微生物实验微生物数量和大小测定.pptx

1.1.微生物大小测定微生物大小测定2.2.微生物数量测定微生物数量测定3.3.大肠杆菌生长曲线的测定大肠杆菌生长曲线的测定实验五实验五学习使用学习使用镜台测微尺和目镜测微尺；在显微镜下测定微生镜台测微尺和目镜测微尺；在显微镜下测定微生物大小。物大小。实验实验(一一)微生物大小的测定微生物大小的测定一、目的要求一、目的要求二、实验原理二、实验原理 镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是玻片，一般是l mml mm等分为等分为100100格，每格长格，每格长0.01 mm0.01 mm(即即10 um)10 um)，用于校正目镜测微尺每格的相对长，用于校正目镜测微尺每格的相对长度。度。目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度。玻片，其中央有精确的等分刻度。目镜测微尺每目镜测微尺每小格所代表的实际长度不一样，小格所代表的实际长度不一样，需将其放在接目需将其放在接目镜中的隔板上，测量前，镜中的隔板上，测量前，必须先用镜台测微尺进必须先用镜台测微尺进行校正行校正。目镜测微尺镜台测微尺1.1.利用镜台测微尺利用镜台测微尺利用镜台测微尺利用镜台测微尺测定目镜测微尺的测定目镜测微尺的测定目镜测微尺的测定目镜测微尺的每格绝对值每格绝对值每格绝对值每格绝对值2.2.2.2.目镜测微尺每格目镜测微尺每格目镜测微尺每格目镜测微尺每格长度（长度（长度（长度（umumumum）两重两重两重两重合线间镜台测微尺合线间镜台测微尺合线间镜台测微尺合线间镜台测微尺格数格数格数格数10/10/10/10/两重合两重合两重合两重合线间目镜测微尺格线间目镜测微尺格线间目镜测微尺格线间目镜测微尺格数数数数3.3.利用目镜测微尺利用目镜测微尺利用目镜测微尺利用目镜测微尺测定微生物大小测定微生物大小测定微生物大小测定微生物大小三、实验器材三、实验器材 1、菌种：、菌种：酿酒酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2、器材：、器材：显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺三、实验步骤三、实验步骤 1 1、目镜测微尺的校正、目镜测微尺的校正 镜台测微尺有刻度的一面朝上，置显微镜载物台上，镜台测微尺有刻度的一面朝上，置显微镜载物台上，先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺野中央转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，分别数出两重合线之间镜某一区域内两线完全重合，分别数出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格数。先台微尺和目镜微尺所占的格数。先10 x10 x，后，后40 x40 x，分别，分别计算计算10 x,40 x10 x,40 x下目镜测微尺的校正值。下目镜测微尺的校正值。2 2、细胞大小的测量、细胞大小的测量 酵母菌悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片，置显微酵母菌悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片，置显微镜载物台上。用目镜测微尺测量细胞宽和长。镜载物台上。用目镜测微尺测量细胞宽和长。三、实验结果三、实验结果 1.1.计算出目镜测微尺校正结果（物计算出目镜测微尺校正结果（物1010和和4040）2.2.酵母菌大小测定酵母菌大小测定酵母菌大小测定酵母菌大小测定,选择选择5-85-8个酵母菌，测定其个酵母菌，测定其4040大小范围。大小范围。四、思考题四、思考题 p51 2(2)1 1、明确血细胞计数板计数的原理。、明确血细胞计数板计数的原理。2 2、掌握使用血细胞计数板进行微生、掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。物计数的方法。实验实验(二二)微生物数量的测定微生物数量的测定一、目的要求一、目的要求显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上玻片上(又称计菌器又称计菌器)，于显微镜下直接计数，于显微镜下直接计数的一种方法。用于细胞总数的测定的一种方法。用于细胞总数的测定显微镜直接计数法的优点是直观、快速。缺点是所测得的结显微镜直接计数法的优点是直观、快速。缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色，微室培养等方法来达到只计服这一缺点，如结合活菌染色，微室培养等方法来达到只计数活菌体的目的。数活菌体的目的。二、实验原理二、实验原理血细胞计数板由两条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横血细胞计数板由两条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为八个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室是由一个大方格为八个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室是由一个大方格分成分成2525个中方格，而每个中方格又分成个中方格，而每个中方格又分成1616个小方格；共计个小方格；共计400400个小个小方格。方格。计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，以及大方格中的总菌数，再换算成值，以及大方格中的总菌数，再换算成1 ml1 ml菌液中的总菌数。菌液中的总菌数。个计数室个计数室mmmm包含包含个中方格个中方格个中方格个中方格个小方格个小方格三、实验器材三、实验器材 1 1、菌种：、菌种：酿酒酵母、大肠杆菌酿酒酵母、大肠杆菌 2 2、器材：、器材：显微镜、血球计数板显微镜、血球计数板三、实验步骤三、实验步骤 1 1、在、在1010和和4040下找到计数室。下找到计数室。2 2、盖上盖玻片将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘、盖上盖玻片将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室。室。3 3、静置、静置5 min5 min，先用低倍镜将计数室移至视野中央。，先用低倍镜将计数室移至视野中央。4 4、在高倍下、在高倍下(40X)(40X)计数：对计数：对两个两个计数室计数室记数，记数，方法：方法：每个计数室选每个计数室选5 5个中格个中格(4(4个角和中央的一个中格个角和中央的一个中格)中的菌中的菌体进行计数体进行计数 ，求得每个中方格的平均值，再乘上，求得每个中方格的平均值，再乘上2525即即为大方格中的总菌数，最后换算成为大方格中的总菌数，最后换算成1ml1ml菌液中的总菌数。菌液中的总菌数。对于分布在刻线上的细胞，依照对于分布在刻线上的细胞，依照“数上不数下，数左不数上不数下，数左不数右数右“的原则进行计数。的原则进行计数。5 5、最后的结果是、最后的结果是两个两个计数室计数室所记菌数的所记菌数的平均值平均值三、实验结果三、实验结果 1 1、统计每个计数室（五个中格）的细胞数量、统计每个计数室（五个中格）的细胞数量四、思考题四、思考题 p56 2(1)记数记数中格中格12345细胞细胞记数记数2 2、计算每、计算每mlml酵母菌悬液的酵母菌数量。酵母菌悬液的酵母菌数量。稀释倍数为稀释倍数为1 1记数记数中格中格12345细胞细胞记数记数通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长曲线。征和规律，绘制生长曲线。了解光电比浊计数法的原理。了解光电比浊计数法的原理。学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。实验实验(三三)大肠杆菌生长曲线的测定大肠杆菌生长曲线的测定一、实验目的一、实验目的生长曲线生长曲线 将将少少量量纯纯种种单单细细胞胞微微生生物物接接种种到到定定量量的的液液体体培培养养基基中中，定定时时取取样样测测定定细细胞胞数数量量，以以培培养养时时间间为为横横坐坐标标，以以菌菌数数为为纵纵坐坐标标作作图图，得得到到一一条条反反映映单单细细胞胞微微生生物物在在整整个个培培养期间菌数变化规律的曲线。养期间菌数变化规律的曲线。二、实验原理二、实验原理一个典型的生长曲线分为延缓期、对数期、一个典型的生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期稳定期和衰亡期四个时期稀释平板计数法稀释平板计数法对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。优点：活菌计数方法，对设备要求不高。优点：活菌计数方法，对设备要求不高。缺点：操作复杂。缺点：操作复杂。显微镜直接计数法显微镜直接计数法使用血球计数板在显微镜下直接计数。使用血球计数板在显微镜下直接计数。优点：优点：操作简便，计数直观。操作简便，计数直观。缺点：计数结果为活细菌和死菌体的总和。缺点：计数结果为活细菌和死菌体的总和。测定细胞数量的常用方法测定细胞数量的常用方法光电比浊法光电比浊法光电比浊法是利用在一定的范围内，微生物细光电比浊法是利用在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比的原理。当细菌细胞在胞浓度与透光度成反比的原理。当细菌细胞在溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中测定时所吸收的光线越多。测定时所吸收的光线越多。优点：优点：简便快速，适合于自动控制。简便快速，适合于自动控制。缺点：缺点：测定结果受培养液成分影响；某些样品测定结果受培养液成分影响；某些样品 样品不适合用此法。样品不适合用此法。菌种菌种 培养不同时段的大肠杆菌。培养不同时段的大肠杆菌。仪器或其他用具仪器或其他用具 分光光度计，比色皿等。分光光度计，比色皿等。三、实验器材三、实验器材开开电电源源，仪仪器器预预热热20 20 minmin，将将波波长长调调至至600 600 nmnm处。处。打打开开样样品品室室，将将档档光光体体插插入入比比色色皿皿架架，将将其推或拉入光路。其推或拉入光路。盖盖好好样样品品室室盖盖，在在T T MODEMODE下下，按按0%T0%T键键调调零零透射比。透射比。取出档光体，按取出档光体，按100%T/OA100%T/OA键调键调100%100%透射比。透射比。四、实验步骤四、实验步骤1.1.样品测试前的调试样品测试前的调试2.2.样品测定样品测定将将参参比比溶溶液液（未未接接种种的的LBLB液液体体培培养养基基）以以及及被测溶液倒入比色皿中。被测溶液倒入比色皿中。打打开开样样品品室室盖盖，将将参参比比溶溶液液放放在在样样品品架架的的第第一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。将参比溶液推入光路，按将参比溶液推入光路，按100%T/OA100%T/OA键调满度。键调满度。按按MODEMODE，将将测测试试方方式式调调至至吸吸光光度度方方式式（A A）。此时此时,显示器显示显示器显示“0.0000.000”。将将被被测测溶溶液液推推入入光光路路，显显示示器器显显示示为为被被测测样样品的吸光值。品的吸光值。在在600 600 nmnm波波长长下下，用用未未接接种种的的LBLB液液体体培培养养基基作作空空白白对对照照，分分别别对对培培养养了了0 0、4 4、8 8、1212、1616和和20 20 h h的的大大肠肠杆杆菌菌培培养养液液，进进行行光光电电比比浊浊测测定定。对对于于高高浓浓度度的的大大肠肠杆杆菌菌培培养养液液,要要用用未未接接种种的的LBLB培养基进行稀释，使其吸光值不超过培养基进行稀释，使其吸光值不超过1 1。比比色色皿皿经经蒸蒸馏馏水水清清洗洗后后，必必须须经经待待测测样样品品润润洗洗。比比色色皿皿的的毛毛面面用用吸吸水水纸纸擦擦干干，而而光光面面只只能用吸水纸吸干，以免光面被划破。能用吸水纸吸干，以免光面被划破。培养时间培养时间（h）4 8 12 16 20 24光密度值光密度值OD600四、实验结果四、实验结果 记录不同记录不同大肠杆菌培养液大肠杆菌培养液的的ODOD600600值，值，并绘制大肠杆菌的生长曲线。并绘制大肠杆菌的生长曲线。五、思考题五、思考题 p88 2(1)