途径 接种后变化接种后变化 血清学诊断所用材料血清学诊断所用材料 痘苗病毒痘苗病毒 绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜 痘斑痘斑 产生痘斑的绒毛尿囊产生痘斑的绒毛尿囊膜膜 单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒 绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜 白斑、核内包白斑、核内包涵体涵体 尿囊液尿囊液 流感病毒流感病毒 羊水囊、尿囊羊水囊、尿囊 产生血凝素产生血凝素 尿囊液尿囊液 腮腺炎病毒腮腺炎病毒 羊水囊或卵黄羊水囊或卵黄囊囊 产生血凝素产生血凝素 羊水羊水 抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology判断鸡胚是否存活判断鸡胚是否存活在检卵灯下观察能否看到在检卵灯下观察能否看到清晰的血管清晰的血管；胚胎是否胚胎是否移动移动；若胚龄过长，则需观察其胎盘部分，胎盘若胚龄过长，则需观察其胎盘部分，胎盘部分变苍白说明胚胎死亡，正常时胎盘发部分变苍白说明胚胎死亡，正常时胎盘发暗，蛋白部分透亮。暗，蛋白部分透亮。抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology判断鸡胚是否存活判断鸡胚是否存活抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology气室鸡胚卵黄囊尿囊腔羊膜腔绒毛尿囊膜卵白卵膜抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology鸡胚结构示意图鸡胚结构示意图卵膜卵膜抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology绒毛尿囊膜接种法绒毛尿囊膜接种法定位：将胎盘部分将胎盘部分 及自然气室部分用记号及自然气室部分用记号 笔画出，在笔画出，在离开胎盘与离开胎盘与大血管区大血管区画一直径约画一直径约1cm1cm的等边三角形的等边三角形卵窗抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology取卵壳：依次用碘酊，酒精消毒记号处，用依次用碘酊，酒精消毒记号处，用锯片将标记三角区卵壳锯穿，（注意勿损伤卵壳锯片将标记三角区卵壳锯穿，（注意勿损伤卵壳下各层膜组织），取下所画三角形区域的卵壳，下各层膜组织），取下所画三角形区域的卵壳，（注意卵壳下各层膜组织），然后用针尖轻轻将（注意卵壳下各层膜组织），然后用针尖轻轻将暴露的卵膜中心刺破一个小口（不要伤及绒毛尿暴露的卵膜中心刺破一个小口（不要伤及绒毛尿囊膜）。囊膜）。造人工气室：在自然气室部分消毒后用锥子在自然气室部分消毒后用锥子或大注射器针头在气室正中钻一孔，用橡皮头自或大注射器针头在气室正中钻一孔，用橡皮头自气室端小孔将气室中空气吸出，使绒毛尿囊膜下气室端小孔将气室中空气吸出，使绒毛尿囊膜下陷形成一陷形成一“人工气室人工气室”。抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology接种：去除卵膜，于绒毛尿囊膜上滴上病去除卵膜，于绒毛尿囊膜上滴上病毒毒0.10.2ml 0.10.2ml。封口：用胶布封口，胶布事先用碘酒消毒，用胶布封口，胶布事先用碘酒消毒，并通过火焰烧去余碘。并通过火焰烧去余碘。培养：放入温箱培育放入温箱培育4 4天，然后收获病毒。天，然后收获病毒。抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology二二.真菌菌落的观察（示教）真菌菌落的观察（示教）真菌培养营养要求不高，在一般培养基上真菌培养营养要求不高，在一般培养基上能生长能生长常用常用沙保弱（沙保弱（SabouraudSabouraud）培养基）培养基（含（含4%4%葡葡萄糖、萄糖、10%10%蛋白胨、琼脂、蛋白胨、琼脂、PH4.06.0PH4.06.0），），真菌的最适酸碱度是真菌的最适酸碱度是PH4.06.0PH4.06.0，最适生长，最适生长温度浅部真菌温度浅部真菌2228 2228 深部真菌深部真菌37 37。抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology真菌菌落类型真菌菌落类型酵母型菌落（酵母型菌落（yeast colonyyeast colony）菌落光滑、湿润。无菌丝菌落光滑、湿润。无菌丝隐球菌菌落隐球菌菌落类酵母型菌落（类酵母型菌落（yeast-like colonyyeast-like colony）外观和酵母型菌落相似，显微镜下可看到外观和酵母型菌落相似，显微镜下可看到假菌丝假菌丝白色念株菌菌落白色念株菌菌落丝状型菌落（丝状型菌落（filamentous colonyfilamentous colony）菌落系由多细胞菌丝体所组成菌落系由多细胞菌丝体所组成大多数丝状真菌或霉菌的菌落大多数丝状真菌或霉菌的菌落抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology新型隐球菌：新型隐球菌：菌落属酵母型菌落，圆形、较菌落属酵母型菌落，圆形、较大、白色、边缘整齐，表面湿润光滑，与一般大、白色、边缘整齐，表面湿润光滑，与一般细菌菌落相似细菌菌落相似 。白色念珠菌：白色念珠菌：菌落属类酵母样菌落，圆形、菌落属类酵母样菌落，圆形、较大、白色、菌落底层有假菌丝长入培养基内。较大、白色、菌落底层有假菌丝长入培养基内。抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology表皮癣菌：表皮癣菌：菌落属丝状菌落，在沙保琼脂斜面菌落属丝状菌落，在沙保琼脂斜面培养基上菌落开始为白色，颗粒状，以后变为培养基上菌落开始为白色，颗粒状，以后变为绒毛样甚至粉末状，有许多辐射状沟，且培养绒毛样甚至粉末状，有许多辐射状沟，且培养基常有皱裂基常有皱裂。小孢子菌：小孢子菌：菌落属丝状菌落，在沙保培养基上菌落属丝状菌落，在沙保培养基上菌落为棉絮状、羊毛状或粉末状。菌落为棉絮状、羊毛状或粉末状。抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology注意事项注意事项消毒小白鼠时不要碰到眼睛消毒小白鼠时不要碰到眼睛注射时不要扎的太深以免扎到手注射时不要扎的太深以免扎到手磨卵壳及钻孔时力量要适中磨卵壳及钻孔时力量要适中看过的鸡胚不要倒入水池，倒入指定的大烧杯中看过的鸡胚不要倒入水池，倒入指定的大烧杯中抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology实验报告简述抗酸染色原理、方法和结果。简述抗酸染色原理、方法和结果。绘制抗酸染色油镜下观察图。绘制抗酸染色油镜下观察图。抗酸染色、病毒的接种与培养抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察真菌菌落形态观察新乡医学院成人高等教育网络课程新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology1.1.抗酸染色的原理是什么？有什么临床意义抗酸染色的原理是什么？有什么临床意义？2.2.常用的病毒分离培养的方法有哪些？常用的病毒分离培养的方法有哪些？思考题思考题