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微生物检验相关知识微生物检验相关知识微生物定义及特点微生物定义及特点 微生物：是一群形体细小、结构简单、人肉眼微生物：是一群形体细小、结构简单、人肉眼看不见，必须借助于光学显微镜、电子显微镜看不见，必须借助于光学显微镜、电子显微镜放大几百倍、几千倍甚至几万倍才能看到的生放大几百倍、几千倍甚至几万倍才能看到的生物物微生物分布广、种类多适应强、易变异体积小、面积大代谢强、繁殖快微生物分类微生物分类微生物非细胞形态细胞形态病毒原核生物真核生物细菌、支原体、衣原体蓝细菌藻类原生动物霉菌、酵母菌细菌分类细菌分类细菌呼吸类型分代谢类型分细胞结构（染色）分形态分球状、杆状、螺旋状自养型、异养型需氧、厌氧、兼性厌氧G+、G-细菌形态细菌形态球状杆状 弧形或螺旋形细菌结构（染色）细菌结构（染色）G-G+细菌结构细菌结构基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、核质特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢标本的采集与处理标本的采集与处理标本的采集与处理标本的采集与处理血液、骨髓、脑脊液标本血液、骨髓、脑脊液标本血液、骨髓、脑脊液标本血液、骨髓、脑脊液标本痰液标本痰液标本痰液标本痰液标本尿液、粪便标本尿液、粪便标本尿液、粪便标本尿液、粪便标本眼耳鼻喉拭子、脓液及其他无菌标本眼耳鼻喉拭子、脓液及其他无菌标本眼耳鼻喉拭子、脓液及其他无菌标本眼耳鼻喉拭子、脓液及其他无菌标本标本的采集与处理标本的采集与处理v1 1、所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，、所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染原则下认真进行。防止污染原则下认真进行。v2 2、已采集标本都应置于防漏、密闭的容器中运、已采集标本都应置于防漏、密闭的容器中运送。已采集标本，常规性细菌学检验，不超过送。已采集标本，常规性细菌学检验，不超过1h1h送实验室。保存在送实验室。保存在44也不能超过也不能超过24h24h。标本的采集与处理标本的采集与处理v3 3、每份标本都应标记患者姓名、化验单联号、每份标本都应标记患者姓名、化验单联号、标本来源、检验目的、日期及相关临床信息。标本来源、检验目的、日期及相关临床信息。收到标本认真查对，看标本留取是否合格。收到标本认真查对，看标本留取是否合格。v4 4、避免来自寄生菌的污染，应当保证每份标本、避免来自寄生菌的污染，应当保证每份标本代表感染过程。如来自皮肤、呼吸道的正常菌代表感染过程。如来自皮肤、呼吸道的正常菌群过早、过度生长，会干扰培养结果。分离时群过早、过度生长，会干扰培养结果。分离时应区别标本中是常居菌群的污染还是致病菌。应区别标本中是常居菌群的污染还是致病菌。标本的采集与处理标本的采集与处理v5 5、分离细菌的目的：查找与疾病相关的微生物、分离细菌的目的：查找与疾病相关的微生物及其对抗生素的敏感性，帮助临床诊断、治疗、及其对抗生素的敏感性，帮助临床诊断、治疗、预后和流行病学的调查。预后和流行病学的调查。v6 6、如疑似对低温敏感的淋病奈瑟菌、脑膜炎奈、如疑似对低温敏感的淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌感染标本应立即处理。脑瑟菌、流感嗜血杆菌感染标本应立即处理。脑脊液、生殖道、眼睛、内耳标本决不可冷藏。脊液、生殖道、眼睛、内耳标本决不可冷藏。血液、骨髓、脑脊液标本血液、骨髓、脑脊液标本v血培养仪所用培养基的种类：血培养仪所用培养基的种类：需氧（成人、儿童）、厌氧、真菌培养基。需氧（成人、儿童）、厌氧、真菌培养基。标本用量：标本用量：l 采血量：成人采血量：成人8-10ml8-10ml，儿童，儿童1-3ml1-3ml；l 骨髓用量：骨髓用量：1-3ml1-3ml；l 真菌：真菌：1-5ml1-5ml；l 厌氧菌：厌氧菌：3-10ml 3-10ml。血液、骨髓、脑脊液标本血液、骨髓、脑脊液标本v培养仪上阳性报警标本要及时处理：消警、登记培养仪上阳性报警标本要及时处理：消警、登记报警时间、用注射器抽取培养液接种平板，血平报警时间、用注射器抽取培养液接种平板，血平板分离各类细菌特别板分离各类细菌特别-溶血链球菌，肺炎链球菌；溶血链球菌，肺炎链球菌；巧克力平板于巧克力平板于COCO2 2环境分离嗜血杆菌、奈瑟菌。环境分离嗜血杆菌、奈瑟菌。真菌培养接种两个真菌培养接种两个TTC-TTC-沙氏平板，分别放室温沙氏平板，分别放室温2222及及3535孵育孵育24-48h24-48h。均需分区划线。均需分区划线。血液、骨髓、脑脊液标本血液、骨髓、脑脊液标本v然后涂片革兰染色镜检，把镜检结果及时电话然后涂片革兰染色镜检，把镜检结果及时电话通知临床医生，并填写初检结果临床通知单。通知临床医生，并填写初检结果临床通知单。v常规培养常规培养5 5天，认为阴性者，报告无菌生长，天，认为阴性者，报告无菌生长，正常人的血液、骨髓是无菌的，标本中检出正常人的血液、骨髓是无菌的，标本中检出 细菌，都应视作病原菌细菌，都应视作病原菌 需排除污染需排除污染血液、骨髓、脑脊液标本血液、骨髓、脑脊液标本脑脊液：脑脊液：v涂片查抗酸杆菌：脑脊液涂片查抗酸杆菌：脑脊液以以4000r/min4000r/min离心离心30min30min，取沉淀物涂片，做抗酸染取沉淀物涂片，做抗酸染色。色。v涂片查新型隐球菌：将脑涂片查新型隐球菌：将脑脊液离心沉淀物进行墨汁脊液离心沉淀物进行墨汁染色，在黑色背景中见到染色，在黑色背景中见到菌体周围有透明荚膜，有菌体周围有透明荚膜，有时可见出芽的酵母菌。时可见出芽的酵母菌。血液、骨髓、脑脊液标本血液、骨髓、脑脊液标本v脑脊液培养用血培养仪，阳性报警标本处理同脑脊液培养用血培养仪，阳性报警标本处理同血培养。血培养。v注意：涂片检到平面相对、成双排列注意：涂片检到平面相对、成双排列G GC,C,可报可报告告“找到找到G GC,C,形似脑膜炎奈瑟菌形似脑膜炎奈瑟菌”。巧克力平。巧克力平板于板于COCO2 2环境分离脑膜炎奈瑟菌和嗜血杆菌。环境分离脑膜炎奈瑟菌和嗜血杆菌。痰液标本痰液标本v痰应用冷开水漱口咳痰，痰应用冷开水漱口咳痰，2h2h内送实验室。内送实验室。培养前的处理：向痰液内加等量的胰酶溶液，培养前的处理：向痰液内加等量的胰酶溶液，放置放置35 30min35 30min使痰均质化。然后挑选痰液中使痰均质化。然后挑选痰液中脓性或带血部分涂片直接镜检看白细胞和上皮脓性或带血部分涂片直接镜检看白细胞和上皮细胞及真菌，待干后革兰染色检查细菌和真菌。细胞及真菌，待干后革兰染色检查细菌和真菌。标本信息及镜检结果都要登记。标本信息及镜检结果都要登记。痰液标本痰液标本v痰涂片目的有二：其一为确定标本是否适合做痰涂片目的有二：其一为确定标本是否适合做细菌培养。符合要求的痰标本应在低倍视野中细菌培养。符合要求的痰标本应在低倍视野中白细胞白细胞2525个，上皮细胞个，上皮细胞1010个。其二是初步判个。其二是初步判定是否有病原菌存在。定是否有病原菌存在。痰液标本痰液标本v痰直接涂片查细菌、真菌：挑选痰液中脓性或痰直接涂片查细菌、真菌：挑选痰液中脓性或带血部分，涂成均匀薄片，进行革兰染色，镜带血部分，涂成均匀薄片，进行革兰染色，镜检。检。v痰涂片查抗酸杆菌：把痰前处理液加入痰标本痰涂片查抗酸杆菌：把痰前处理液加入痰标本中，两者比例约中，两者比例约2 2：1 1，混合均匀，放室温静置，混合均匀，放室温静置10-20min10-20min，待粘液完全液化，倒试管离心，待粘液完全液化，倒试管离心3000r/min5-10min3000r/min5-10min，取沉淀物涂片抗酸染色镜，取沉淀物涂片抗酸染色镜检。检。痰液标本痰液标本v培养基选择：血平板分离各类细菌特别培养基选择：血平板分离各类细菌特别 溶血链溶血链球菌，肺炎链球菌。加万古巧克力于球菌，肺炎链球菌。加万古巧克力于COCO2 2环境分环境分离嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌。麦康凯分离革兰离嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌。麦康凯分离革兰阴性杆菌。真菌培养接种两个阴性杆菌。真菌培养接种两个TTC-TTC-沙氏平板，沙氏平板，分别放室温分别放室温2222及及3535孵育孵育24-48h24-48h。均需分区。均需分区划线。划线。尿液、粪便标本尿液、粪便标本尿液尿液v中段尿采集：清洁外阴及尿道口周围，自然排中段尿采集：清洁外阴及尿道口周围，自然排尿，让尿流不间停，截留中段尿不少于尿，让尿流不间停，截留中段尿不少于1ml1ml。2h2h内送交实验室，在内送交实验室，在4C4C也不能超过也不能超过24h24h。实验室。实验室接到标本应立即处理。细菌培养接种血平板和接到标本应立即处理。细菌培养接种血平板和麦康凯，真菌培养选用麦康凯，真菌培养选用TTC-TTC-沙保罗平板。沙保罗平板。尿液、粪便标本尿液、粪便标本v尿定量培养：用尿定量培养：用10ul10ul定量接种环取尿液标本划定量接种环取尿液标本划线于血平板上呈一条直线，不要划到底，然后线于血平板上呈一条直线，不要划到底，然后沿直线左右划线，从上而下一次完成，不可来沿直线左右划线，从上而下一次完成，不可来回划线和分区划线。回划线和分区划线。置置3535培养培养18-24h18-24h，生长，生长菌落数乘以菌落数乘以100100，可求出每毫升生长菌落数。，可求出每毫升生长菌落数。尿液、粪便标本尿液、粪便标本v涂片查细菌、真菌：尿液以涂片查细菌、真菌：尿液以3000r/min3000r/min离心离心30min30min，取沉淀物涂片革兰染色镜检。，取沉淀物涂片革兰染色镜检。v涂片查抗酸杆菌：尿液以涂片查抗酸杆菌：尿液以4000r/min4000r/min离心离心30min30min，取沉淀物涂片抗酸染色镜检。，取沉淀物涂片抗酸染色镜检。尿液、粪便标本尿液、粪便标本v注意：注意：10%10%的尿路感染患者，可能会在同份尿标的尿路感染患者，可能会在同份尿标本中分离到本中分离到2 2种细菌，并都是病原菌。若同份标种细菌，并都是病原菌。若同份标本中检到本中检到3 3种以上不同种微生物，应认为收集或种以上不同种微生物，应认为收集或处理标本不当被污染，一般认为：尿标本中革处理标本不当被污染，一般认为：尿标本中革兰阴性杆菌菌落计数兰阴性杆菌菌落计数10105 5 CFU/ml CFU/ml、革兰阳性球、革兰阳性球菌计数菌计数10104 4CFU/mlCFU/ml有诊断意义，报告鉴定结果有诊断意义，报告鉴定结果及药敏试验。及药敏试验。尿液、粪便标本尿液、粪便标本粪便粪便v涂片检查：当检查霍乱弧菌以及菌群失调优势涂片检查：当检查霍乱弧菌以及菌群失调优势菌时需作直接涂片检查。取新鲜标本涂片革兰菌时需作直接涂片检查。取新鲜标本涂片革兰染色镜检：染色镜检：有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌；有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌；各种菌在涂片中所占相对比例、推断主各种菌在涂片中所占相对比例、推断主要优势菌；要优势菌；有革兰阳性芽生孢子和假菌丝即报告检有革兰阳性芽生孢子和假菌丝即报告检出酵母样菌。真菌也可湿片检查。出酵母样菌。真菌也可湿片检查。尿液、粪便标本尿液、粪便标本v一般培养：直接挑取标本中脓血部分接种一般培养：直接挑取标本中脓血部分接种SSSS平平板和血平板严格按照三区划线，保证有单个菌板和血平板严格按照三区划线，保证有单个菌落的分离，置落的分离，置3535培养。培养。尿液、粪便标本尿液、粪便标本v真真菌菌培培养养：将将标标本本接接种种两两个个TTC-TTC-沙沙氏氏平平板板及及血血平平板板，置置25-3025-30和和3535孵孵育育24-48h24-48h。真真菌菌性性腹腹泻泻多多继继发发于于抗抗生生素素治治疗疗后后，常常见见有有白白色色假假丝丝酵母菌。酵母菌。眼耳鼻喉拭子眼耳鼻喉拭子v根据这些部位感染细菌的特点，须用血平板和根据这些部位感染细菌的特点，须用血平板和巧克力平板作分离培养，必要时加选麦康凯，巧克力平板作分离培养，必要时加选麦康凯，需分区划线。巧克力平板在需分区划线。巧克力平板在COCO2 2 环境中孵育，环境中孵育，利于肺炎链球菌、嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌的利于肺炎链球菌、嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌的生长。生长。尿液、粪便标本尿液、粪便标本v对化验单上明确要求做霍乱弧菌培养以及霍乱对化验单上明确要求做霍乱弧菌培养以及霍乱弧菌快检阳性的均应做霍乱弧菌培养，以便确弧菌快检阳性的均应做霍乱弧菌培养，以便确诊和做进一步分型。方法是取一环大便标本或诊和做进一步分型。方法是取一环大便标本或碱性蛋白胨水增菌液接种碱性平板或碱性蛋白胨水增菌液接种碱性平板或TCBSTCBS平板平板及血平板，要求三区划线，然后置及血平板，要求三区划线，然后置3535孵箱中孵箱中孵育。孵育。眼耳鼻喉拭子眼耳鼻喉拭子v涂片检查：将拭子直接在玻片上涂片，革兰染涂片检查：将拭子直接在玻片上涂片，革兰染色镜检查细菌、真菌，如果查真菌还可以湿片色镜检查细菌、真菌，如果查真菌还可以湿片直接在高倍镜下检查芽生孢子和假菌丝。直接在高倍镜下检查芽生孢子和假菌丝。（正常人的眼内，中耳及鼻窦内是无菌的。）（正常人的眼内，中耳及鼻窦内是无菌的。）脓液脓液标本的处理标本的处理v涂片检查：脓液标本在培养的同时均须涂片，涂片检查：脓液标本在培养的同时均须涂片，涂片的结果一方面为临床提供最初的诊治依据，涂片的结果一方面为临床提供最初的诊治依据，另一方面可作为分离培养的质量指标。另一方面可作为分离培养的质量指标。v涂片直接做革兰染色，镜下可观察细菌和酵母涂片直接做革兰染色，镜下可观察细菌和酵母样菌。涂片做抗酸染色镜检查抗酸杆菌。样菌。涂片做抗酸染色镜检查抗酸杆菌。脓液脓液标本的处理标本的处理v注意：对无菌部位的感染，从分泌物中分离到注意：对无菌部位的感染，从分泌物中分离到细菌，一般均有临床意义。细菌，一般均有临床意义。v烧伤创面脓液或分泌物中，以铜绿假单胞菌最烧伤创面脓液或分泌物中，以铜绿假单胞菌最多见，次为金黄色葡萄球菌，再次为变形杆菌，多见，次为金黄色葡萄球菌，再次为变形杆菌，而大肠埃希菌、肺炎克雷伯、粪产碱杆菌及白而大肠埃希菌、肺炎克雷伯、粪产碱杆菌及白色念珠菌感染亦不少见。色念珠菌感染亦不少见。脓液脓液标本的处理标本的处理v淋病奈瑟菌涂片，注意细菌形态是否典型，革淋病奈瑟菌涂片，注意细菌形态是否典型，革兰阴性球菌，平面相对、成双排列分布在细胞兰阴性球菌，平面相对、成双排列分布在细胞内或外。内或外。v培养：血琼脂平板和麦康凯琼脂平板是基础的培养：血琼脂平板和麦康凯琼脂平板是基础的分离培养基，另外应接种巧克力平板，置分离培养基，另外应接种巧克力平板，置COCO2 2环环境中孵育，可分离嗜血杆菌和奈瑟菌。以分区境中孵育，可分离嗜血杆菌和奈瑟菌。以分区划线法接种。划线法接种。无菌体液标本无菌体液标本v无无菌菌体体液液是是指指血血液液骨骨髓髓和和脑脑脊脊液液外外的的羊羊膜膜液液、后后穹穹隆隆穿穿刺刺液液、透透析析液液、心心包包液液、腹腹膜膜穿穿刺刺液液和滑膜液。和滑膜液。无菌体液标本无菌体液标本v涂涂片片检检查查：这这类类标标本本因因原原部部位位是是无无菌菌的的，只只要要检检出出细细菌菌即即可可做做出出诊诊断断。所所以以，直直接接涂涂片片很很重重要。要。v标标本本如如为为浆浆液液，可可先先经经3000r/min3000r/min离离心心，取取沉沉淀淀涂涂片片。如如为为脓脓液液，可可直直接接涂涂片片。涂涂片片固固定定后后，作革兰染色和抗酸染色。作革兰染色和抗酸染色。无菌体液标本无菌体液标本v涂涂片片做做抗抗酸酸染染色色很很重重要要，不不少少感感染染有有结结核核性性的的，另另外外奴奴卡卡菌菌和和放放线线菌菌是是部部分分抗抗酸酸性性的的，作作抗抗酸酸染色也有利于发现这类细菌的存在。染色也有利于发现这类细菌的存在。无菌体液标本无菌体液标本v胸水和腹水的涂片在观察时应予注意是单一菌胸水和腹水的涂片在观察时应予注意是单一菌种，还是混合菌感染。因为胸腔和腹腔内器官种，还是混合菌感染。因为胸腔和腹腔内器官的感染往往是混合菌引起的。胸水涂片中如见的感染往往是混合菌引起的。胸水涂片中如见到梭形革兰阴性杆菌，说明有厌氧菌的感染可到梭形革兰阴性杆菌，说明有厌氧菌的感染可能，在报告中应表示出来。能，在报告中应表示出来。无菌体液标本无菌体液标本v培养：培养：无菌体液含细菌数量较少，必须做增菌无菌体液含细菌数量较少，必须做增菌培养。一般注入培养瓶上血培养仪，标本处理培养。一般注入培养瓶上血培养仪，标本处理如血液。如果标本量太少接种完平板后，可用如血液。如果标本量太少接种完平板后，可用自配葡萄糖管增菌。自配葡萄糖管增菌。无菌体液标本无菌体液标本v培培养养基基的的选选择择：接接种种血血平平板板，分分离离一一般般细细菌菌，巧巧克克力力平平板板置置COCO2 2环环境境中中以以分分离离嗜嗜血血杆杆菌菌，麦麦康康凯凯琼琼脂脂分分离离革革兰兰阴阴性性杆杆菌菌。如如果果真真菌菌培培养养接接种种TTC-TTC-沙氏平板。需分区划线接种。沙氏平板。需分区划线接种。生殖系统标本生殖系统标本v淋病奈瑟菌涂片检查：将拭子直接在玻片上涂淋病奈瑟菌涂片检查：将拭子直接在玻片上涂片，革兰染色镜检，如看到白细胞内有革兰阴片，革兰染色镜检，如看到白细胞内有革兰阴性双球菌，呈双肾形，即可根据形态作出初步性双球菌，呈双肾形，即可根据形态作出初步报告。报告。生殖系统标本生殖系统标本v如果查真菌可以用生理盐水制湿片直接镜检看如果查真菌可以用生理盐水制湿片直接镜检看芽生孢子和假菌丝，也可以革兰染色镜检。芽生孢子和假菌丝，也可以革兰染色镜检。查抗酸杆菌可直接涂片做抗酸染色镜检查抗酸杆菌可直接涂片做抗酸染色镜检生殖系统标本生殖系统标本v细菌培养：接种血平板，分离一般细菌，麦康细菌培养：接种血平板，分离一般细菌，麦康凯琼脂平板分离革兰阴性杆菌，巧克力平板放凯琼脂平板分离革兰阴性杆菌，巧克力平板放5%-10%CO5%-10%CO2 2环境中可分离淋病奈瑟菌环境中可分离淋病奈瑟菌 。以分区。以分区划线法接种，置划线法接种，置3535孵育。孵育。v真菌培养：将标本接种两个真菌培养：将标本接种两个TTC-TTC-沙氏平板及血沙氏平板及血平板，分别放室温平板，分别放室温2222及及3535孵育孵育24-48h24-48h。