微生物的分离与纯化.pptx

实验一、微生物的分离与纯化实验一、微生物的分离与纯化n一、培养基的制备与灭菌1.牛肉膏蛋白胨培养基（细菌）2.高氏1号培养基（放线菌）3.马丁氏培养基（真菌）n二、土壤微生物的分离、纯化实验目的实验目的n n1、熟悉培养基制作原理；n n2、通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤；n n3、了解加压蒸汽灭菌的原理，并掌握其具体操作方法；n n4、了解土壤微生物的分离纯化的基本原理；n n5、学习并掌握微生物分离纯化技术方法。一、培养基的制备与灭菌一、培养基的制备与灭菌n n培养基是人工配制的微生物生活环境，其主要用途是繁殖及分离接种微生物，传代或保存微生物，鉴别微生物的类属，研究微生物的生理及生化特性，制造菌苗、疫苗或其他微生物制剂等。其营养成分包括微生物生长所需要的水分、碳源、氮源、无机盐及某些生长因子（维生素、辅酶）等。二、实验原理1、满足微生物生长培养所需的营养要素：碳源、氮源、无机盐、维生素、生长因子等2、合适PH值3、抑制其它微生物生长的物质。分类分类主要用于增菌用于检测动力及保存菌种用于分离鉴定细菌分类分类三糖铁培养基SS培养基普通琼脂培养基血液琼脂培养基 庖肉培养基培养基的制备程序培养基的制备程序1、调配 过滤 矫正pH（7.0-7.6）分装过滤 灭菌（121.3，20-30分钟）鉴定是否有菌 放入冰箱冷藏备用2、因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫正pH时应比所需的pH高3、鉴定是否有菌可将培养基置于37 培养24小时，然后观察干燥箱干燥箱细菌过滤器细菌过滤器用于滤过除菌的各式滤器用于滤过除菌的各式滤器手提式灭菌锅手提式灭菌锅坐坐式式灭灭菌菌锅锅高压蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌器卧式灭菌锅卧式灭菌锅三、实验器材三、实验器材 1、试剂：牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、NaCl、PH试纸、琼脂、葡萄糖、孟加拉红、FeSO47H20、MgSO47H20、KNO3、K2PO33H20n n2.仪器及其它 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸汽灭菌锅、汽灭菌锅、pHpH试纸试纸(5.5-9.0)(5.5-9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml1ml）、玻）、玻璃珠璃珠四、实验方法和步骤四、实验方法和步骤1、微生物常用玻璃仪器的包扎和棉塞的制作、微生物常用玻璃仪器的包扎和棉塞的制作培养皿的包装每10套一包，用旧报纸包扎（或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。吸管的包装首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。玻璃涂布棒的包装方法同吸管的包装。三角瓶的包扎1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备牛肉膏蛋白胨培养基的制备（1 1）计算）计算 （2 2）称量）称量 准确称取各种成分。准确称取各种成分。（3 3）溶解）溶解 向烧杯内加入所需的水量，将牛肉膏用向烧杯内加入所需的水量，将牛肉膏用水洗下后，取出硫酸纸弃去。加热搅拌全溶后稍水洗下后，取出硫酸纸弃去。加热搅拌全溶后稍放冷。放冷。（4 4）调）调pHpH值值 用酸度计或精密用酸度计或精密pHpH试纸测定其试纸测定其pHpH值，值，并用并用1010NaOHNaOH调至所需调至所需pHpH值，必要时用滤纸或脱值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的脂棉过滤。一般比要求的pHpH高出高出0.20.2，因为高压，因为高压蒸汽灭菌后，蒸汽灭菌后，pHpH常降低。常降低。（5 5）分装）分装 根据不同需要，可将配好的培养基分装根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内（附图入配有棉塞的试管或三角瓶内（附图1-11-1）（6 6）包扎）包扎 试管扎成捆。试管扎成捆。（7 7）灭菌）灭菌 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌1520min1520min。1 1、牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏、牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏 3.0g3.0g、蛋白胨、蛋白胨10g10g、NaCl 5.0gNaCl 5.0g、水、水1000ml1000ml、PH7.4-7.6PH7.4-7.62 2、高氏、高氏1 1号培养基（放线菌）号培养基（放线菌）可溶性淀粉可溶性淀粉 20g 20g、NaCl 0.5gNaCl 0.5g、琼脂、琼脂 15-20g15-20g、FeSOFeSO4 47H7H2 20 0.01g0 0.01g、MgSOMgSO4 47H7H2 20 0.5g 0 0.5g、KNOKNO3 3 1g 1g、K K2 2POPO4 43H3H2 20 0.5g0 0.5g、水、水 1000ml1000ml、PH7.4-7.6PH7.4-7.63 3、马丁氏培养基（真菌）、马丁氏培养基（真菌）KHKH2 2POPO4 4 1g1g、MgSOMgSO4 47H7H2 20 0.5g 0 0.5g、蛋白胨、蛋白胨 5g5g、葡、葡萄糖萄糖 10g10g、琼脂、琼脂 15-20g15-20g、水、水 1000ml1000ml、PHPH2.培养基的制备与分装培养基的制备与分装（1）三角瓶固体培养基的制备 1.称量按培养基配方比例依次准确地称取药品，放入在瓷缸内。（注意药品称量顺序）（注意药品称量顺序）2.加入定量的琼脂、水，煮沸，溶解 3.完全溶解后，补充水分，调pH值（不要调不要调过头过头）4.分装置三角瓶中，注意装液量注意装液量 5.加棉塞，包扎，高压蒸汽灭菌,121,0.10Mpa,20min（2）试管斜面固体培养基的制备）试管斜面固体培养基的制备n na.称量按培养基配方比例依次准确地称取药品，放入在瓷缸内。（注意药品称量顺序）（注意药品称量顺序）b.加入定量的琼脂、水，煮沸，溶解 c.完全溶解后，补充水分，调pH值 d.在培养基未融化之前，用10mL移液管快速加入试管内，每根7-8mL，塞上棉塞，包扎，灭菌，灭菌完后摆斜面。3.培养基、无菌水、器皿的灭菌培养基、无菌水、器皿的灭菌 n n1.将培养基、无菌水放入高压蒸汽灭菌锅内，湿热灭菌。n n2.灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面。n n3.器皿放入干热灭菌箱内，加热灭菌。二、土壤微生物的分离、纯化二、土壤微生物的分离、纯化n n土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量测定。测定。n n基本原理：是通过稀释使菌体细胞充分分散，单细胞得以生长发育形成菌落，可使用稀释法或平板划线法进一步纯化，还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。实验步骤：实验步骤：n n1、采样一般定点于耕作层0-20cm，先除去表土1-2cm，以无菌铲采土足量充分混匀后用无菌塑料袋分装。n n2、制备土样稀释液 吹吸几次混匀 另留一管不稀释留作对照（CK）无菌操作无菌操作倾注法接种倾注法接种n n先按10-6，10-5的顺序将不同稀释度菌悬液接入对应平皿中（每个平皿接入1ml），再向每个平皿倾注约15 ml的牛肉膏蛋白胨培养基（48）待冷凝，混合均匀。分区划线法纯化分区划线法纯化 计数计数n n要求30300之间计数。CK除外n n每克湿土样细菌数量平均菌落数稀释倍数土壤样品水分系数1（1样品水分百分数）土壤样品细菌数量（个克干土）每克湿土样细菌数量样品水分系数 思考题思考题n n1.1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养菌是无菌的？灭菌后的培养菌是无菌的？n n2.2.加压蒸汽灭菌的原理是什么？是否只要压力表上加压蒸汽灭菌的原理是什么？是否只要压力表上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温度的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温度？为什么？为什么？n n3.3.土壤微生物分离要注意什么问题？土壤微生物分离要注意什么问题？n n4.4.管口、瓶口为什么要用棉塞？能否用木塞或棉皮管口、瓶口为什么要用棉塞？能否用木塞或棉皮塞代替？为什么？塞代替？为什么？