微生物检验技术培训.pptx

微生物检验技术微生物检验技术1微生物检验技术一、环境监测一、环境监测二、无菌检查二、无菌检查三、微生物限度检查三、微生物限度检查2一、环境监测无菌检查实验环境的修订无菌检查实验环境的修订修修订订依依据据及及意意义义：20102010版版GMPGMP附附录录一一 无无菌菌药药品品 和和附附录录三三 生生物物制制品品 中中均均规规定定，非非最最终终灭灭菌菌产产品品各各工工序序关关键键操操作作环环境境应应为为B B级级背背景景下下的的A A级级。无无菌菌检检查的洁净环境不得低于生产关键区的洁净环境要求！查的洁净环境不得低于生产关键区的洁净环境要求！20102010年版年版20152015年版（原修订稿）年版（原修订稿）无菌检查：无菌检查：应应 在在 洁洁 净净 度度1000010000级级背背景景下下的的局局部部100100级级单单向向流流空空气气区区域域内内或或隔隔离系统中进行。离系统中进行。无菌检查：无菌检查：应应在在洁洁净净度度B B级级背背景景下下的的局局部部A A级级单单向向流流空空气气区域内或隔离系统中进行。区域内或隔离系统中进行。3一、环境监测微生物限度检查实验环境的修订微生物限度检查实验环境的修订20102010年版年版20152015年版（原修订稿）年版（原修订稿）微生物限度检查：微生物限度检查：应应在在洁洁净净度度1000010000级级背背景景下下的的局局部部100100级级单单向向流流空空气区域内进行。气区域内进行。微生物限度检查：微生物限度检查：应应在在受受控控环环境境下下（不不低低于于D D级级）的的局局部部不不低低于于B B级单向流空气区域内进行。级单向流空气区域内进行。4一、环境监测GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准洁净度级别悬浮粒子最大允许数/立方米浮游菌cfu/m3沉降菌（）cfu/4小时(2)表面微生物静态静态动态动态接接 触触（）cfu/cfu/碟碟5 5指手指手套套cfu/cfu/手套手套0.50.5m m5.05.0m m(2)(2)0.50.5m m5.05.0m mA A级级352035202020352035202020 1 11 11 11 1B B级级35203520292935200352000 02900290010105 55 55 5C C级级35200352000 02902900 035200352000000290029000 010010050502525D D级级352003520000002902900000不作规不作规定定不作规不作规定定20020010010050505一、环境监测药品洁净实验室监测项目及频次（参考）受控区域受控区域 洁净度级别洁净度级别采样频次采样频次 监测项目监测项目无菌隔离系统无菌隔离系统内部内部每次实验每次实验空空气气悬悬浮浮粒粒子子、浮浮游游菌菌、沉沉降降菌菌、表表面面微生物（手套）微生物（手套）相邻外部相邻外部每月一次每月一次空空气气悬悬浮浮粒粒子子、浮浮游游菌菌、沉沉降降菌菌、表表面面微生物微生物微微生生物物洁洁净净实实验室验室无无菌菌检检查查（以以A/BA/B级级或或A/CA/C级为例）级为例）每次实验每次实验空空气气悬悬浮浮粒粒子子、浮浮游游菌菌、沉沉降降菌菌、表表面面微生物（手套及操作服）微生物（手套及操作服）微微生生物物限限度度检检查查以以A/CA/C级为例）级为例）每周一次每周一次空空气气悬悬浮浮粒粒子子、浮浮游游菌菌、沉沉降降菌菌、表表面面微生物（手套及操作服）微生物（手套及操作服）C C级级每季度一次每季度一次空空气气悬悬浮浮粒粒子子、浮浮游游菌菌、沉沉降降菌菌、表表面面微生物微生物D D级级每半年一次每半年一次空空气气悬悬浮浮粒粒子子、浮浮游游菌菌、沉沉降降菌菌、表表面面微生物微生物6一、环境监测培养基培养基胰胰酪酪大大豆豆胨胨琼琼脂脂（TSATSA）细细菌菌、酵酵母母菌菌和和霉霉菌菌的的生生长长必必要要时时可可加加入入添添加剂消除和减少消毒剂和抗生素的作用。，加剂消除和减少消毒剂和抗生素的作用。，沙氏葡萄糖琼脂沙氏葡萄糖琼脂(SDA)(SDA)（当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时）（当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时）培养时间：培养时间：ChP(2015)GB/T 16293-2010 ChP(2015)GB/T 16293-2010 TSA:3-5 TSA:3-5天天 不少于不少于2 2天天 SDA:5-7 SDA:5-7天天 不少于不少于5 5天天7二、无菌检查1.总则：环境、设备、人员环境、设备、人员2.培养基：品种、制备、灭菌、贮存、品种、制备、灭菌、贮存、适用性检查适用性检查3.方法适用性试验：直接接种法、薄膜过滤法直接接种法、薄膜过滤法4.供试品的无菌检查：供供试试品品的的处处理理、对对照照试试验验、直直接接接接种种法、薄膜过滤法、培养及观察法、薄膜过滤法、培养及观察5.结果判断8二、无菌检查1.总则1）对象：无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。验条件下未发现微生物污染。9二、无菌检查2）环境：应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，（9203 药品微生物实验室质量管理指导原则:环境洁净度B 级背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行）【10版：应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行】，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。A 级和 B 级区域的空气供给应通过终端高效空气过滤器（HEPA）。10二、无菌检查3）人员：【10版：无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。】15版删除。11二、无菌检查2 2、培养基、培养基内容2010版2015版培培养养系系统统硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基改良马丁培养基选择性培养基选择性培养基0.5%0.5%葡萄糖肉汤培养基葡萄糖肉汤培养基营养肉汤培养基营养肉汤培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基改良马丁琼脂培养基改良马丁琼脂培养基硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨液体培养基中和或灭活用中和或灭活用培养基培养基 0.5%0.5%葡萄糖肉汤培养基葡萄糖肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基胰酪大豆胨琼脂培养基沙氏葡萄糖肉汤培养基沙氏葡萄糖肉汤培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基12二、无菌检查2.培养基硫乙醇酸盐流体培养基主主要要用用于于厌厌氧氧菌菌的的培培养养，也也可用于需气菌培养。可用于需气菌培养。胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。适用于真菌和需气菌的培养。1）培养基的制备及培养条件 配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌 制备好的培养基应保存在225、避光的环境 若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。13二、无菌检查2）培养基适用性检查无无菌菌检检查查用用的的硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐流流体体培培养养基基和和胰胰酪酪大大豆豆胨胨液液体体培培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本本检检查查可可在在供供试试品品的的无无菌菌检检查查前前或或与与供供试试品品的的无无菌菌检检查查同同时进行。时进行。14二、无菌检查2）培养基适用性检查无菌性检查无菌性检查:每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），置各培养基规定的温度培养 14天，应无菌生长。灵敏度检查灵敏度检查 菌种菌种试验用菌株的传代次数不得超过不得超过5代代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。菌液：浓度100cfu/ml接种：2管+菌液，1管空白结果判断：+菌液-生长良好 空白-无菌生长15二、无菌检查2灵敏度检查 菌液制备:取菌种新鲜培养物接种至相应培养基，培养。取菌种新鲜培养物接种至相应培养基，培养。金黄色葡萄球菌胰酪大豆胨液体（琼脂）培养基胰酪大豆胨液体（琼脂）培养基【1010版版：营营养养肉肉汤汤培培养养基基或或营营养养琼脂培养基琼脂培养基 】30353035 18h24h 18h24h 铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基 白色念珠菌沙沙氏氏葡葡萄萄糖糖液液体体（琼琼脂脂）培培养养基基 【1010版版：改改良良马马丁丁（琼琼脂脂）培培养养基基 】20252025【1010版版：23-28 23-28 】24h48h24h48h黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基或或用用适适宜宜方方法法制制成成孢孢子子悬悬液液 【1010版：改良马丁琼脂斜面培养基版：改良马丁琼脂斜面培养基 】5d7d5d7d上述培养物用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu的菌悬液。16二、无菌检查2培养基灵敏度检查培养基接种:取取每每管管装装量量为为12ml12ml的的硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐流流体体培培养养基基7 7支支，每每管管装装量量为为9ml9ml的的胰胰酪酪大大豆豆胨胨液液体体培培养养基基7 7支支,分分别别接接种种相相应应菌菌液液。逐逐日日观观察察结结果。果。金黄色葡萄球菌各各2 2支支硫乙醇酸盐流体培养基30303535 3d3d铜绿假单胞菌生孢梭菌空白1 1支支枯草芽孢杆菌各各2 2支支胰酪大豆胨液体培养基【1010版版：改改良良马马丁培养基】丁培养基】202025 25 5d5d白色念珠菌黑曲霉空白1 1支支结果判定结果判定:空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。17二、无菌检查3.方法适用性试验（方法验证试验）当当进进行行产产品品无无菌菌检检查查法法时时，应应进进行行方方法法适适用用性性试试验验，以以确确认认所所采采用用的的方方法法适适合合于于该该产产品品的的无无菌菌检检查查。若若检检验验程程序序或或产产品品发发生生变变化化可可能能影影响响检检验验结结果果时时，应应重重新新进进行行方方法法适适用性试验。用性试验。验验证证时时，按按“供供试试品品的的无无菌菌检检查查”的的规规定定及及下下列列要要求求进进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行。18二、无菌检查4.供试品的无菌检查无菌检查法包括无菌检查法包括 薄膜过滤法 直接接种法只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。19二、无菌检查4.供试品的无菌检查阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌：应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于100CFU，供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养4872 小时应生长良好。阴性对照供供试试品品无无菌菌检检查查时时，应应取取相相应应溶溶剂剂和和稀稀释释液液、冲冲洗洗液液同同法法操操作作，作作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。20二、无菌检查4.供试品的无菌检查1.薄膜过滤法 薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。【10版删除：可用一般薄膜过滤器】。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45m。直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。【10版删除：抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。】使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。21二、无菌检查4.供试品的无菌检查1.薄膜过滤法 水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤每张滤膜每次冲洗量一般为膜每次冲洗量一般为100ml100ml，且总冲洗量不得超过，且总冲洗量不得超过1000ml1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。，以避免滤膜上的微生物受损伤。22二、无菌检查2.直接接种法 直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培养基接种的支/瓶数相等；生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2：1。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml。供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适用性试验。23二、无菌检查4.供试品的无菌检查培养及观察 将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养14天；接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份，一份置3035培养，一份置2025培养。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14 天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养3 天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。24二、无菌检查4.供试品的无菌检查结果判断 阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。25二、无菌检查4.供试品的无菌检查结果判断 当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效：（1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。（2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。（3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。26三、微生物限度检查（微生物计数法）1 总则：环境、要求环境、要求2 计数方法：平皿法、薄膜过滤法、平皿法、薄膜过滤法、最可能数法（最可能数法（MPNMPN法）法）3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验：菌菌种及菌液制备、培养基适用性检查、计数方法适用性试验、种及菌液制备、培养基适用性检查、计数方法适用性试验、4 供试品检查：检验量、供试品检查检验量、供试品检查5 结果判断27三、微生物限度检查（微生物计数法）1 总则：微微生生物物计计数数法法系系用用于于能能在在有有氧氧条条件件下下生生长长的的嗜嗜温温细细菌菌和和真真菌菌的计数。的计数。当当本本法法用用于于检检查查非非无无菌菌制制剂剂及及其其原原、辅辅料料等等是是否否符符合合规规定定的的微微生生物物限限度度标标准准时时，应应按按规规定定进进行行检检验验，包包括括样样品品的的取取样样量量和和结结果果的的判判断断等等。除除另另有有规规定定外外，本本法法不不适适用用于于活活菌菌制制剂剂的检查。的检查。本本检检查查法法可可采采用用替替代代的的微微生生物物检检查查法法，包包括括自自动动检检测测方方法法，但但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。28三、微生物限度检查（微生物计数法）1 总则：环境：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内】。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。29三、微生物限度检查（微生物计数法）1 总则：如如供供试试品品有有抗抗菌菌活活性性，应应尽尽可可能能去去除除或或中中和和。供供试试品品检检查查时时,若若使使用用了了中中和和剂剂或或灭灭活活剂剂，应应确确认认其其有有效效性及对微生物无毒性。性及对微生物无毒性。供供试试液液制制备备时时如如果果使使用用了了表表面面活活性性剂剂，应应确确认认其其对对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。30三、微生物限度检查（微生物计数法）2计数方法：平皿法薄膜过滤法最可能数法（Most-Probable-NumberMethodMost-Probable-NumberMethod，简简称称MPN MPN 法法）。MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。供供试试品品检检查查时时,应应根根据据供供试试品品理理化化特特性性和和微微生生物物限限度度标标准准等等因因素素选选择择计计数数方方法法，所所选选的的方方法法必必须须具具备备检检测测充充足足样样品品量量的的能能力力，以以保保证证所所获获得得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。31三、微生物限度检查（微生物计数法）3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验供供试试品品微微生生物物计计数数中中所所使使用用的的培培养养基基应应进进行行适适用用性性检查。检查。供供试试品品的的微微生生物物计计数数方方法法应应进进行行方方法法适适用用性性试试验验【1010版版：方方法法验验证证】，以以确确认认所所采采用用的的方方法法适适合合于于该该产品的微生物计数。产品的微生物计数。若若检检验验程程序序或或产产品品发发生生变变化化可可能能影影响响检检验验结结果果时时，计数方法应重新进行适用性试验。计数方法应重新进行适用性试验。32三、微生物限度检查（微生物计数法）3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验3.13.1菌液制备及使用菌液制备及使用3.23.2计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查3.33.3计数方法适用性试验计数方法适用性试验33三、微生物限度检查（微生物计数法）3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验3.13.1菌液制备及使用菌液制备及使用 菌种菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。34三、微生物限度检查（微生物计数法）3.1菌液制备及使用试验菌株试验菌液的制备金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌CMCC(B)CMCC(B)26 26 003)003)胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基【1010版：营养肉汤或营养琼脂培养基】版：营养肉汤或营养琼脂培养基】30303535，18182424小时小时铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌CMCCCMCC（B)10 B)10 104104枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌CMCC(B)CMCC(B)63 63 501501白色念珠菌白色念珠菌CMCC(F)98 001CMCC(F)98 001沙沙氏氏葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基基或或沙沙氏氏葡葡萄萄糖糖液液体体培培养养基基，20202525，2 23 3天天 【1010版版：改改良良马马丁丁（琼琼脂脂）培培养养基基，2328 2328 ，2448h2448h】黑曲霉黑曲霉CMCC(F)98 003CMCC(F)98 003沙沙氏氏葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基基或或马马铃铃薯薯葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基基 ，20202525，5 57 7天天 ，或直接获得丰富孢子，或直接获得丰富孢子【1010版版：改改良良马马丁丁琼琼脂脂斜斜面面培培养养基基，2328 2328 ，5757天天】35三、微生物限度检查（微生物计数法）3.2计数培养基适用性检查【15版】需氧菌总数计数金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨液体培养基303035 35 不超过不超过3 3天天铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌胰酪大豆胨琼脂培养基3035 不超过5天黑曲霉霉霉菌菌和和酵酵母母菌菌总数计数总数计数白色念珠菌白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基202025 25 不超过不超过5 5天天黑曲霉黑曲霉36三、微生物限度检查（微生物计数法）3.23.2计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查【1515版】版】每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量不大于100cfu；同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试结果判定：结果判定：被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2 范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。37三、微生物限度检查（微生物计数法）3.33.3计数方法适用性试验计数方法适用性试验供试液制备接种和稀释抗菌活性的去除与灭活供试品中微生物的回收平皿法薄膜过滤法最可能数法（MPN 法）结果判断38三、微生物限度检查（微生物计数法）4 供试品检查4.1检验量 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml 或cm）。除另有规定外,一般供试品的检验量为10g 或10ml；膜剂为100cm；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时,应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品,大蜜丸还不得少于4 丸,膜剂还不得少于4 片。一般应随机抽取供试品，取规定容器数，混合，取规定量供试品进行检验。39三、微生物限度检查（微生物计数法）4.2供试品检查按按计计数数方方法法适适用用性性试试验验确确认认的的计计数数方方法法进进行行供供试试品品中中需需氧氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。胰胰酪酪大大豆豆胨胨琼琼脂脂培培养养基基或或胰胰酪酪大大豆豆胨胨液液体体培培养养基基用用于于测测定定需氧菌总数；需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。阴性对照试验 以稀释剂代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。40三、微生物限度检查（微生物计数法）4.2供试品检查供试液制备 根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过 45。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过 1小时。常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。41三、微生物限度检查（微生物计数法）4.2供试品检查供试液制备 水溶性供试品水溶性供试品 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。42三、微生物限度检查（微生物计数法）供试液制备 水不溶性非油脂类供试品水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或 pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成 1:10 供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如 0.1%的聚山梨酯 80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液 pH值至 68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10倍系列稀释。43三、微生物限度检查（微生物计数法）供试液制备 油脂类供试品油脂类供试品 取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯 80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般不超过 40（特殊情况下，最多不超过 45），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释液使成 110供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面活性剂的稀释液进一步 10倍系列稀释。44三、微生物限度检查（微生物计数法）4.2供试品检查平皿法 平皿法包括倾注法和涂布法。除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2个平皿。培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在3035培养3天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在2025培养5 天，观察菌落生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15，则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。45三、微生物限度检查（微生物计数法）菌数报告规则 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm 供试品中所含的微生物数。如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1 时，以1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。46三、微生物限度检查（微生物计数法）薄膜过滤法 除另有规定外，按计数方法适用性试验确认的方法进行供试液制备。取相当于1g、1ml 或10 cm 供试品的供试液，若供试品所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液，照方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养。培养和计数 培养条件和计数方法同平皿计数法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。47三、微生物限度检查（微生物计数法）菌数报告规则 以相当于 1g、1ml 或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以1 报告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml 或10cm2供试品）,或1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。48三、微生物限度检查（微生物计数法）MPN 法 取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和供试品接种，所有试验管在3035培养35 天，如果需要确认是否有微生物生长，按方法适应性试验确定的方法进行。记录每一稀释级微生物生长的管数，从表3查对每1g 或1ml 供试品中需氧菌总数的最可能数。49三、微生物限度检查（微生物计数法）5结果判断需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数）；需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数）；霉霉菌菌和和酵酵母母菌菌总总数数是是指指沙沙氏氏葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基基上上生生长长的的总总菌菌落落数数（包包括括细细菌菌菌菌落数）。落数）。若若因因沙沙氏氏葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基基上上生生长长的的细细菌菌使使霉霉菌菌和和酵酵母母菌菌的的计计数数结结果果不不符符合合微微生生物物限限度度要要求求，可可使使用用含含抗抗生生素素（如如氯氯霉霉素素、庆庆大大霉霉素素）的的沙沙氏氏葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基或其他选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。基或其他选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。使使用用选选择择性性培培养养基基时时，应应进进行行培培养养基基适适用用性性检检查查。若若采采用用MPN MPN 法法，测测定定结结果果为为需氧菌总数。需氧菌总数。50三、微生物限度检查（微生物计数法）5结果判断各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：101cfu：可接受的最大菌数为20；102cfu：可接受的最大菌数为200；103cfu：可接受的最大菌数为2000：依此类推。若若供供试试品品的的需需氧氧菌菌总总数数、霉霉菌菌和和酵酵母母菌菌总总数数的的检检查查结结果果均均符符合合该该品品种种项项下下的的规规定定，判判供供试试品品符符合合规规定定；若若其其中中任任何何一一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。51三、微生物限度检查（控制菌检查法）2.非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法2.1 总则：环境、要求环境、要求2.2 培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验：菌菌种种及及菌菌液液制制备备、培培养养基基适适用用性性检检查查、控控制制菌菌检检查查方方法法适适用用性性试试验、验、2.3 供试品检查：阴阴性性对对照照试试验验、阳阳性性对对照照试试验验、耐耐胆胆盐盐革革兰兰阴阴性性菌菌、大大肠肠埃埃希希菌菌、沙沙门门菌菌、铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌、金金黄黄色色葡葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌萄球菌、梭菌、白色念珠菌52三、微生物限度检查（控制菌检查法）2.1总则控控制制菌菌检检查查法法系系用用于于在在规规定定的的试试验验条条件件下下，检检查查供供试试品品中中是是否否存存在在特特定定的的微微生生物。物。当当本本法法用用于于检检查查非非无无菌菌制制剂剂及及其其原原、辅辅料料是是否否符符合合相相应应的的微微生生物物限限度度标标准准时时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。本本检检查查法法可可采采用用替替代代的的微微生生物物检检查查法法，包包括括自自动动检检测测方方法法，但但必必须须证证明明替替代代方方法等效于药典规定的检查方法。法等效于药典规定的检查方法。供供试试液液制制备备及及实实验验环环境境要要求求同同“非非无无菌菌产产品品微微生生物物限限度度检检查查：微微生生物物计计数数法法”（通则（通则11051105）。）。如如果果供供试试品品具具有有抗抗菌菌活活性性，应应尽尽可可能能去去除除或或中中和和。供供试试品品检检查查时时,若若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。供供试试液液制制备备时时如如果果使使用用了了表表面面活活性性剂剂，应应确确认认其其对对微微生生物物无无毒毒性性以以及及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。与所使用中和剂或灭活剂的相容性。53三、微生物限度检查（控制菌检查法）2.2 培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验2.2.12.2.1菌液制备菌液制备2.2.22.2.2培养基的适用性检查培养基的适用性检查2.2.22.2.2控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查用培养基的适用性检查2.2.32.2.3控制菌检查方法适用性试验控制菌检查方法适用性试验54三、微生物限度检查（控制菌检查法）2.2.1菌液制备试验菌株试验菌液的制备金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003)胰胰酪酪大大豆豆胨胨琼琼脂脂培培养养基基或或胰胰酪酪大大豆豆胨胨液液体体培培养基养基3035，1824小时小时铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌CMCC（B)10104大肠埃希菌大肠埃希菌CMCC（B）44102乙乙型型副副伤伤寒寒沙沙门门菌菌CMCC（B）50094白色念珠菌白色念珠菌CMCC(F)98001沙沙氏氏葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基基或或沙沙氏氏葡葡萄萄糖糖液液体体培培养基，养基，2025，23天天生孢梭菌生孢梭菌CMCC（B）64941梭梭菌菌增增菌菌培培养养基基，厌厌氧氧条条件件下下3035，2448小小时时或或接接种种于于硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐流流体体培培养养基基中中3035，1824小时小时55三、微生物限度检查（控制菌检查法）菌菌液液制制备备后后若若在在室室温温下下放放置置，应应在在2 2 小小时时内内使使用用；若若保保存存在在2 288，可可在在2424小小时时内内使使用用。生生孢孢梭梭菌菌孢孢子子悬悬液液可可替替代代新新鲜鲜的的菌菌悬悬液液，稳稳定定的的孢孢子子悬悬液液可可保保存存在在2 288，在在验验证证过的贮存期内使用。过的贮存期内使用。56三、微生物限度检查（控制菌检查法）2.2.2控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查用培养基的适用性检查，检查项目包括控制菌检查用培养基的适用性检查，检查项目包括 促生长能力促生长能力 抑制能力抑制能力 指示能力指示能力各培养基的检测项目及所用菌株见表各培养基的检测项目及所用菌株见表1 1。57三、微生物限度检查（控制菌检查法）2.2.2控制菌检查用培养基的适用性检查表1控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示特性控制菌检查培养基特性试验菌株耐胆盐革兰氏阴性菌【15版：新增】肠道菌增菌液体培养基促生长能力大肠埃希菌铜绿假单胞菌抑制能力金黄色葡萄球菌紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基促生长能力+指示特性大肠埃希菌大肠埃希菌麦康凯液体培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌麦康凯琼脂培养基促生长能力+指示特性大肠埃希菌【10版：大肠菌群】乳糖胆盐发酵培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌乳糖发酵培养基 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 58三、微生物限度检查（控制菌检查法）液体培养基促生长能力检查 分别接种不大于100cfu 的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。固体培养基促生长能力检查 用涂布法分别接种不大于100cfu【10版：50100cfu】的试验菌于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。59三、微生物限度检查（控制菌检查法）培养基抑制能力检查 接种不少于不少于100cfu100cfu 的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不短于规定的最长培养时间下培养，试验菌应不得生长。培养基指示特性检查 用涂布法分别接种不大于不大于100cfu100cfu 的试验菌于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。60三、微生物限度检查（控制菌检查法）2.2.3控制菌检查方法适用性试验 试验菌 根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验菌株，确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时,采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。结果判断 上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法适用性试验。如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不可能存在于该供试品中，选择抑菌成份消除相对彻底的方法进行供试品的检查。61三、微生物限度检查（控制菌检查法）2.3供试品检查供试品的控制菌检查应按经方法适用性试验确认的方法进行。供试品的控制菌检查应按经方法适用性试验确认的方法进行。供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。阳性对照试验 阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查,对照菌的加量应不大于100cfu。阳性对