细胞破碎汇编.pptx

生物分离工程Bioseparation Engineering第三章 细胞破碎生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程不同类型的细胞分泌目标产物的类型：不同类型的细胞分泌目标产物的类型：n动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌 在培养液中。在培养液中。n植物细胞：多为胞内产物。植物细胞：多为胞内产物。n微生物：大多数小分子代谢产物分泌在胞外；微生物：大多数小分子代谢产物分泌在胞外；大多数大分子产物和基因重组产物为大多数大分子产物和基因重组产物为 胞内产物，胞内产物，如胰岛素、干扰素、白细如胰岛素、干扰素、白细 胞介素胞介素-2等等均为胞内产物。均为胞内产物。对于胞内产物，对于胞内产物，首先必须将细胞破碎，使产物得首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。以释放，才能进一步提取。第三章 细胞破碎3.1 细胞壁的组成与结构3.2 细胞破碎技术的分类3.3 常用破碎技术3.4 破碎率的测定3.5 破碎技术的发展方向n细胞破碎细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。分释放出来的技术。n为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解细胞壁细胞壁的组成和结构。的组成和结构。3.1 细胞壁的组成与结构n微生物细胞的外围通常包括细胞壁和细胞膜。微生物细胞的外围通常包括细胞壁和细胞膜。细胞膜（内壁）：具有高度选择性的半透膜，控制细胞膜（内壁）：具有高度选择性的半透膜，控制胞内外一些物质的交换渗透作用；胞内外一些物质的交换渗透作用；细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞免细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞免受机械损伤的功能。受机械损伤的功能。n细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微，不同类型的微生物其细胞壁的结构特性是不同的，取决于遗传和生物其细胞壁的结构特性是不同的，取决于遗传和环境因素。环境因素。3.1 细胞壁的组成与结构 革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌 革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌 酵酵 母母 霉霉 菌菌 植物细胞植物细胞壁厚壁厚(nm)2080 1013 100300 100250 27 m层次层次 单层单层多层多层多层多层多层多层多层多层主要组成主要组成 肽聚糖肽聚糖磷壁酸磷壁酸肽聚糖肽聚糖脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖磷磷 脂脂蛋白质蛋白质 葡聚糖葡聚糖 甘露聚糖甘露聚糖 蛋白质蛋白质 脂脂 类类多聚糖多聚糖脂脂 类类蛋白质蛋白质 纤维素纤维素半纤维素半纤维素果胶物质果胶物质木质素木质素蛋白质蛋白质破碎破碎难易程度难易程度较难破碎较难破碎较易破碎较易破碎较难破碎较难破碎难破碎难破碎很难破碎很难破碎3.2 细胞破碎技术的分类分分 类类破碎原理破碎原理破碎技术举例破碎技术举例机械法机械法固体剪切作用固体剪切作用珠磨法珠磨法、x-press法法 液体剪切作用液体剪切作用高压匀浆高压匀浆、超声破碎、超声破碎 非机械法非机械法溶胞作用溶胞作用酶溶法酶溶法、物理法、物理法、化学法化学法膜失水作用膜失水作用干燥处理干燥处理机械破碎机械破碎珠磨法挤压法匀浆法超声法 物理破碎物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂表面活性剂酸碱酶促破碎酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。的作用，而使细胞破碎。通过细胞本身的酶系或外加通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到外层结构受到破坏，而达到细胞破碎。细胞破碎。几种细胞破碎方式的比较几种细胞破碎方式的比较影响破碎难易程度的重要因素：影响破碎难易程度的重要因素：n机械法机械法细胞的大小和形状、细胞的大小和形状、细胞壁厚度细胞壁厚度、聚、聚合物交联程度。显然，细胞个体小、球形、壁厚、合物交联程度。显然，细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。（聚合物交联程度高是最难破碎的。（破碎细胞破碎细胞）n非机械法非机械法细胞壁、膜的组成和结构细胞壁、膜的组成和结构。了解细。了解细胞壁的组成和结构，就可选择合适的溶菌酶和化胞壁的组成和结构，就可选择合适的溶菌酶和化学试剂，以及在使用多种酶或化学试剂相结合时学试剂，以及在使用多种酶或化学试剂相结合时确定其使用的顺序确定其使用的顺序。（。（溶解壁膜上的某些组成溶解壁膜上的某些组成打洞打洞）3.3常用破碎技术3.3.1珠磨法（珠磨法（bead millbead mill）实验常用实验常用 n工作原理：工作原理：细胞悬浮液与极细的珠子细胞悬浮液与极细的珠子(玻璃、石英玻璃、石英砂、氧化铝等研磨剂，直径砂、氧化铝等研磨剂，直径1mm)1mm)一起一起快速搅拌快速搅拌或或研磨研磨，研磨剂珠子与细胞之间的互相剪切、碰，研磨剂珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。撞，使细胞破碎，释放出内含物。n实验室规模：实验室规模：MickleMickle高速组织捣碎机、高速组织捣碎机、BraunBraun匀浆匀浆器；器；n中试规模：胶质磨；中试规模：胶质磨；n工业规模：高速珠磨机工业规模：高速珠磨机(High-speed bead mill)(High-speed bead mill)。3.3.1 珠磨法n细胞破碎率可用一级反应动力学表示细胞破碎率可用一级反应动力学表示：间歇操作：间歇操作：ln1/(1-ln1/(1-R R)=)=KtKt 连续操作：连续操作：ln1/(1-ln1/(1-R R)=)=KK 其中其中 =V V/F F 式中：式中：R R破碎率（破碎率（g/gg/g）K K反应速率常数反应速率常数(1/s)(1/s)t t破碎时间破碎时间(s)(s)平均停留时间平均停留时间(s)(s)V V破碎室悬浮液体积（破碎室悬浮液体积（L L）F F进料速率进料速率(L/s)(L/s)操作条件的选择：操作条件的选择：n珠体大小珠体大小根据细胞大小、浓根据细胞大小、浓度以及连续操作时不使珠体带出度以及连续操作时不使珠体带出来选择。来选择。n珠体装量珠体装量装量少时，细胞不装量少时，细胞不易破碎；装量大时，能量消耗大，易破碎；装量大时，能量消耗大，研磨室热扩散性能降低，引起温研磨室热扩散性能降低，引起温度升高。度升高。n温度温度温度高时细胞较易破碎，温度高时细胞较易破碎，但要考虑目的产物不受破坏。一但要考虑目的产物不受破坏。一般温度控制在般温度控制在5 54040内时影响内时影响较小。较小。搅拌转速搅拌转速过高将过高将使能量消耗大增，而使能量消耗大增，而破碎率破碎率上升不明显上升不明显。Rn能耗破碎率的控制：破碎率的控制：n破碎率高时，单位破碎细胞的能耗明显上升破碎率高时，单位破碎细胞的能耗明显上升；n高破碎率高破碎率产生较多的热能，增大了冷却控温的难产生较多的热能，增大了冷却控温的难度；度；n破碎率破碎率越越高，细胞碎片高，细胞碎片越越小，分离碎片小，分离碎片越越困难困难；n高破碎率下，高破碎率下，目的产物的失活损失增加。目的产物的失活损失增加。珠磨法的珠磨法的破碎率一般控制在破碎率一般控制在80%80%以下以下，并兼顾下游，并兼顾下游过程。过程。3.3.2 高压匀浆法(High-pressure homogenization)大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法 n工作原理：利用高压使细工作原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂。在高压击环使细胞破裂。在高压匀浆器中，高压室的压力匀浆器中，高压室的压力高达几百个大气压，细胞高达几百个大气压，细胞悬浮液自高压室针形阀喷悬浮液自高压室针形阀喷出时，速度可达每秒几百出时，速度可达每秒几百米。米。破碎的动力学方程：破碎的动力学方程：式中：式中：KT与温度等有关的破碎常数与温度等有关的破碎常数 N悬浮液通过匀浆器的次数悬浮液通过匀浆器的次数 P操作压力操作压力 a a微生物种类常数，对于酵母菌微生物种类常数，对于酵母菌a a值可取值可取2.22.2 破碎压力的选择：破碎压力的选择：n增大压力和增加破碎次数都可以提高破碎率，增大压力和增加破碎次数都可以提高破碎率，但当压力增大到一定程度后对匀浆器的磨损但当压力增大到一定程度后对匀浆器的磨损较大，此外当压力超过一定值后，破碎率的较大，此外当压力超过一定值后，破碎率的增加很慢。增加很慢。n在工业生产中，通常采用的压力为在工业生产中，通常采用的压力为555570MPa70MPa。破碎一般规律：破碎一般规律：（1）酵母较细菌难破碎；酵母较细菌难破碎；（2 2）处于静止状态的细胞较处于快速生长状态的细胞难）处于静止状态的细胞较处于快速生长状态的细胞难破碎；破碎；（3 3）在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培养基上）在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培养基上培养的细胞较难破碎。培养的细胞较难破碎。n不宜采用高压匀浆法破碎的有：不宜采用高压匀浆法破碎的有：（1 1）易造成堵塞的团状或丝状真菌，）易造成堵塞的团状或丝状真菌，（2 2）较小的革兰氏阳性菌，）较小的革兰氏阳性菌，（3 3）某些质地坚硬的亚细胞如包含体）某些质地坚硬的亚细胞如包含体（inclusion body）。3.3.3 超声破碎（超声破碎（UltrasonicationUltrasonication）主要用于实验室主要用于实验室 n破碎机理：可能与空化现象（破碎机理：可能与空化现象（Cavitation Cavitation phenomenaphenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。）引起的冲击波和剪切作用有关。n通常采用的超声破碎机在通常采用的超声破碎机在151525KHz25KHz的频率的频率下操作。下操作。n超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。细胞浓度及菌种类型等因素有关。超声破碎的适用性：超声破碎的适用性：n细胞种类：细胞种类：杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细胞比革兰氏阳性细胞较易破碎，对酵母菌的效果胞比革兰氏阳性细胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。较差。n超声波振荡易引起超声波振荡易引起温度的剧烈上升温度的剧烈上升，操作时常在，操作时常在冷却条件下进行。小规模实验常采用间歇操作，冷却条件下进行。小规模实验常采用间歇操作，大规模生产受限制。大规模生产受限制。n超声波产生的化学自由基团能使超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性某些敏感性活性物质失活物质失活，因而有一定的局限性。，因而有一定的局限性。3.3.4 酶溶法酶溶法研究较广的一种方法研究较广的一种方法n原理：利用酶反应，分解破坏细胞壁上的特殊键，原理：利用酶反应，分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。从而达到破壁的目的。n自溶法自溶法控制一定条件，诱发细胞自溶酶使细控制一定条件，诱发细胞自溶酶使细胞破碎。胞破碎。自溶法常采用加热法或干燥法。自溶法常采用加热法或干燥法。n外加酶法外加酶法根据细胞壁膜的结构及组成选择合根据细胞壁膜的结构及组成选择合适的酶。适的酶。细菌大多用细菌大多用溶菌酶溶菌酶(lysozyme)(lysozyme)酵母菌常用溶酶有：酵母菌常用溶酶有：-1,3-1,3-葡聚糖酶葡聚糖酶(glucanase)(glucanase)、-1,6-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶葡聚糖酶、蛋白酶(protease)(protease)、甘露糖酶、甘露糖酶(mannanase)(mannanase)、糖苷酶、糖苷酶(glycosidase)(glycosidase)、肽键内切酶、肽键内切酶(endopeptidase)(endopeptidase)、壳多糖酶等壳多糖酶等。酶溶法的特点（外加酶）：酶溶法的特点（外加酶）：（1）酶溶法需要特定的反应条件。）酶溶法需要特定的反应条件。（2）酶具有高度专一性，必须根据细胞壁的结构和酶具有高度专一性，必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶或溶酶系统，并确定相应化学组成选择适当的酶或溶酶系统，并确定相应的次序。的次序。（3）酶溶法的优点是：具有选择性释放产物，条件酶溶法的优点是：具有选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。（4）酶溶法的不足：一是溶酶价格高；二是酶溶法酶溶法的不足：一是溶酶价格高；二是酶溶法通用性差，且不易确定最佳的溶解条件；三是存通用性差，且不易确定最佳的溶解条件；三是存在产物抑制，在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有在产物抑制，在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用。抑制作用。3.3.5 化学渗透法化学渗透法n某些化学试剂，可以改变细胞壁或膜的通透某些化学试剂，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法透出来，这种处理方式称为化学渗透法(Chemical permeation)(Chemical permeation)。n常用化学试剂有：有机溶剂、变性剂、表面常用化学试剂有：有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等。活性剂、抗生素、金属螯合剂等。作用原理：作用原理：n化学渗透法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的化学渗透法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成，不同化学试剂作用的部位和方式有所结构与组成，不同化学试剂作用的部位和方式有所不同，现举例如下。不同，现举例如下。（1 1）表面活性物质：）表面活性物质：可促使细胞某些组分溶解可促使细胞某些组分溶解，其增，其增溶作用有助于细胞的破碎。如溶作用有助于细胞的破碎。如TritonX-100TritonX-100能结合并能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，从而使某些溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，从而使某些胞内物质释放出来。胞内物质释放出来。（2 2）EDTAEDTA螯合剂：可用于处理革兰氏阴性菌（如螯合剂：可用于处理革兰氏阴性菌（如E.coliE.coli）,它对其它对其细胞外层膜有破坏作用细胞外层膜有破坏作用。（3 3）有机溶剂：能分解细胞壁中的类脂。）有机溶剂：能分解细胞壁中的类脂。（4 4）变性剂：）变性剂：如如盐酸胍盐酸胍(Guanidin HCl)(Guanidin HCl)和脲和脲（UreaUrea）与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏）与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。各种试剂的不同作用机理，将几种试剂合理地搭各种试剂的不同作用机理，将几种试剂合理地搭配使用能有效地提高胞内物质的释放率。配使用能有效地提高胞内物质的释放率。例：例：单独用单独用0.1mol/L0.1mol/L盐酸胍处理盐酸胍处理E.coliE.coli仅释放约仅释放约1%1%的蛋白质的蛋白质 0.5%TritonX-1000.5%TritonX-100处理蛋白质释放率为处理蛋白质释放率为4%4%二者合用，蛋白质释放率可达二者合用，蛋白质释放率可达53%53%左右左右 化学渗透法的优点：化学渗透法的优点：对产物释放具有一定选择性。可使一些较对产物释放具有一定选择性。可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。易于固液分离和进一步提取。化学渗透法的缺点化学渗透法的缺点：（1）通用性差，某种试剂只能作用于某些特通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。定类型的细胞。（2）时间长，效率低，一般胞内物质释放率时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过不超过50%50%。（3）有些化学试剂有毒性有些化学试剂有毒性。3.3.6 选择破碎方法的依据选择破碎方法的依据（1）细胞处理量：大规模生产多采用机械法（通用）细胞处理量：大规模生产多采用机械法（通用性强，破碎效率高），实验室规模多选用非机械性强，破碎效率高），实验室规模多选用非机械法（选择性好，固液易分离）。法（选择性好，固液易分离）。（2）细胞壁的强度与结构：见）细胞壁的强度与结构：见3.2。（3）目标产物对破碎条件的敏感性：对活性物质产）目标产物对破碎条件的敏感性：对活性物质产品，要兼顾效率与稳定性。品，要兼顾效率与稳定性。（4）破碎程度：操作条件要兼顾产物释放率、能耗）破碎程度：操作条件要兼顾产物释放率、能耗和便于后提取。和便于后提取。3.4 破碎率的测定（1 1）直接测定法）直接测定法利用显微镜或电子微粒计数器利用显微镜或电子微粒计数器直接计数破碎前后的细胞数直接计数破碎前后的细胞数。（仅适合于机械法）。（仅适合于机械法）（2 2）目的产物测定法目的产物测定法 通过测定破碎液中目的通过测定破碎液中目的产物的释放量来估算破碎率。产物的释放量来估算破碎率。（多用于生产，必（多用于生产，必须有须有100%100%破碎率破碎率作作标准数值比较标准数值比较）（3 3）导电率测定法导电率测定法 细胞破碎后，大量带电荷细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。（的内含物被释放到水相，使导电率上升。（是一是一种快速测定法，种快速测定法，应预先采用其他方法制定标准曲应预先采用其他方法制定标准曲线线 ）3.5 破碎技术的发展方向3.5.1 多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合 机械法与非机械法机械法与非机械法 化学法与酶法化学法与酶法 多种化学试剂处理多种化学试剂处理 多种酶制剂处理多种酶制剂处理机械法与非机械法：机械法与非机械法：化学法与酶法取决于细胞壁膜的化学组成，化学法与酶法取决于细胞壁膜的化学组成，机械法取决于细胞结构的机械强度，而化学组成机械法取决于细胞结构的机械强度，而化学组成又决定了结构的机械强度，组成的变化必然影响又决定了结构的机械强度，组成的变化必然影响到强度的差异，这就是化学法与机械法相结合的到强度的差异，这就是化学法与机械法相结合的原理。原理。细胞细胞酶法或化学法处理酶法或化学法处理破坏细胞壁某些物质组成破坏细胞壁某些物质组成壁的壁的机械强度机械强度机械法处理机械法处理细胞破碎率细胞破碎率 例：面包酵母细胞的破碎例：面包酵母细胞的破碎 用溶解酶（用溶解酶（Zymolyase）预处理，然）预处理，然后在后在95MPa压力下高压匀浆压力下高压匀浆4次，总破碎率次，总破碎率接近接近100%。而单独用而单独用95MPa压力高压匀浆压力高压匀浆4次，破次，破碎率只有碎率只有32%。3.5.2 与上游相结合与上游相结合（1）寄主细胞的选择）寄主细胞的选择：选择较易破壁的菌种作为寄选择较易破壁的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌。主细胞，如革兰氏阴性细菌。（2）培养过程控制培养过程控制：在发酵培养过程的细胞生长的在发酵培养过程的细胞生长的后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一抑制剂（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁存在缺陷，利段时间后，新分裂的细胞其细胞壁存在缺陷，利于破碎，而有些胞内产物不经破碎即可直接渗透于破碎，而有些胞内产物不经破碎即可直接渗透出来。出来。3.5.2 与上游相结合与上游相结合（3）克隆噬菌体溶解基因克隆噬菌体溶解基因：在细胞内引进噬菌体基在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。内含物。（4）耐高温产品的基因表达耐高温产品的基因表达 ：如果产品能表达成如果产品能表达成耐高温型，杂蛋白仍然保持原特性，那么就可在耐高温型，杂蛋白仍然保持原特性，那么就可在较高温度下将产品与杂质分开，这样既节省了冷较高温度下将产品与杂质分开，这样既节省了冷却费用，又简化了分离步骤。却费用，又简化了分离步骤。3.5.3 与下游相结合与下游相结合n细胞破碎与固液分离和产品提取过程相结合，也即细胞破碎与固液分离和产品提取过程相结合，也即根据后处理过程的单元操作确定细胞破碎的方法和根据后处理过程的单元操作确定细胞破碎的方法和操作条件。操作条件。谢谢大家！