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ICS 67.080.20 B 31 DB36 江西省地方标准 DB36/T 13942021 畜禽羽（毛）中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of amantadine,rimantadine and moroxydine residue in animal feather（hair）HPLC-MS/MS method 2021-04-23 发布 2021-11-01 实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 13942021 I 目 次 前言 .1 范围.1 2 规范性引用文件 .1 3 原理.1 4 试剂和材料.1 5 仪器和设备.2 6 试样制备与保存.2 7 测定.2 8 结果计算.4 9 方法灵敏度、准确度和精密度.4 附录 A（资料性）吗啉胍、金刚烷胺、金刚烷胺-D15 和金刚乙胺标准溶液定量离子色谱图.5 DB36/T 13942021 II 前 言 本文件是按照GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所。本文件主要起草人：胡丽芳、徐俊、周瑶敏、霍俊宏、武艳平、范芳、邱素艳、赖艳、聂根新。DB36/T 13942021 1 畜禽羽（毛）中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本文件规定了畜禽羽（毛）中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于猪、牛、羊、鸡羽（毛）中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的测定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样采用2%三氯乙酸溶液和乙腈超声提取，提取液过MCX固相萃取小柱净化，浓缩定容后，液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。4 试剂和材料 除非另有规定，以下试剂均为分析纯。水应符合 GB/T 6682 规定的一级水要求。4.1 甲醇：色谱纯。4.2 氯化钠:140烘烤 4 h。4.3 氨水。4.4 1%十二烷基磺酸钠（SDS）：称取 1g 十二烷基磺酸钠，溶于水，稀释至 100 mL。4.5 5%吐温 80：称取 0.5 g 吐温 80，溶于水，稀释至 100 mL。4.6 0.2 mol/L 盐酸溶液：量取 18.2 mL 浓盐酸，稀释至 1000 mL。4.7 2%三氯乙酸溶液：量取 2 mL 三氯乙酸，稀释至 100 mL。4.8 2%甲酸溶液：量取 2 mL 甲酸，稀释至 100 mL。4.9 5%氨水甲醇溶液：量取 5 mL 浓氨水，用甲醇定容至 100 mL，混匀。4.10 0.1%甲酸溶液：量取 1 mL 甲酸，稀释至 1000 mL。4.11 10%甲醇溶液：量取 10 mL 甲醇，用水定容至 100 mL，混匀。4.12 标准品：金刚烷胺（CAS 号：768-94-5）、金刚乙胺（CAS 号：1501-84-4）、吗啉胍（CAS 号：3731-59-7）和金刚烷胺-D15（CAS 号：33830-10-3），含量均98%。DB36/T 13942021 2 4.13 标准储备液（1 mg/mL）：准确称取金刚烷胺、金刚乙胺、吗啉胍和金刚烷胺-D15标准品各约 10 mg，分别于 10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度分别为 1 mg/mL 的金刚烷胺、金刚乙胺、吗啉胍和金刚烷胺-D15标准储备液。于-18下保存，有效期 6 个月。4.14 混合标准工作液（10 g/mL）：取上述标准储备液各 1 mL，于 100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 10 g/mL 的金刚烷胺、金刚乙胺、吗啉胍混合标准工作液。于 4C 下保存，有效期 3 个月。4.15 内标中间液（10 g/mL）：取上述金刚烷胺-D15储备液 1 mL，于 100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 10 g/mL 的金刚烷胺-D15中间液。于 4C 下保存，有效期 3 个月。4.16 内标工作液（1 g/mL）：取上述金刚烷胺-D15中间液 1 mL，于 10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 1 g/mL 的金刚烷胺-D15工作液。临用现配。5 仪器和设备 5.1 液相色谱-串联质谱：配电喷雾离子源。5.2 分析天平：感量 0.00001 g 和 0.01 g。5.3 超声清洗仪。5.4 离心机：转速不低于 8000 r/min。5.5 氮吹仪。5.6 固相萃取装置。5.7 涡旋混合器。5.8 MCX 固相萃取柱：60 mg/3mL。5.9 恒温水浴锅。5.10 微孔滤膜：有机相，0.22 m。6 试样制备与保存 从动物毛发根部剪取适量羽（毛），用水洗出畜禽羽（毛）可见杂质，用1%SDS+5%吐温80+纯水（1：1：1,V/V/V）超声15 min，冲洗干净，试纸吸干水，于45 烘箱中烘1 h，剪碎成 1 mm2 mm。7 测定步骤 7.1 提取 准确称取羽（毛）0.50 g于50 mL离心管中，加入20.0 L金刚烷胺-D15工作液（4.16），5 mL0.2 mol/L 盐酸溶液（4.6），混匀后于652恒温水浴锅中保持2 h，取出，加入3 mL 2%三氯乙酸溶液（4.7）和6 mL乙腈，涡旋30 s，超声提取40 min，加入4g氯化钠，涡漩混匀1 min，8000 r/min离心10 min，取上清液于另一离心管中。原离心管中加入3 mL 2%三氯乙酸溶液（4.7）和6 mL乙腈，重复提取1次，合并上清液，60下氮气吹干后，加入3 mL2%甲酸溶液（4.8）溶解。7.2 净化 用7.1提取液加载至已依次用3 mL甲醇、3 mL水活化过的MCX柱中，再依次用3 mL2%的甲酸溶液（4.8）、3 mL甲醇淋洗，减压抽干，用3 mL5%氨水甲醇溶液(4.9)洗脱，洗脱液在60 下氮气吹至近干，用1 mL 10%甲醇溶液（4.11）溶解残渣，涡旋30 s，经0.22 m滤膜过滤后，液相色谱-串联质谱仪测定。DB36/T 13942021 3 7.3 测定 7.3.1 液相色谱参考条件如下：a）色谱柱：C18(100 mm2.1mm，1.8 m），性能相当者。b）流动相：A为0.1%甲酸溶液（4.10）；B为甲醇，梯度洗脱，洗脱条件见表1。c）流速：0.25 mL/min。d）柱温：30。e）进样体积：5.0 L。表 1 液相色谱梯度洗脱参考条件 时间，min 流动相 A，%流动相 B，%0.0 90 10 3.0 80 20 5.0 10 90 5.1 98 2 7.0 98 2 7.3.2 质谱参考条件如下：a）扫描方式：正离子扫描。b）离子源：电喷雾离子源。c）毛细管电压：3000 V d）干燥气温度：150。e）干燥气流量：14 L/min。f）雾化气压力：30 psi。g）鞘气温度：300。h）鞘气流量：12 L/min。i）检测方式：多反应监测(MRM),监测条件见表2。表2 金刚烷胺、金刚乙胺、吗啉胍及金刚烷胺-D15特征离子质谱参考条件 化合物 母离子，m/z 子离子，m/z 碎裂电压，V 碰撞能量，eV 金刚烷胺 152.0 135.0*93.0 115 100 15 35 金刚烷胺-D15 167.3 150.3*120 35 金刚乙胺 180.1 163.1*121 107 110 110 110 14 24 28 吗啉胍 172.1 113*130 90 90 18 20 注：*为定量离子。7.4 标准曲线绘制 精密量取金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍混合标准工作液和内标工作液适量，用10%甲醇溶液（4.11）稀释成金刚烷胺、金刚乙胺、吗啉胍浓度为0.5 g/L、2 g/L、5g/L、10 g/L、20 g/L和40 g/L标准系列工作液，其中含金刚烷胺-D15浓度均为20 g/L，临用现配。以标准溶液中被测组分定量离子对与内标物峰面积的比值为纵坐标、标准溶液被测组分浓度为横坐标，绘制标准曲线。DB36/T 13942021 4 7.5 定性测定 通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。试样与标准品保留时间的相对偏差不大于2.5%；试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断试样中存在金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留。表3 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 50%20%50%10%20%10%允许的相对偏差 20%25%30%50%7.6 定量测定 采用标准曲线校准，内标法定量，标准溶液及试样溶液中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍的响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，金刚烷胺、金刚乙胺、吗啉胍和金刚烷胺-D15标准溶液定量离子色谱图参见附录 A。7.7 空白试验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。8 结果计算 试样中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量按式(1)计算：10001000mVX （1）式中：X试样中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍含量，单位为微克每千克(g/kg)；从标准曲线中查得的试样提取液中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍浓度，单位为微克每升(g/L)；V样液最终定容体积(mL)；m所取试样的质量，单位为克(g)。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9 方法灵敏度、准确度和精密度 9.1 灵敏度 本方法检测限均为0.5 g/kg。本方法定量限均为1.5 g/kg。9.2 准确度 本方法在1.5 g/kg80 g/kg添加浓度水平上的回收率为75%110%。9.3 精密度 在重复性条件下，2 次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的 15%。DB36/T 13942021 5 附 录 A（资料性）吗啉胍、金刚烷胺、金刚烷胺-D15和金刚乙胺标准溶液定量离子色谱图 图 A.1 金刚烷胺、金刚乙胺、吗啉胍和金刚烷胺-D15标准溶液(10.0 g/L)定量离子色谱图 1-金刚烷胺定量离子色谱图（152.0135.0）2-金刚乙胺定量离子色谱图（180.1163.1）3-吗啉胍定量离子色谱图（172.1113）4-金刚烷胺-D15定量离子色谱图（167.3150.3）_