羟基喜树碱研究.docx

1 前言 1.1 10-羟基喜树碱的简介和研究现状1.1.1 10-羟基喜树碱简介癌症是一组可影响身体任何部位的100多种疾病的通称，是当今世界上危及人类健康的重大疾病之一。在众多抗癌药物中，喜树碱类是一类从喜树中提取的一种微量生物碱及其衍生物，其中10-羟基喜树碱（10-Hydroxy camptothecin，HCPT）是临床应用较好的一种广谱抗肿瘤药物，效果比喜树碱好10倍，对胃癌，肝癌，直肠癌（包括膀胱癌等），头颈部癌及白血病治疗均有效果。在细胞周期中，它选择性地与拓扑异构酶结合从而抑制拓扑异构酶，阻断DNA的重新结合，抑制DNA合成并导致双链DNA断裂，在多种调控蛋白协同下，最终导致癌细胞凋亡（徐丽婷，等，2002；曾云，等，2007）。HCPT为细胞周期的特异性药物，不易产生耐药性，与其他抗癌药无交叉耐药性。10-羟基喜树碱的结构如图1.1，其主结构是一个依次稠合了喹啉（AB）、吡咯烷（C）、吡啶酮（D）、六元环内酯（E）的五元稠环生物碱。羟基喜树碱为淡黄色结晶性粉末，不溶于水，微溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，溶于稀碱溶液。结构不稳定，见光易变质。图1.1 羟基喜树碱结构图HCPT的内酯环结构是它作用于靶酶的必要结构，其浓度决定了药物的疗效，在碱性条件下易打开六元环内酯结构形成羧酸，该存在形式不仅药效甚微，而且有很大的副作用（Zhou J J，et al.，2001）。HCPT难溶于水，溶于碱性溶液，国产的水针剂及冻干粉针剂系用NaOH溶液形成钠盐，在生理条件下可转化成内酯型，占总药量的1020。临床静注每次48 mg，用1020 mL等渗盐水稀释，每日或隔日1次，一疗程60120 mg。动物实验表明注射用羟喜树碱在血液中的清除过程呈双相曲线，第一个快速下降的生物半衰期为4.5分钟，第二个半衰期约为29分钟。给药后1小时，胆囊、小肠内容物维持浓度最高，其次为癌细胞，其他依次为骨髓、胃、肺等器官。临床用药常见的副反应有：恶心、呕吐等胃肠道反应；骨髓抑制，主要使白细胞下降；少数病人有脱发、心电图改变及泌尿道刺激症状，但远较喜树碱为轻。HCPT半衰期短，在体内代谢较快；表观分布容积小，分布有限，与组织亲和力低；与血浆蛋白结合率高，药物不易进人细胞内。HCPT的药动学性质在一定程度上限制了它在临床的应用（潘宏，2009）。综合以上，羟基喜树碱具有药效显著、不易产生耐药性、与其他抗癌药无交叉耐药性等优点；具有结构不稳定、水溶脂溶性差，半衰期短、给药频繁，副作用大等缺点。1.1.2 羟基喜树碱目前的研究现状1.1.2.1 羟基喜树碱在剂型上的研究现状羟基喜树碱的临床使用获得了普遍的赞誉，为了克服羟基喜树碱的水溶脂溶性差等缺点，方便其临床用药，很多科技工作者对其剂型进行了研究，近些年研 制成了多种HCPT的新剂型，例如，片剂、滴丸、固体分散物、乳剂、脂质体、 纳米粒等。其中最多的是脂质体的制备，田野（2009）以溶剂法制备了羟基喜树碱磷脂复合物，以增加内酯环的稳定性、提高生物利用度、延长药物作用时间并降低药物的不良反应。葛建君（2011）制备了羟基喜树碱磷脂复合物并考察了其理化性质，他尝试两种方法制备混合胶束：第一种方法是先制备羟基喜树碱磷脂复合物然后与TPGS混合制备混合胶束；第二种方法是将羟基喜树碱与卵磷脂、TPGS共同混合直接制备混合胶束。为了增加HCPT的溶解性、稳定内酯结构同时提高混合胶束载药量，以PC和TPGS为材料，旋转蒸发后通过薄膜水化法制备了载药混合胶束，说明磷脂复合物胶束比单纯的TPGS和PC的混合胶束具有更大的临床应用价值。采用MTT比色法研究了载药混合胶束与原料药对细胞的毒性。细胞毒性显示：对于HeLa细胞，载药胶束的细胞毒性远远高于原料药，这一切为胶束的临床应用提供了有效的理论基础。柳怀玉等（2011）运用复乳法将羟基喜树碱包裹于聚乳酸羟基乙酸（PLGA）中制备羟喜树碱PLGA缓释纳米粒，从而延长羟喜树碱发挥抗肿瘤作用的时间，提高患者的依从性和生物利用度。两亲性聚合物纳米粒的研究也相当多，这包括两亲性嵌段型、接枝型、树枝状、网状聚合物、聚电解质复合物等形成的纳米粒。嵌段型其中含PEG结构比较广泛，例如制备的PEG-PBLG就是聚乙二醇-聚-（-苄基-L-谷氨酸酯）（Wang A，et al.，2008），相比HCPT组，在药代动力学上表现出了更优的性能。又如另一例苗博龙（2011）研究构建了一种基于生物可降解的聚己内酯-聚乙二醇聚己内酯（PCL1250 - PEG1500 - PCL1250）温敏凝胶的注射用缓释药物递送体系，以期开发出新型关节腔注射用局部给药缓释制剂。接枝型聚合物如荣利等（2011）以自制的半乳糖十六酰壳聚糖作为载体材料，采用乳化溶剂挥发法制备载药聚合物胶束，透射电镜观察聚合物胶束呈球形，且具有明显的壳核结构，粒径在250300 nm之间。通过正交试验优化制备条件，获得的载HCPT胶束包封率可达75.96%，表明此聚合物胶束对HCPT有较好的增溶效果。最多用的网状结构药物载体要数体积极小的单层和多层碳纳米管（蒋江涛，等，2012），除此之外的网状聚合物的研究是通过交联将树枝状聚合物交织呈网状。如用支链PEI（25 kDa）穿插普朗尼克F127的内核形成网络结构，再用聚氰基丙烯酸聚丁酯（PBCA）渗透网络起到交联的作用，用此网状结构载HCPT比单纯使用其中一种或两种聚合物的载药率高出了四倍（Li N，et al.，2011）。关于聚电解质复合物的报道多为水凝胶沉积物。使用碳酸钙中钙离子将带有相反电荷的壳聚糖和海藻酸钠以重复多次操作的方式分层沉积在羧甲基纤维素上，然后与戊二醛交联，再用乙二胺四乙酸二钠分解掉内核，在电镜下看到得到的载药内核非常优良（Zhao Q，et al.，2007）。 1.1.2.2 羟基喜树碱在化学修饰上的研究现状在对HCPT剂型进行了研究的同时，还对其结构进行了修饰，以期望达到缓释的效果。羟基喜树碱的活性位点有10位酚羟基和20位高位阻的醇羟基。10-OH反应活性较高，所以较多对10-OH修饰成醚键或酯键。Wani等（1980）用溴乙酸乙酯在弱碱性条件下对10-OH修饰成醚键，且具有较高的产率。秦燕军（2007）在DMAP和NHS催化下将HCPT与丁二酸酐反应，制得双羧酸化羟基喜树碱的产率为82.4%。而在催化剂的条件下选择性酯化HCPT上的一个羟基是制备羟基喜树碱高分子前药的一大困难，故Hong等（2010）将HCPT在DMAP催化剂的作用下与mPEG-COOH发生酯化反应得到HCPT-PEG时并未关注酯化的羟基位置，另并将转铁蛋白接枝到PEG上，将所得的两种PEG修饰物混合将羟基喜树碱送至肿瘤细胞，不失为一种新的药剂策略。Zhang等（2007，2008，2008）除了采用在DMAP等催化剂下将羧酸与HCPT的羟基反应成酯，更成功地采用把修饰基首先做成酰氯的策略，再与羟基喜树碱的10-OH或20-OH进行酯化反应，得到了一系列的新型化合物，经过柱色谱，分离出了单羧酸化的羟基喜树碱。刘璐等（2011）采用丁二酸酐（SA）与羟基喜树碱反应，通过柱色谱的分离，制得HCPT-SA，与mPEG-SA、右旋糖酐（Dex）通过SA交联得到了mPEG-g-Dex-HCPT微凝胶。Mao等（2011）将HCPT的10-OH与戊二酸酐反应成酯键的方法，将其与抗炎药地塞米松（DSMS）同时接枝在二硫键链接的两端肽链上，得到DSMS-FFFK（HCPT）E-s-s-EE水凝胶，期望通过调节不同的药物组合使得水凝胶能够治疗不同的疾病。Boncel等（2013）将HCPT的10-OH与丁二酸酐反应成酯键，从而将其连接在多层碳纳米管载体上，特别研究了药物以共价键连接在多层碳纳米管上后药物的分子作用机制和释放行为。因20-OH是喜树碱类化合物的生物活性必须基团，故20-OH的酯化物应当是无活性或低活性的前药。由于20-OH较10-OH活性差一些、与内酯环的羰基存在分子内氢键和内酯环稳定性不佳等原因，故要得到20位单酯化的羟基喜树碱需要首先对10-OH进行保护。郭甜甜（2010）采用首先把10位酚羟基保护-脱保护的策略，得到了一些20-OH单酯化的羟基喜树碱。1.2 一种协同化疗与基因治疗靶向肿瘤材料的研究意义1.2.1 肿瘤主动靶向的研究现状治疗肿瘤的靶向分为被动靶向、主动靶向和物理靶向。其中主动靶向是指能与肿瘤细胞表面过度表达的一系列受体特异性结合的配体或抗体，截止目前研究的靶向基团主要有转铁蛋白（Tf）（顾希平，等，2005）、表皮生长因子（EGF）和叶酸（FA）、酪氨酸激酶、激素、脂蛋白等（张莉，等，2002；黄容琴，等，2005）。Hong等（2009；2010）利用组合的可能性，由转铁蛋白（Tf）修饰的聚乙二醇共聚十六烷基氰基丙烯酸酯得到PEG-PHDCA囊泡，HCPT作为模型药物，静脉注射到固体肿瘤后，由转铁蛋白受体介导的内吞作用来促进药物输送进入细胞。结果表明，采用含靶向基团转铁蛋白的PEG改性脂质体可能是一个很有前途的传递抗肿瘤药物至肿瘤的解决方案。Milane等（2010）开发了EGF受体靶向聚合物混合纳米载体，用于结合紫杉醇/氯尼达明释放治疗多耐药性人类乳腺癌和卵巢癌肿瘤细胞。叶酸（folic acid，FA）即蝶酰谷氨酸，又称维生素B9。叶酸受体（folate receptor，FR）在大部分人体肿瘤细胞表面过度表达，而在正常细胞表面则很少表达，甚至不表达。FR主要包括、和四种亚型，其中FA受体在正常细胞中的表达一般高度保守，但在许多上皮来源的恶性肿瘤，如宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌和鼻咽癌等肿瘤细胞中受体的数量和活性远远超过正常细胞，故FA是最主要的叶酸受体。FR对叶酸及其衍生物如甲基四氢叶酸等都具有很高的亲合性和特异性，基于这种特性，针对叶酸肿瘤靶向的研究非常多（高晓宁，等，2006；文静，等，2011；梁旭华，等，2012；黄英男，等，2012），尤其是将显像剂、治疗药物等与叶酸偶联，靶向给予肿瘤细胞，从而应用于肿瘤的影像诊断，如核医学显像、核磁共振显像、荧光显像和肿瘤治疗如化疗、同位素治疗、免疫治疗、反义核苷酸治疗及基因治疗中。1.2.2 基因转染载体的研究目前基因转染常用的载体有病毒型载体和非病毒型载体。病毒型载体在当前批准进入临床试验的基因治疗中占75，转染效率通常在90以上，但病毒蛋白有诱发机体产生免疫反应、体内潜在的病毒复制、生产成本高、不能反复应用、 无靶向性等缺点，人们把注意力与希望逐步转向非病毒载体（张建华，等，2007）。非病毒载体介导基因转染要达到较好的转染效果，则必须克服细胞膜、内涵体溶酶体系统、核膜这3道屏障，即要提高靶向对载体/基因复合物的摄取率、促进载体/基因复合物从内涵体溶酶体中的释放以及提高基因的跨核膜转运。另外，加强非病毒载体携带基因进入细胞的分子机制研究是未来非病毒载体介导基因治疗的研究方向（黄景彬，等，2011）。非病毒基因载体目前主要有纳米载体、脂质体和阳离子聚合物。聚乙烯亚胺（Polyethylene imine，PEI）是一种水溶性的高分子化合物，易于合成和改性，无免疫原性，可以方便地与核酸片段形成紧密的超分子复合物，保护核酸片段免受核酸酶的降解，并促进其进入细胞，是阳离子聚合物类非病毒基因载体中的一个重要类型（Zhang C，et al.，2004；Neu M，et al.，2005；吴传保，等，2007；汤谷平，等，2009）。PEI被认为是基因转染效率最高的聚合物之一，但当它转染效率高时，其分子量较大，细胞毒性也大，而小分子量时其细胞毒性小，但转染效率低。因此设计在聚乙烯亚胺（PEI）中引入疏水组分、PH敏感组分和可降解组分，探讨各种修饰组分增加其转染效率和降低其细胞毒性的规律具有重要的理论意义和潜在的应用价值（丰连东，2009）。自发现PEI可以成功转染之后，对PEI的转染研究的相当普遍。Tian等（2007）利用超支化PEI和疏水性的聚（-苄基-L-谷氨酸）片段（PBLG）的两端连接起来得到的胶束复合物（PP），可以有效地浓缩pDNA成颗粒，因为PBLG的输水作用压缩，复合物的粒径比单纯PEI/DNA复合物更小。MTT法细胞毒性研究表明PP毒性比PEI低。由流式细胞术测定表达的绿色荧光蛋白（GFP）发现，相比PEI表达的GFP，在细胞中PP/pDNA复合物的体外转染效率改善很多，因此，显示水溶性PP共聚物作为基因传递载体相当有潜力。张璇等（2007）合成了不同接枝量的PEG-PEI共聚物，将PEG-PEI作为基因载体，与易于检测的带有绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP-VEGF165真核表达质粒通过自组装成DNA复合物，使其转染脐静脉内皮细胞（HUVEc），测定发荧光细胞百分数获得转染率。作为基因载体介导pEGFP-VEGF165转染HUVEc后，在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白表达，转染率与接枝PEG的量及N/P有关，PEG-PEI在N/P=30时转染率达到最大值，比PEI显著提高。关于接枝叶酸到PEI基因载体的也有相关报道，Sagara等（2002）通过双官能团PEG将半乳糖耦合到PEI上，耦合率为1%时，外源基因在肝源细胞系Hep G2中的表达效率即高于相同条件下的PEI；耦合率为1%、N/P =20时的转染效率是PEI的2.1倍。而在非肝源细胞NIH3T3中，耦合靶向基团的载体所得到的转染效率只有相应PEI的1/40，可见靶向基团改性后的阳离子聚合物的转染选择性增强。Benns等（2002）用PEG间隔合成了叶酸改性的PEI，改性PEI的细胞毒性低于PEI，改性聚合物在克隆腺癌细胞CT-26中的转染效率都高于未改性的PEI，而在口腔上皮细胞KB和平滑肌细胞中改性聚合物作载体时的转染效率与PEI相当或低于PEI，这同样说明接枝靶向有利于增强PEI转染的选择性。1.2.3 协同化疗与基因治疗肿瘤的研究羟基喜树碱虽然药效显著，但用其化疗并非适合所有肿瘤病人，对一般情况太差，肝肾功能异常、明显贫血、白细胞及血小板减少、感染发热及心肌病变者，化疗应慎重。此外既往多程化疗后复发的病人，化疗也应慎重。有些肿瘤对化疗甚是抗拒，对这类病人化疗也不宜过于积极，否则得到的好处少，毒副反应多常会引起呕吐、脱发、厌食、白细胞降低、免疫力下降等症状，在杀死癌细胞的同时，也杀死了大量的正常细胞。为了减少化疗的副作用，研究者开始关注协同化疗与基因治疗的联合治疗。关于联合药物与基因治疗肿瘤的文章有很多，这里主要讨论通过载体使药物和基因得到共释放的一些研究。表面功能化介孔二氧化硅纳米粒子（MSNP）可以作为一个有效的和安全的载体生物活性分子，Slowing等（2008）利用MSNP作为控释药物输送和基因转染载体，发现MSNP穿透各种细胞膜在动物和植物细胞，对特异地交付基因和其他治疗药物，并在细胞内控制释放药物和基因有巨大的潜力。Xia等（2009）使用介孔硅材料载紫杉醇和PEI转染通过试验不同PEI聚合物分子量，可以保留高细胞摄取和转染效率，同时减少甚至消除阳离子MSNP细胞毒性。范辉（2011）合成一种基于环糊精/金刚烷的并带有抗肿瘤药物阿霉素（Dox）的PEI-CD/Ad-Dox，超分子纳米材料作为抗肿瘤药物和基因协同给药体系进行了研究，首次证明在卵巢癌的治疗上，体内外均可提高肿瘤细胞对药物敏感性，体现出较好的协同增效作用，为化疗药物与基因药物的联合应用打下基础。目前较热的研究是联合药物和RNA干扰技术治疗肿瘤。RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是指与内源mRNA同源的小片段外源双链RNA（double strandedRNA，dsRNA）导入细胞，产生约2123 bp的小分子干扰RNA（small interference RNA，siRNA），从而导致特定基因表达沉默。siRNA是一种小RNA分子（2125核苷酸），由Dicer（RNAase 家族中对dsRNA具有特异性的酶）加工而成，siRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域（潘秋卫，2006；祝颖，2009）。Sun等（2011）对同时负载有siRNA和化疗药物的纳米胶束粒子协同抑制肿瘤的生长进行了研究，这是第一个集RNA干扰和化疗合二为一用于治疗肿瘤的系统性的例子。合成了具有高度生物相容性的三嵌段共聚物聚（乙二醇）-b-聚（-己内酯）-b-聚（2-氨乙基乙烯磷酸盐），记为mPEG-b-PCL-b-PPEEA，该聚合物在水溶液中能够形成胶束并负载siRNA和紫杉醇。实验清晰地证明了在体内和体外，载药胶束均能够同时将siRNA和紫杉醇传递到肿瘤细胞，并以协同的方式显著抑制肿瘤的生长。进一步将带有抗肿瘤polo样激酶1（PLK1）的特异性的siRNA和紫杉醇对接种有MDA-MB-435s细胞（人乳腺癌细胞）的小鼠模型诱导特定的协同抗肿瘤效应，发现不仅没有激活先天免疫反应和联合用药毒性，而且需要的紫杉醇药量仅有紫杉醇单药用量的千分之一。Xiong等（2011）合成了可降解的聚（环氧乙烷）-b-（-己内酯），记为PEO-b-PCL，其中PCL上含有短多胺用来复合siRNA，另外还以化学偶联的方法与阿霉素（Dox）形成pH敏感的腙结构，可形成类似病毒的具有内核结构的胶束，该胶束被用来吸附RGD-4C（整合素Rv3特异配体）和细胞穿膜肽（TAT）。该体系具有同时携带有siRNA和Dox两种肿瘤抑制剂，RGD肿瘤靶向，TAT增加了膜活性，pH引发药物释放等多种功能，被用来研究对MDA-MB-435细胞（人乳腺癌细胞，整合素Rv3-阳性）过表达P-糖蛋白（P-gp）的抑制能力，发现能同时释放siRNA和Dox到细胞中抵抗P-gp的过表达，而且siRNA的使用抑制了P-gp对Dox的耐药性。Hu等（2012）开发了一种基于环糊精和金刚烷的超分子胶束系统可以同时递送siRNA和紫杉醇（PTX）到相同的肿瘤细胞，在体外研究中发现能同时提供生存素shRNA和PTX，协同抑制存活素和Bcl-2的表达，从而良好地抑制肿瘤的生长。1.2.4 本课题的研究意义目前的研究报道，未见使用HCPT对PEI的修饰研究，该方法可使大分子药物自成胶束结构，与核苷酸片段结合后，由于HCPT的输水作用，使得颗粒粒径更小。关于协同化疗药物和基因药物的联合应用已有先例，但将药物和靶向基团同时与基因载体以化学键接枝的形式却未见报道。本研究利用HCPT为疏水基团接枝到PEI上形成可自组装的纳米胶束，并在酯酶的作用下脱掉具有活性的HCPT，同时在PEI上接枝靶向基团叶酸，再利用层层包裹法与核酸形成稳定的纳米颗粒。期许酶解掉的HCPT和脱落的siRNA分别从阻断细胞核内DNA复制合成和细胞质内沉默mRNA两处协同阻断癌细胞的增殖，从而达到较好的治疗肿瘤的效果。合成集抗癌药HCPT，肿瘤靶向和阳离子基因载体于一体的大分子药物，从而协同化疗和基因治疗肿瘤。本课题利用HCPT的水不溶性和PEI的水溶性使得材料自动团聚成胶束，从而改善了HCPT的水溶性，增强了肿瘤组织的透过性及滞留效应（ERP效应）。与用脂质体，介孔二氧化硅等载药方式相比，将HCPT以酯键连接在基因载体上，做成前药，延长了药物的半衰期。添加了靶向，且靶向以化学键与胶束连接，使得复核后的颗粒更大效率的达到肿瘤部位，减少对正常组织的损害。采用羟基喜树碱，避免肿瘤组织产生耐药性，配合siRNA干扰技术，进一步克服了肿瘤组织的多药耐药性。1.3 一种新颖的缓释药物材料的研究意义1.3.1 壳聚糖作为抗肿瘤药物载体的研究进展抗肿瘤药物对肿瘤组织和正常细胞几乎无选择性，普遍存在疗效低、毒性大、转移灶难以控制、患者用药顺应性差等问题。因此，抗肿瘤药物传递系统已成为药剂学领域的研究重点和热点。其中靶向传递系统和缓控释传递系统已被证明可有效降低抗肿瘤药物的不良反应，提高临床疗效和患者用药的顺应性。壳聚糖及其衍生物因为具有良好的生物相容性，作为抗肿瘤药物的载体，被制成微球、微囊、纳米粒、水凝胶、埋植剂、聚合物胶束等不同的剂型，在体内可达到靶向和缓释的作用（柳怀玉，等，2011）。另外，壳聚糖及其衍生物作为抗肿瘤药物的载体，对其包载的抗肿瘤药物品种的研究也非常广泛，已经研究的如5-氟尿嘧啶、蒽醌类药物、顺铂类、维生素类、激素类、化学免疫类药物、天然药物类（包括紫杉醇和喜树碱类）、生物类药物（细胞因子、基因和疫苗）等（张宏亮，等，2008），说明了壳聚糖及其衍生物作为药物传递载体具有良好的兼容性和巨大的潜力（李东华，等，2010）。Park等（2010）总结了壳聚糖及其衍生物针对器官（包括结肠、肝、肾、肺等）和肿瘤靶向释放小分子药物的研究进展。被动靶向有壳聚糖与药物以化学键连接、壳聚糖交联形成载药纳米粒、基于壳聚糖的聚合电解质复合物纳米粒、自组装的壳聚糖纳米粒和PEG化壳聚糖纳米粒，增强了肿瘤组织的透过性及滞留效应（ERP效应）。主动靶向主要是肿瘤细胞上的受体介导的内吞作用。物理靶向包括一些对刺激敏感的剂型、磁性纳米粒等。壳聚糖及其衍生物的纳米微粒是主要的载体形式之一，在这方面的研究工作非常多，例如Mller等（2013）将壳聚糖衍生物的巯基乙酸通过二硫键跟MPPT（3-甲基-1-苯基-5-巯基吡唑）连接，得到CS-s-s-MPPT，当聚合物接触肠道黏膜时，能通过二硫键断裂释放出抗菌药物，是一种有价值的药物输送系统和潜在的抗菌辅料。Zhao等（2012）将叶酸连接壳聚糖得到CS-FA纳米颗粒，通过丙烯磺酸盐离子交联用于载HCPT；而邢志华等（2013）更换为三聚磷酸钠聚阴离子，同样通过离子交联法制得了FA-CTS/HCPT纳米粒子，对构建羟基喜树碱新型肿瘤靶向给药体系具有重要的理论意义和潜在的实用价值。Yao等（2011）将mPEG一端的羟基氧化成醛基，用固体分散法，首先将HCPT分散其中，然后与羧甲基壳聚糖形成具有酸敏感的席夫碱结构，在具有酸性环境的肿瘤细胞中释放效果更好。1.3.2 环糊精与金刚烷用于药物缓释的研究进展环糊精（CD）是由6个或者6个以上的葡萄糖单元构成的无毒的大环低聚糖，常见的、和四种环糊精分别含有6、7、8和9个葡萄糖单元。因-CD的疏水空腔大小适宜和经济成本比较低等原因，常在食品中被用作除味剂、稳定剂、乳化剂，在药剂中用作药物包合材料和辅料等，尤其是在药物制剂及缓释领域得到了广泛的应用。但-CD的溶解度很小，这就在一定程度上限制了其应用。近年来，研究者合成了一系列溶解度较大的-CD衍生物来包合药物。环糊精衍生物水溶性好并且低毒，与疏水性客体药物分子形成包合物后可以大大的提高药物分子在水中的溶解度，加入到缓释材料中可以提高药物的载药量（黄敏，2010；刘红，2011）。Prabaharan等（2009）通过冷冻干燥方法制备出一种生物可降解的矩阵支架壳聚糖-g-环糊精（CS-g-CD），用来填补细胞外基质愈合过程中的缺口，同时可以负载和缓释药物。支架的形态、膨胀能力和药物释放性能取决于支架交联密度的程度。CS-g-CD支架显示了比壳聚糖支架释放酮洛芬更为缓慢，且MTT实验显示该支架没有明显的细胞毒性，支架对周围组织友好并能提高其周围组织再生能力。该支架可能成为一个潜在的生物可降解的药物控释载体和伤口愈合的填充材料。利用-CD与金刚烷的包结络合作用（主客体作用）缓释药物的研究也颇多，范辉（2011）将1-金刚烷甲酸（Ad-COOH）与阿霉素（Dox）通过N，N-羰基基二咪唑（CDI）偶合后得到Ad-Dox，与环糊精-聚乙烯亚胺（PEI-CD）进行自组装主客体反应生成PEI-CD/Ad-Dox超分子纳米聚合物。阿霉素成功结合金刚烷基并通过主客体连接与PEI-CD组成超分子复合物PEI-CD/Ad-Dox后，利用凝胶电泳阻滞实验证实PEI-CD/Ad-Dox在N/P比小于3时即能完全压缩并结合质粒DNA。而且在体内外均可提高肿瘤细胞对药物敏感性，体现出较好的协同增效作用，为化疗药物与基因药物的联合应用打下了基础。Luo等（2013）合成了mPEG-Ad/BAC-CD（BAC：N，N-双丙烯酰胱氨酸）胶束用于负载喜树碱，通过胶束的稳定性保护喜树碱的内酯环结构，从而减少了药物的使用量和副作用。1.3.3 该课题的研究意义基于壳聚糖及其衍生物对生物组织的良好生物相容性和在载药领域的杰出能力，在众多科研工作者对克服其水溶性差等缺点的探索和研究之上，本课题首先用含有大量氨基的四乙烯五胺对天然优质的高分子材料壳聚糖进行改性，得到的水溶性很好的四乙烯五胺壳聚糖（TEPACS）；将金刚烷酰氯通过一系列修饰后以形成pH敏感的C=N结构连接到合成的水溶性很好的四乙烯五胺壳聚糖上，得到TEPACS-Ad。另不同于Cheng（2003；2004）将喜树碱的20-OH以酯键通过PEG连接在对生物组织具有良好安全性的-CD上，而是将HCPT的10-OH以更稳定的醚键形式通过连接臂连接至-CD上，得到HCPT-CD。通过-CD和金刚烷的包结络合作用，最后制备出一种缓释HCPT的纳米胶束TEPACS-Ad/HCPT-CD。该课题制备出了一种水溶性非常好的壳聚糖衍生物，改善了HCPT的水溶性，通过环糊精与金刚烷的主客体作用将羟基喜树碱与水溶性的四乙烯五胺壳聚糖结合在一起，增溶了HCPT。HCPT临床应用的主要矛盾不是药效，而是频繁给药病人难以忍受药物副作用的问题，延长HCPT的半衰期显得非常重要。将HCPT以醚键连接在材料上，药物难易脱落，强烈地延长了药物的半衰期。基于材料结构中含有的C=N结构可以在酸性条件下还原断开、材料结构中的环糊精和金刚烷的主客体作用也可以打开，因此材料有望起到双控缓释的作用。2 材料与方法2.1 实验材料与仪器2.1.1 实验材料实验所需材料如表2.1.1。除表中所列试剂，文中提及的其他试剂均为分析纯。表2.1.1 实验材料化学试剂纯度厂家羟基喜树碱99.0%晓园生物科技有限公司PEI 25000分析纯SIGMA壳聚糖（CS）脱乙酰度90%南通形成生物制品1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 （EDCHCl）98.5%阿拉丁溴化钾光学纯阿拉丁甲醇HPLC色谱纯天津市科密欧化学试剂有限公司乙腈HPLC色谱纯天津市科密欧化学试剂有限公司羟基喜树碱标准品深圳万乐药业溴乙酸乙酯分析纯阿拉丁氨基环糊精（CD-NH2）分析纯阿拉丁金刚烷酰氯（AdCOCl）分析纯SIGMA细胞培养基DMEM无菌美国CellgroCell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒） 广州奕源生物科技有限公司Lipofectamine 2000试剂盒上海科敏生物科技有限公司Hep G2细胞株中山大学附属第三医院实验室MEF细胞株中山大学附属第三医院实验室2.1.2 实验仪器实验所需仪器如表2.1.2表2.1.2 实验仪器仪器名称型号生产厂家电子天平FA/JA上海方瑞仪器有限公司恒温水浴锅HHS11-Ni3北京长安科学仪器恒温油浴锅HH-S金坛市精达仪器制造有限公司循环水真空泵SHZ-III郑州科达机械仪器设备有限公司磁力搅拌器S10-3上海司乐仪器有限公司真空干燥箱6050B上海赛欧试验设备有限公司真空冷冻干燥仪FD-1西安麒麟实验仪器有限公司透析袋MW：3500 Da广州市齐云生物技术有限公司傅里叶红外光谱仪Nieolet6700德国Bruker Optic核磁共振仪Bruke 600 MHz由瑞士-布鲁克公司生产纳米激光粒度仪Zetasizer Nano-ZS英国马尔文仪器公司恒温摇床DHZ-D太仓市实验设备厂超声震荡仪DS-5510DT上海生析超声仪器有限公司超净工作台双人垂直流型苏州合飞净化设备有限公司高效液相色谱Agilent 1100美国安捷伦公司UV-Vis分光光度计752N 型上海精科有机滤膜0.45m上海市新亚净化器件厂尼龙66过滤头孔径0.22 m天津津腾酶标仪ELX800美国Bio-TeK公司视差荧光显微镜XD30-RFL上海舜宇恒平科学仪器有限公司2.2 实验方法2.2.1 HCPT接枝PEI靶向基因载体的研究方法 2.2.1.1 材料的合成与表征的方法PEI-FA的合成：称取PEI 0.86 g，加入DMSO和水溶解。称取叶酸0.2207 g（0.5 mmol），加入DMSO溶解，溶解2 h全溶后，加入NHS 0.111g（1 mmol）活化3 h。将活化叶酸加入反应液中，半个小时后，加入EDCHCl 0.1917 g（1 mmol），室温反应24 h（Chinchilla R，et al，1996）。加双蒸水，减压过滤，滤液装活化过的透析袋透析3天，此间不断换置新的蒸馏水，后装入培养皿中冷冻干燥，得PEI-FA。HCPT-PEI的合成：加丁二酸0.5905 g（5 mmol），THF溶解，再加入50 L DMF，SOCl2 363 L（5 mmol），25下反应24 h。回流5分钟，旋蒸，得浅黄色固体。加入无水DMSO溶解，加入0.364 g HCPT（1 mmol），280 L三乙胺（2 mmol），室温反应24 h。加入0.222 g NHS（2 mmol），溶解活化半个小时。另称取PEI 0.86 g（20mmol），加入水溶液少许溶解，再加入DMSO进一步溶解，倒入上述反应液中。之后加入EDCHCl 0.3834 g（2 mmol），室温反应24 h。加双蒸水，减压抽滤。滤液装活化过的袋透析，透析3天，此间不断换双蒸水，后装入培养皿中冷冻真空干燥，得HCPT-PEI。HCPT-PEI-FA的合成：加丁二酸0.5905 g（5 mmol），THF溶解，再加入50 L DMF，SOCl2 363 L（5 mmol），25下反应24 h。回流5分钟，旋蒸，得浅黄色固体。加入无水DMSO溶解，加入0.364 g HCPT（1 mmol），280 L三乙胺（2 mmol），室温反应24 h。加入NHS 0.222 g（2 mmol），溶解活化半个小时。另称取PEI 0.86 g（20 mmol），加入水溶液少许溶解，再加入DMSO进一步溶解，倒入上述反应液中。之后加入EDCHCl 0.3834 g（2 mmol），室温反应24 h。加双蒸水，减压抽滤。滤液装袋透析，透析3天，此间不断换双蒸水，后装入培养皿中冷冻真空干燥。取出冷冻干燥产物，加入DMSO和水溶解。称取叶酸0.2207 g（0.5 mmol），加入DMSO溶解，溶解2 h全溶后，加入NHS 0.111 g（1 mmol）活化3 h。将活化叶酸加入反应液中，半个小时后，加入EDCHCl 0.1917 g（1 mmol），室温反应24 h。加双蒸水，减压过滤，滤液装活化过的透析袋透析3天，此间不断换置新的蒸馏水，后装入培养皿中冷冻干燥，得HCPT-PEI-FA。合成路线见图2.2.1.1。图2.2.1.1 产物HCPT-PEI-FA的合成路线本研究利用Nieolet 6700傅里叶红外光谱仪采用溴化钾压片法对合成产物进行化学键结构分析；利用Bruke 600 M核磁共振仪，采集时间2.6477 s，重复扫描16次对合成产物的质子进行检测。2.2.1.2 材料的粒径和Zeta电位的测量方法准确称取PEI、PEI-FA、HCPT-PEI和HCPT-PEI-FA各3 mg分别溶解于3.0 mL超纯水中，充分溶解。另按上述操作配置四种溶液，放置冰盒中冷却并一直保持低温，分别加入适量的DNA，充分静电吸附结合，应在2 小时内测量。采用Zetasizer Nano 2S纳米激光粒度仪测量纳米颗粒的半径与表面电位，在25的条件下，重复测量3次取平均值，确定纳米颗粒在水溶液中的直径与Zeta电位。2.2.1.3 药物体外释放的研究方法体外缓释根据参考相关文献（Hong M，et al.，2009；章莉，等，2009）。首先配制pH=4.5，7.4，7.4，9.0的含30%甲醇的磷酸缓冲液各300 mL。取四个500 mL的锥形瓶，分别加入上述配制pH=4.5，7.4，7.4，9.0的含30%甲醇的磷酸缓冲液各160 mL。称取20.0 mg干燥的HCPT-PEI-FA四份，分别用20 mL pH=4.5，7.4，7.4，9.0的上述配制的体积约为30%甲醇的磷酸缓冲液溶解于小烧杯中，并开始计时，快速装入活化过的透析袋（MWCO：3500 Da）中，再用10 mL相应的缓冲液洗涤烧杯一并转入透析袋中，如此两次。快速夹好夹子分别放入上述装有160 mL相同pH缓冲液的锥形瓶中。将pH=4.5，7.4，9.0的锥形瓶封好盖子快速置于已经调好温度为37的恒温摇床中保持漏槽状态以80 rpm的转速孵育。分别标记为号、号和号锥形瓶。将pH=7.4的另外一个锥形瓶封好盖子快速置于已经调好温度为0的恒温摇床中保持漏槽状态以80 rpm的转速孵育中，记为号锥形瓶。将剩余缓冲液也放入相应的相同温度下，用于补样。从开始计时起，每隔一定时间对号、号、号和号锥形瓶在透析袋外各取样1 mL装入1.5 mL离心管中，取样后立即补充同温度的等量介质，使总体积保持不变。将从pH=7.4，即号和号锥形瓶中取出的样品，每支离心管中加入12 L冰醋酸，将从pH=9.0，即号锥形瓶中取出的样品，每支离心管中加入20 L冰醋酸，酸化使羟基喜树碱的内酯环环合。之后均过0.2 m微孔过滤头，待进样检测。配制羟基喜树碱的标准溶液：准确称取一定量的羟基喜树碱标准品14.8 mg，用事先用分析级NaOH调成微碱性的色谱级甲醇溶解，再定容至100 mL；量取配好后的溶液10 mL加入100 mL容量瓶中，用事先已用盐酸调节pH=5的色谱级甲醇定容；之后逐次稀释得到系列需要的酸性的羟基喜树碱标准溶液。之后均过0.2 m微孔过滤头，待进样检测。流动相（Shi B，et al.，2006）醋酸铵缓冲液的配制：称取5.781 g醋酸铵和0.5060 g三乙胺，用超纯水定容至1000 mL，用冰醋酸调pH=5.6，得含75 mmol/L醋酸铵和5 mmol/L三乙胺的缓冲液。购买的超纯水直接使用，购买的色谱级甲醇、乙腈和配制的醋酸铵缓冲液均采用抽滤方法过0.22 m的有机系滤膜。采用Agilent 1100系列高效液相色谱仪进行检测（陈喆，等，2005；徐强，2012），检测色谱柱：Athena C18-WP柱(4.6mm250mm，5m)；流动相：醋酸铵缓冲液-乙腈（体积比为65：35）；柱温：30；进样量：20 L；流速：1 mL/min；320型紫外检测器：检测波长383 nm。2.2.1.4 细胞毒性实验方法采用CCK-8试剂盒测定PEI、PEI-FA、HCPT-PEI和HCP