实验三石蜡切片技术取材固定.doc

石蜡切片法
q 以石蜡作包埋剂，用旋转切片机将材料切成薄片，经一系列解决制成永久制片的方法。
q 在研究植物细胞、组织、胚胎以及形态等方面最抱负的制片方法。
显微切片技术产生的因素
§1、 光学显微镜发展到一定限度，渴望知道细胞结构
§2、 由于组织太厚，光线很难穿过
§3、压片可使组织变薄，但引起变形、易位，除核外，看不到其他结构，因此需要切片变薄。
§4、 因细胞水多，太软，无法切片
鉴于上述情况找到一种方法使细胞水被替代，变硬，能直接切片的方法，最广泛使用的就是石蜡切片技术
石蜡切片技术的优点
l1、 经济,价格低，可反复使用；
l2、 技术难度不大，容易掌握，但要精通也不容易；
l3、 设备规定不高；
l4、 可长期保存；
l5、 染色容易，并且都能被染色，形成好的反差和好的选择性。
石蜡切片法环节
一、取材
二、固定
三、抽气
四、冲洗
五、脱水
六、透明
七、浸蜡与包埋
八、切片
九、染料与染色材料的选择、采集与分割
十、封藏
Ø取样前应注意的问题
1.研究正常结构时，应选择健全而具有代表性的部位取材；
采用病理材料时，除取其病变的部位外，还应从病变的中央部分向四周，连同正常组织一起采用，以利观测分析。
2.采用标本前，要根据制片的规定，选择并配制固定液，取材后应立即投入固定液，以防组
织自溶和腐败。
选 材
q 植物材料的切取：
根、茎类轴性器官的切取：
1、横切面：观测各种组织的横切面，及其所占比例。垂直于长轴方向切取。
2、纵切面：观测各种组织的纵切面，平行于长轴方向切取。
分为：径向切面和切向切面。
选 材
q 叶的切取：横切面。
3.切取材料时，刀必须锐利，动作要快但要仔细，切割时切勿拉锯式的来回切取，镊取时须轻夹轻放，尽量不损伤材料。
4.材料尽也许新鲜，并切成所需的大小。这样有助于固定液的透入。
5.取材时要具体记录日期、采集地点、标本
名称、时期、取材部位、断面和固定液等。Ø
样品采集与分割
1、叶
取样部位
取样部位玉米叶
2、根
主根
侧根
不定根
一级侧根
二级侧根根尖
分区根的初生构造
有丝分裂、核型分析
3、茎
4、花Ø
花药的发育孢原细胞
Ø胚囊的发育单核胚囊第一次有丝分裂二核胚囊第二次有丝分裂四核胚囊八核胚囊Ø
植物材料的分割 取材
q根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料规定新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。
q所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集时间、地点、名称、组织部位，所取组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。
q一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，植物组织取材稍小，动物组织取材要稍大。
动物的麻醉和杀死
从活的动物体上采用材料不象采集植物材料那么容易，由于在不施加麻醉的情况下，有的动物会收缩(如蚯蚓、水蛭)，有的会骚动(如蛙、鼠)，使我们无法下手。但制片所需的材料又规定越新鲜越好，特别是细胞学方面的研究对材料的新鲜限度规定更严。因此，要割取生活着的动物组织，在一般情况下，就要对动物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所用的麻醉药品，必须以不影响细胞结构为原则。若是一般的组织学制片，规定不太严格的话则可将动物先杀死然后速取其组织进行固定。蛙、蟾蜍、鼠等较小的动物，可用断头法杀死，即用普通剪刀剪断颈部。较大的动物，如大竺鼠、免、猫等可用木槌猛击头后部，使其昏倒，或用50m1的注射器从耳静脉向心脏注入空气，使动物发生急性空气栓塞
痉挛而死。q
上述动物若需麻醉后取材，则可用脱脂棉球蘸氯仿或乙醚、置于动物的鼻尖部，令其吸入麻醉。大动物(狗、猴等)应用氨基甲酸乙酯作静脉注射麻醉．剂量一般为每kg动物体重用1 g。麻醉后的动物也需放血后进行取材固定。
q 昆虫等小动物可投入充满氯仿或乙醚蒸气的大口瓶中，令其麻醉。若要杀死，可将其投入含氰化钾的毒瓶中。
动物组织块的切割
割取动物组织块时，需注意以下几点：
q第一，要考虑所取材料应涉及各脏器的重要结构或所有结构，如消化管就应涉及粘膜、粘膜下层、肌层和外膜四层结构。若所取的器官太大，不易所有制片时，则可切取能代表该器官的部分材料，如狗的肾脏，可切取涉及皮质、髓质和肾盂的一部分为材料。
q第二，应注意切割方向．如在管状器官(肠等)取材时，一般是取其横切面制片，但要观测小肠的环行皱壁时，就应取其纵切面制片。
第三，组织块必须切得小而薄。细胞学制片的组织块不能超过2mm，一般组织块
的大小以0.5*0.5*0.2cm为宜，柔软组织不易切小,可先取稍大的组织块固定2 - 3h。等组织稍硬后再切成薄的小块继续固定。
植物材料的取材：
1.固定前对材料要进行切割：
因素：
（1）为了固定更容易
为保证下一步固定材料能迅速的杀生和固定，务必使各细胞立刻停止生命活动，而不使原生质有崩解的现象。普通应用的固定液对于植物体外表面的角质、木栓质等的穿透很慢，但对于被切割的表面，则穿透速度快很多。所以，我们在固定材料的时候，应将所需要的部分分割到最小块、段或片、以达成立刻杀生与固定的目的。
（2）石蜡块也有一定限制，一般（5-6mm）。2.切割面一般分为两类：
q（1）横切面：使用刀横越根、茎的横断面的切面，横切片可观测材料自外向内的各种组织。
q（2）纵切面：刀的切向与根、茎的长轴方向平行的切面，这种切面又分为两种：
q①半径切面：以刀穿过中心点与其半径吻合的切面，这种切面可观测到茎中各种组织纵走的情形及髓的排列、厚度等。
q②切线切面：以刀沿植物体的表面与其半径成直角所切的切面。
3.不同材料的切割方法
q（1）叶片：叶片宽小于1cm,可沿主脉横切3-5mm,叶片宽敞于1cm,可分割成许多片，选
其中含主脉和侧脉的固定，一般5-7mm2方块。
q（2）圆柱形材料：直径小于2mm，有角质层的，切2mm厚。无角质层的，固定液穿透容易，切5-10mm厚。直径大于等于5mm，切5mm厚。直径大于10mm,切2-5mm厚。直径很大，取楔形
q（3）木质小枝：直径小于5mm，切成15mm长木条和大枝：直径较大的,切成2-3cm厚，再分割成楔形小块。
二、固定
q割取组织块后，应立即进行固定。
q固定是制片极为关键的环节，制片质量的优劣。除与材料的新鲜限度有关外，还取决于最初的固定是否适当和完全。
固定的意义
q新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和细菌的繁殖，可引起组织的自溶和腐败。因此，割取组织块后，应立即采用一 种方法．将组织尽也许保持原有的形态结构，且有助于保存和适于制片的操作，这一环节称为固定。固定的目的和作用
①防止组织自溶和腐败；
②使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构；
③因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，导致光学上的差别使本来在生活情况下看不清楚的结构变得清楚易见，且有的固定剂尚有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而使细胞各部易于染色；
④固定剂兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易变形，利于操作。
固定的方法
q物理方法固定有干燥、高热和低温骤冷等。例如，血液涂片就是干燥固定；细菌涂片可用加热法固定；许多组织化学反映的制片是以低温骡冷固定作冰冻切片的。
q化学方法固定就是用化学试剂配制成固定液使之固定。
固定液的选择
可分为：简朴固定液和混合固定液。
q简朴固定液又称单纯固定液，就是用一种化学试剂作为固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它们只是对细胞的某种成分固定得较好；不能将细胞所有的成分都保存下来。如升汞固定蛋白质、冰醋酸固定核蛋白、无水乙醇可固定糖原等，单纯固定液是有局限性的。
混合固定液就是用几种化学药品，按一定的比例混合配制而成的，由于各种药品的优缺陷互相填补，因此可产生较好的效果。良好的固定剂应当具有以下条件：
q 迅速渗入组织，杀死原生质体，在短时间内，组织内外完全固定；
q 尽也许避免组织膨胀或收缩，且软硬合适于切片；
q 增长细胞内含物的折光限度，易于鉴别，同时增长媒染作用和染色能力；
q 固定液同时是防腐液，使材料不致变质腐败。
按固定的方式将固定液分为两类：
q凝结型固定液：使蛋白质凝固，形成悬浮颗粒网状混合液。
q非凝结型固定液：不使蛋白质凝固，形成透明的凝胶。
q苦味酸、升汞、铬酸、碘均能使胞质蛋白和核蛋白凝固；酒精能沉淀胞质蛋白，而核蛋白沉淀后溶于水；醋酸不能凝固胞质蛋白,但能凝固核蛋白;福尔马林、锇酸、重铬酸钾对两种蛋白都不凝固。
1.凝结型固定液：
q酒精
q醋酸
q铬酸
q苦味酸
（1）酒精:70%-75%酒精渗透力最强。
q①穿透速度快。
q②可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，前两者的沉淀不溶于水，核蛋白所生成的沉淀溶于水；所以经乙醇固定的标本对核的染色不良，不适于对染色体的固定。
q③浓度50%以上酒精可溶解脂肪和类脂体。不能用于膜结构的研究，溶解血色素，破坏其他多种色素，所以不能用于脂肪、类脂类和色素的固定。一般用于组织学观测。
q④使糖原沉淀，但能溶于水。
q⑤是还原剂，在混合固定液中，酒精不能与氧化固定液混用。如铬酸、锇酸、重铬酸钾等。
q⑥材料硬化、组织收缩明显。
q⑦固定材料适宜浓度为70%-100%。不需冲洗，70%酒精可较长时间保存， 若长期保存材料与甘油等量混合后使用。70%酒精：甘油=1：1
（2）醋酸（乙酸）
q①穿透力速度极快。
q②能固定核蛋白，对胞质也存在固定作用。对核蛋白是凝结型固定液，对胞质是非凝结型固定液。使染色质和染色体的固定和染色均很好，因此所有固定染色体的固定液中几乎都有醋酸。
q③对脂类和糖类无固定作用。
q④酸性
q⑤对材料不仅不硬化尚有软化作用。对细胞无收缩作用，稍有膨胀作用。可防止其他药剂如乙醇、甲醛、铬酸等引起组织收缩。
q⑥固定后不需冲洗，可直接投入70%的酒精中保存。
q⑦固定材料适宜浓度为0.3%-5%。
（3）铬酸（chromic acid）
q①穿透速度缓慢。
q②能沉淀所有蛋白质，凝固核酸，增强核的着色能力，可作为核蛋白核核酸的固定液。能固定高尔基体及线粒体。常用于细胞学观测。
q③只有铬酸能真正固定肝糖原，使之不溶于水。对脂类无影响；
q④氧化剂，不能与酒精混用。固定后投入酒精前必须用流水冲洗，直至组织中不含铬酸为止，如冲洗不干净或直接投入酒精中，被还原成绿色的氧化铬并发生沉淀，使染色困难。
q⑤使组织硬化，细胞收缩。
q⑥铬酸常配成2%或10%的水溶液作为储备液，固定适宜浓度为0.5%-1%。
（4）苦味酸（picric acid）
三硝基苯酚，不能结晶保存，要以饱和溶液存放。干燥时易爆炸。
q①穿透速度中档。
q②可沉淀一切蛋白质。对脂类无影响，对糖类无固定作用。
q③细胞收缩明显，材料硬化限度很小。
q④固定后不需冲洗，可直接投入70%酒精中洗去黄色。
q⑤固定材料适宜浓度为饱和溶液，即0.9%-1.2%。
2.非凝结型固定液：
q锇酸
q戊二醛
q丙烯酸
q甲醛 q
（1）锇酸（OsO4）
q ①穿透速度很慢。材料要切的小一些，约1mm3。
q ②不沉淀蛋白质，能使蛋白质被均匀固定，所以用锇酸固定的蛋白质能保持生活时的均匀性。
q ③是脂肪和类脂类的很好的固定剂 。
q ④强氧化剂，易挥发，毒性大，对视网膜固定效果好，要保护好眼睛。价格贵。
q ⑤不使细胞收缩，对细胞质固定好，固定物组织柔软。
q ⑥固定后流水冲洗12～24小时。使其完全洗净，否则遇乙醇就发生沉淀。
q ⑦固定材料适宜浓度为0.5-2%。
q 锇酸的配制：用重蒸水配成母液2%，使用时，用PH7.0、0.2M磷酸缓冲液稀释一倍到1%。
（2）戊二醛
q①穿透速度不久。
q②固定微管蛋白，是微管的很好的固定液。
q③用PH6.8-7.0、0.2M磷酸缓冲液配成25%母液，固定材料适宜浓度为3-6%。
（3）丙烯酸
q①固定蛋白、核酸和聚多糖。
q②固定材料适宜浓度为10%，用PH6.5的磷酸缓冲液配。
（4）甲醛：也叫福尔马林液（不用于电镜制片）
q①穿透速度快。
q②可与蛋白质化合形成不溶性的化合物而固定，固定脂肪和类脂类化合物。
q③还原剂，不能与氧化剂混用。
q④组织硬化限度显著，收缩小，但仅仅经酒精脱水后，收缩显著。
q⑤固定后不需水洗，可直接投入70%的酒精。但经长期固定的材料，需经流水冲洗1-2天，否则影响染色。
q⑥市售的为37-40%甲醛，称为福尔马林，固定和保存材料的适宜浓度是10%福尔马林。（四）混合固定液：
由几种试剂，适量配制而成。混合遵循原则：① 优缺陷互补；② 膨胀与收缩相
互平衡；③ 强氧化剂与还原剂应分别配置。
qBouin氏液
q卡诺(Carnoy)氏固定液：
q福尔马林-醋酸-酒精混合液：（FAA）
q铬酸-醋酸中液
q纳瓦兴氏液
1.Bouin氏液
q常用的良好固定液，广泛应用于一般动物组织、昆虫组织、无脊椎动物的卵和幼虫，以及胚胎学材料的固定。也合用于裸子植物的雌配子体和被子植物的胚囊的固定。
配方：
q 苦味酸饱和水溶液 75份
q 福尔马林 25份
q 冰醋酸 5份
此液穿透迅速而均匀，使组织收缩少，不使组织变硬变脆，着色良好。一般动物组织固定12—24h，小块组织数小时即可。固定后直接入70％酒精中洗去黄色，但留一点黄色对染色并无妨碍。植物材料的固定期间为12—48h。
2.卡诺(Carnoy)氏固定液：
q 配方：纯酒精：冰醋酸=3：1
q适于一般动物组织和肝糖原以及植物组织（多用于细胞学研究）固定。穿透速度快，为防止组织硬化，固定期间不要超过24小时。时间以材料的不同而有所区别，根尖15min,花药1小时。糖原在3-5℃下固定4消失，小白鼠睾丸30-50min。固定后可转入70%中保存，也可直接经95%酒精，纯酒精脱水。
3.福尔马林-醋酸-酒精混合液：（FAA）
q 配方：50%或70%酒精 90ml、冰醋酸 5ml、福尔马林 5ml
q良好的固定液和保存液，一般植物组织和器官都合用。广泛合用于根、茎、叶、花药、子房的组织切片，又称为万能固定液。一般固定期间不低于24 h。该固定液优点是在较低温度下（10℃左右）合用于材料的长期保存，可兼作保存液。并且固定的材料，不妨碍染色，但用于细胞学上的固定效果较差。
配方中福尔马林及冰醋酸的含量，经常根据材料而略加改变。一般容易引起收缩的材料应多加冰醋酸而减少福尔马林的含量；坚硬的材料可略减少冰醋酸而增长福尔马林。至于酒精的浓度应用的原则是：柔弱幼嫩的材料用低浓度，老年或坚硬材料用70%酒精。
q 如用作植物胚胎材料则其配方可改为：50%酒精 89ml、冰醋酸 6ml、福尔马林 5ml
4.铬酸-醋酸中液：
q配方∶10%铬酸水溶液 7ml 、10%醋酸水溶液 10ml、蒸馏水加至100ml。
q此液用于固定根尖、小的子房及分离出来的胚珠等植物组织。固定期间一般12-24小时，
不能长期保存材料。固定后流水冲洗12-24小时。
5.纳瓦兴氏液(Navaschjn's)：192023首创,合用于细胞学与组织学研究的切片观测。渗透慢，不能长期保存；重要用于显示分裂相。
q甲乙液分开配，临用时再混合。配法为：

纳瓦兴氏液，
固定期间为24-48小时，如固定液呈暗绿色时，表达固定能力已经消失，其中铬酸被还原的缘故，仅有保存作用，固定后用70%酒精冲
洗，再脱水。
q 纳瓦兴氏液ⅠⅡⅢⅣⅤ，固定期间为12-48小时，ⅠⅡ固定后用水冲洗，ⅢⅣ可用35%酒精冲洗，Ⅴ可用70%酒精冲洗。
q 桑弗利斯液，固定期间为4-6小时，流水冲洗6-12小时。
固定注意事项
q(1)材料越新鲜越好。采集后须立即投入固定液中进行固定，切勿耽误。
q(2)材料大小以直径不超过5mm为宜，材料与固定液的比例为1:20。
q(3)根据材料的性质和制片的目的选择固定液。
q(4)所固定的植物材料，若表面有毛茸或其它不易穿透的物质，则可用品有酒精的固定液固定。
q(5)有气泡的材料投入团定液后，材料不下沉，故须将气泡抽出使材料下沉。最简易的抽气方法是将材料和固定液一并例入10ml的注射器中，抽动几次。q
(6)固定期，要防止材料变形。
q (7)外有被膜，而内部站构又极易松散的器官，应将整个器官投入固定液2—2h后，再将其修成小块材料继续则定。
q (8)含行粘液、污物或血液的材料需用生理盐水洗净后．再行固定。
q (9)材料投入固定液后．须经常摇摆。
q (10) 容器外需贴标签。
三、抽气
植物材料内部多由于具有空气，导致固定液不能完全进一步。材料投入固定液后需要立即抽气。以便让固定液有效透入材料组织中，并排除材料内气泡的干扰。一般抽气时间为20-30 min。抽过气的材料在停止抽气，应沉入底部。