液相色谱法测定茶叶中黄曲霉毒素.pptx

液相色谱法测定茶叶中黄液相色谱法测定茶叶中黄曲霉毒素曲霉毒素B1 u1、黄曲霉毒素，黄曲霉毒素，aflatoxin,简简写写AFT。u一、概述一、概述 u为黄曲霉产毒菌株的代谢产物，属超剧毒物质。u尤以AFTB 1 最为重要，毒性最强。u 2、理化性质理化性质uu（1 1）溶解性：难溶于水和乙醚、石油醚、已烷等非极性）溶解性：难溶于水和乙醚、石油醚、已烷等非极性或弱极性溶剂中。易溶于甲醇、氯仿、乙腈等极性溶剂中，或弱极性溶剂中。易溶于甲醇、氯仿、乙腈等极性溶剂中，溶于苯。溶于苯。uu（2 2）定性：对光、热、酸稳定；对碱和氧化剂不稳定。）定性：对光、热、酸稳定；对碱和氧化剂不稳定。uu光：光：AFTB 1 AFTB 1 和和AFTG 1 AFTG 1 溶液，日光照溶液，日光照1d1d，分解仅，分解仅40%40%。得低浓度纯品易为紫外光破坏。故标准品宜用黑纸包裹。得低浓度纯品易为紫外光破坏。故标准品宜用黑纸包裹储存。储存。uu热：开始分解温度热：开始分解温度 B 1 B 1，268268269269 uu酸：弱酸和中性介质中稳定；强酸和碱性条件下分解。酸：弱酸和中性介质中稳定；强酸和碱性条件下分解。uupHpH?时分解；时分解；uupH=9pH=91010时迅速分解成几乎无毒的盐（内酯键打开）：时迅速分解成几乎无毒的盐（内酯键打开）：uu氧化剂：对氧化剂也不稳定，氧化剂浓度越大，分解速度氧化剂：对氧化剂也不稳定，氧化剂浓度越大，分解速度越快：越快：C NaClO(g/L)破坏AFT所需的时间 uu54.5(g/L)54.5(g/L)立即立即 uu50(g/L)5s 50(g/L)5s uu40(g/L)1min 40(g/L)1min uu30(g/L)2min 30(g/L)2min uu20(g/L)3min 20(g/L)3min uu10(g/L)5min 10(g/L)5min uu5(g/L)30min 5(g/L)30min uu故实践上常可用漂白粉、氯、高锰酸钾、过氧化故实践上常可用漂白粉、氯、高锰酸钾、过氧化氢等消毒。氢等消毒。3、毒性毒性 uu（1 1）为已知的）为已知的100100多种霉菌毒素中毒性最大的，多种霉菌毒素中毒性最大的，属强致癌性物质属强致癌性物质 有报道说，其毒性比氰化钾更大，有报道说，其毒性比氰化钾更大，约大约大100100倍，比倍，比B B（a a）P P大大40004000倍倍，可对动物，可对动物造成急性中毒，也可引起慢性中毒和致癌、致畸、造成急性中毒，也可引起慢性中毒和致癌、致畸、致突变。它在致突变。它在WHOWHO确定的重点研究毒物中被列为确定的重点研究毒物中被列为首位。首位。uu1 1）各种各种 AFTAFT的毒性大小并不相同：的毒性大小并不相同：uu uu顺顺 序序 B1 G1 B2 M1 G2 M2 B1 G1 B2 M1 G2 M2 B2a LD 0.36 0.78 1.7 3.2 3.5 B2a LD 0.36 0.78 1.7 3.2 3.5 12 240 12 240 uu(5050mg/kg)mg/kg)uu注：对鸭雏，注：对鸭雏，LD50LD50小于小于50mg/kg50mg/kg即为剧毒物即为剧毒物 uu美国研究结论，美国研究结论，1g/kgAFTB11g/kgAFTB1可使大白鼠致癌；可使大白鼠致癌；我国研究，我国研究，20g/kg20g/kg可使大白鼠致癌。可使大白鼠致癌。uu uu（2）与人致癌的关系 uu黄曲霉毒素高污染地区，其肝癌发病率明显较高。如江苏的启东，福建的铜安，广东的汕头，广西的抹援，为我国 4个肝癌高发病地区。（2）污染 调查 uu很广泛，各种粮食中均可检出，核桃、乳及其制品、干辣椒中也有检出。但以花生、玉米、棉籽及其制品污染最为严重，稻谷、高粱其次，“三麦”甚微。uu（1）污染特点 uu玉米：胚部污染；uu花生、棉籽：整粒污染但仅限于少数颗粒；uu小麦：皮层污染。（2）污染 调查 uu1976197619781978年，粮食部组织，调查了年，粮食部组织，调查了1818个粮种，取样个粮种，取样1912219122个，检出个，检出72337233个，检出率个，检出率37.7%,37.7%,其中超标率占其中超标率占49.2%49.2%。uu主要粮种情况（主要粮种情况（g/kg g/kg）：）：uu玉米，平均玉米，平均 400400，最高，最高1000100012001200；(所以不要吃玉米所以不要吃玉米)uu花生，平均花生，平均 200200500500，最高，最高5000050000；(所以不要吃花生所以不要吃花生)uu花生油，平均花生油，平均 400400，最高，最高80008000；(所以不要吃花生油所以不要吃花生油)uu稻谷（洞庭湖）平均稻谷（洞庭湖）平均 5050100100，最高，最高330330。(所以不要吃所以不要吃稻谷稻谷)uu总体分布，广西、福建、江苏污染最严重，山东以北诸省总体分布，广西、福建、江苏污染最严重，山东以北诸省污染少。污染少。5、限制标准（限制标准（g/kg）uu（1 1）GB GB uu花生、玉米、花生油及其制品，花生、玉米、花生油及其制品，2020；uu大米及其它食用油，大米及其它食用油，1010；uu其它粮食、豆类、发酵食品，其它粮食、豆类、发酵食品，5 5；uu婴儿代乳品，不得检出。婴儿代乳品，不得检出。uu（2 2）国外标准（）国外标准（g/kgg/kg）uuFAO/WHOFAO/WHO，1515；uu美国，美国，2525；uu加拿大，加拿大，1515；uu日本，日本，1010；uu印度，印度，3030；uu以色列、瑞典，不得检出。以色列、瑞典，不得检出。uu1.适用范围适用范围uu本方法适用于出口茶叶中黄曲霉毒素B1含量的检验。uu2.原理概要原理概要uu样品用三氯甲烷提取，提取液经硅胶柱净化，净化后的提取液用三氟乙酸衍生，用配有荧光检测器的液相色谱仪测定，外标法定量。3.主要试剂和仪器主要试剂和仪器uu3.1.3.1.主要试剂主要试剂uu三氯甲烷；三氯甲烷；uu正己烷；正己烷；uu苯；苯；uu甲醇：紫外光谱级；甲醇：紫外光谱级；uu乙腈：紫外光谱级；乙腈：紫外光谱级；uu三氟乙酸；三氟乙酸；uu乙腈乙腈-水溶液水溶液(1(11)1)；uu三氯甲烷三氯甲烷-甲醇溶液甲醇溶液(95(955)5)；uu苯苯-乙腈溶液乙腈溶液(98(982)2)；uu黄曲霉毒素黄曲霉毒素B1B1标准品：纯度标准品：纯度99%99%；uu黄曲霉毒素黄曲霉毒素B1B1标准溶液：准确称取适量的黄曲霉毒素标准溶液：准确称取适量的黄曲霉毒素B1B1标准品，以苯标准品，以苯-乙腈溶液于棕色容量瓶中，配成浓度为乙腈溶液于棕色容量瓶中，配成浓度为10g/mL10g/mL标准贮备液。根据需要，再配成适当浓度的标标准贮备液。根据需要，再配成适当浓度的标准工作溶液。准工作溶液。uu3.2.3.2.仪器仪器uu液相色谱仪，配有荧光检测器；液相色谱仪，配有荧光检测器；uu硅胶小柱：硅胶小柱：Waters Sep-pak SilicaWaters Sep-pak Silica前处理小柱或相当的前处理小柱或相当的硅胶前处理小柱；硅胶前处理小柱；uu振荡器；振荡器；uu旋转蒸发器，配有旋转蒸发器，配有100mL100mL具尾管的圆底烧瓶；具尾管的圆底烧瓶；uu微量注射器；微量注射器；uu离心管：离心管：5mL5mL具塞磨口；具塞磨口；uu粉碎机；粉碎机；uu滤膜：有机系用，滤膜：有机系用，0.45m0.45m；uu微孔滤膜过滤器：有机系用，微孔滤膜过滤器：有机系用，0.5m0.5m。4.试样的抽取与制备试样的抽取与制备uu4.1.4.1.检验批检验批uu以不超过以不超过20002000件为一检验批。件为一检验批。uu同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格、等级等。地、规格、等级等。uu4.3.4.3.抽样方法抽样方法uu从整批产品堆垛的上下不同部位随机抽取从整批产品堆垛的上下不同部位随机抽取2.22.2规定的件数，规定的件数，逐件开启。分别倒出全部茶叶于塑料布上，用取样铲从每逐件开启。分别倒出全部茶叶于塑料布上，用取样铲从每件中各取出有代表性的样品约件中各取出有代表性的样品约500g500g。将所取样品充分混。将所取样品充分混匀，用四分法或分样器逐步缩分出匀，用四分法或分样器逐步缩分出500g500g，装入洁净密封，装入洁净密封的样品筒内，加封后，标明标记，及时送实验室。的样品筒内，加封后，标明标记，及时送实验室。4.2.抽样数量uu批量，件 最低抽样数，件15 1 650 2 51500 11 5011000 16 10011500 19 15012000 20 uu4.4.试样制备uu将所取回样品全部磨碎，通过20目筛，混匀，均分成两份试样，装入洁净容器内，密封，标明标记。uu4.5.试样保存uu将试样于室温下保存。uu注：在抽样和制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。过程简述过程简述 uu5.1.5.1.提取提取uu称取试样称取试样5.0g(5.0g(精确到精确到0.1g)0.1g)置于置于100mL100mL具塞锥具塞锥形烧瓶中，加入形烧瓶中，加入15mL15mL三氯甲烷，于振荡器上提三氯甲烷，于振荡器上提取取30min30min，然后经垫有玻璃纤维的漏斗过滤。收，然后经垫有玻璃纤维的漏斗过滤。收集滤液于旋转蒸发器的具尾管圆底烧瓶内，并用集滤液于旋转蒸发器的具尾管圆底烧瓶内，并用三氯甲烷洗涤滤渣，收集滤液至三氯甲烷洗涤滤渣，收集滤液至uu5.2.5.2.净化净化uu用旋转蒸发器将上述滤液在用旋转蒸发器将上述滤液在5050水浴中浓缩至约水浴中浓缩至约1mL1mL，经，经0.45m0.45m滤膜过滤后，注入硅胶小柱中。滤膜过滤后，注入硅胶小柱中。用用2 24mL4mL正己烷洗涤烧瓶后淋洗小柱，弃去流正己烷洗涤烧瓶后淋洗小柱，弃去流出液。然后用出液。然后用3 34mL4mL三氯甲烷三氯甲烷-甲醇溶液以每秒甲醇溶液以每秒钟钟2 2滴的流速洗脱，收集洗脱液于离心管中。用氮滴的流速洗脱，收集洗脱液于离心管中。用氮气缓缓吹干，供衍生用。气缓缓吹干，供衍生用。5.3.衍生uu5.3.1.5.3.1.试样试样uu加加200L200L正己烷和正己烷和50L50L三氟乙酸于上述离心管中，三氟乙酸于上述离心管中，盖紧磨口塞，超声振荡盖紧磨口塞，超声振荡1min1min，静置，静置10min10min，打开，打开磨口塞，缓缓通入氮气至干。用乙腈磨口塞，缓缓通入氮气至干。用乙腈-水溶液水溶液(1(11)1)定容至定容至1.0mL1.0mL，超声，超声1min1min，用，用0.5m0.5m滤膜过滤膜过滤，滤液供液相色谱用。滤，滤液供液相色谱用。uu5.3.2.5.3.2.标准工作溶液标准工作溶液uu取取1.0mL1.0mL标准工作溶液，用氮气缓缓吹干，按标准工作溶液，用氮气缓缓吹干，按5.3.15.3.1步骤操作。步骤操作。5.4.测定uu5.4.1.5.4.1.色谱条件色谱条件uu色谱柱：色谱柱：NOVA PAKc18NOVA PAKc18，300mm3.9mm(300mm3.9mm(内内径径)；uu流动相：甲醇流动相：甲醇-水溶液水溶液(42(4258)58)；uu流速：流速：0.8mL/min0.8mL/min；uu荧光检测器：激发波长荧光检测器：激发波长375 nm375 nm，发射波长，发射波长425 425 nmnm；uu色谱柱温度：室温。色谱柱温度：室温。uu5.4.2.5.4.2.测定测定uu根据样液中黄曲霉毒素根据样液中黄曲霉毒素B1B1的含量情况，选定峰高的含量情况，选定峰高相近的标相近的标uu准工作溶液。标准工作溶液和样液中黄曲霉毒素准工作溶液。标准工作溶液和样液中黄曲霉毒素B1B1衍生物的响应值均应在仪器检测线性范围内。衍生物的响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液的衍生物溶液等体积参插对标准工作溶液和样液的衍生物溶液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，黄曲霉毒素进样测定。在上述色谱条件下，黄曲霉毒素B1B1衍衍生物保留时间约为生物保留时间约为8min8min。uu5.4.3.5.4.3.空白试验空白试验uu除不加试样外，按上述测定步骤进行。除不加试样外，按上述测定步骤进行。6.结果计算结果计算uu用色谱数据处理机或按下式计算试样中黄曲霉毒用色谱数据处理机或按下式计算试样中黄曲霉毒素素B1B1的含量：的含量：uuX XA A cs/Ascs/As c cuu式中：式中：uuX X 试样中黄曲霉毒素试样中黄曲霉毒素B1B1的含量，的含量，mg/kgmg/kg；uuA A 样液中黄曲霉毒素样液中黄曲霉毒素B1B1衍生物的峰面积，衍生物的峰面积，mm2mm2；uuc cs s 标准工作溶液中黄曲霉毒素标准工作溶液中黄曲霉毒素B1B1的浓度的浓度g/mLg/mL；uuA As s 标准工作溶液中黄曲霉毒素标准工作溶液中黄曲霉毒素B1B1衍生物的衍生物的峰面积，峰面积，mm2mm2；uuc c 最终样液所代表试样的浓度，最终样液所代表试样的浓度，g/mLg/mL。uu注：计算结果需扣除空白值。注：计算结果需扣除空白值。7.低限和回收率测定低限和回收率测定uu7.1.低限uu本方法的测定低限为0.001mg/kg。uu7.2.回收率uu回收率的实验数据：黄曲霉毒素B1的添加浓度在0.0010.5mg/kg范围内，回收率为89.1%104.9%。睡着了没大家，我讲完了u谢谢大家