淋巴细胞转化实验111213.pptx

LOGO细胞培养技术细胞培养技术2011.12.13LOGO细胞培养概述细胞培养概述v细胞培养（细胞培养（cell culturecell culture）：从体内取出组织或）：从体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适细胞，在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适宜温度和一定营养条件下使其生长，并维持其结宜温度和一定营养条件下使其生长，并维持其结构和功能的方法。构和功能的方法。v细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，亦细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，亦是生命科学各研究领域的基础技术和基本技能。是生命科学各研究领域的基础技术和基本技能。LOGO细胞培养实验的基本要求细胞培养实验的基本要求v实验前准备：超净台紫外线消毒实验前准备：超净台紫外线消毒30min30min；无菌室每周消毒；无菌室每周消毒1-21-2次；所用器材要经过严格消毒；操作前用消毒液浸泡次；所用器材要经过严格消毒；操作前用消毒液浸泡手或用手或用75%75%酒精擦拭。酒精擦拭。LOGOv实验中要求：实验中要求：一切操作均要在火焰前方进行；瓶口、吸管使用前要经过一切操作均要在火焰前方进行；瓶口、吸管使用前要经过火焰消毒后使用。火焰消毒后使用。试剂瓶的瓶口应斜放在支架上，试剂用后立即封闭瓶口。试剂瓶的瓶口应斜放在支架上，试剂用后立即封闭瓶口。专管专用。专管专用。手不要从敞开的瓶口上方经过。手不要从敞开的瓶口上方经过。换液时，吸取培养基的吸管不要触及细胞培养瓶瓶口，以换液时，吸取培养基的吸管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞免把细胞带到培养液中污染其他细胞;细胞一旦购置或从别处引入，均应及早留种冻存，一旦发细胞一旦购置或从别处引入，均应及早留种冻存，一旦发生污染可重新复苏培养生污染可重新复苏培养LOGOv实验后要求：实验后要求：关闭超净台风机；用酒精纱布擦拭超净台台面，紫外线消毒。关闭超净台风机；用酒精纱布擦拭超净台台面，紫外线消毒。LOGO细胞培养条件细胞培养条件v合成培养基：根据体内细胞生存所需的物质种类和数量，用化学物质模拟合成培养基：根据体内细胞生存所需的物质种类和数量，用化学物质模拟合成。合成。常用的培养基有常用的培养基有RPMI-1640RPMI-1640、DMEMDMEM、IMDMIMDM等。等。v血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清。血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清。v抗菌素：抑制可能存在的细菌和霉菌的生长，而不影响细胞的生长。抗菌素：抑制可能存在的细菌和霉菌的生长，而不影响细胞的生长。常用青、链霉素；庆大霉素等。常用青、链霉素；庆大霉素等。v消化液（培养贴壁细胞用）：消化液（培养贴壁细胞用）：0.25%0.25%胰蛋白酶、胰蛋白酶、EDTA液液vpHpH调整液调整液 NaHCO3 NaHCO3溶液：常用浓度为溶液：常用浓度为5.6%5.6%和和7.4%7.4%Hepes Hepes液：可较长时间保持较强的缓冲作用液：可较长时间保持较强的缓冲作用v培养条件：无菌、培养条件：无菌、LOGO细胞培养基本技术细胞培养基本技术v细胞原代培养：细胞原代培养：从供体获取组织细胞的首次培养。原代从供体获取组织细胞的首次培养。原代细胞离体时间短，在一定程度上能反映体内的生长特性。细胞离体时间短，在一定程度上能反映体内的生长特性。适合作药物测试、细胞分化和转化等实验研究。适合作药物测试、细胞分化和转化等实验研究。v细胞传代培养：细胞传代培养：原代培养细胞长到一定密度时，需进行原代培养细胞长到一定密度时，需进行传代培养。传代培养。悬浮生长细胞传代：离心法悬浮生长细胞传代：离心法 半悬浮生长细胞传代：直接吹打法半悬浮生长细胞传代：直接吹打法 贴壁生长细胞传代：胰酶消化法贴壁生长细胞传代：胰酶消化法LOGO细胞的冻存、复苏与运输细胞的冻存、复苏与运输v细胞的冻存细胞的冻存 10 10DMSODMSO（低温保护剂），（低温保护剂），2020以上的血清，其余为培以上的血清，其余为培养基，细胞数养基，细胞数1101106 6个个-110-1107 7个。二步冻结法。个。二步冻结法。v细胞的复苏细胞的复苏 从液氮罐中取出的冻存管，迅速投入从液氮罐中取出的冻存管，迅速投入3737水浴中充分摇水浴中充分摇动，使其迅速融化。加入培养液离心后，弃上清，加培动，使其迅速融化。加入培养液离心后，弃上清，加培养液培养。养液培养。v细胞的运输细胞的运输 长距离运输：补充培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧长距离运输：补充培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖；瓶口用胶带密封，并用棉花包裹作防震、防压紧瓶盖；瓶口用胶带密封，并用棉花包裹作防震、防压处理。处理。LOGO细胞培养常见污染及处理方法细胞培养常见污染及处理方法细菌细菌细菌细菌污染污染污染污染处理处理:将污染孔内液体弃掉，加入硫酸铜将污染孔内液体弃掉，加入硫酸铜或或5mol/L NaOH;5mol/L NaOH;重要克隆洗涤数次后重要克隆洗涤数次后,大剂量联用大剂量联用抗生素效果较好抗生素效果较好;反复洗涤后注射到小鼠腹腔中反复洗涤后注射到小鼠腹腔中(限用限用于某些细胞于某些细胞)培养液变混浊，培养液变混浊，pHpH改变改变;细胞发生病理改变，胞细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。LOGO处理处理:应用达克宁、咪唑康；应用达克宁、咪唑康；处理处理COCO2 2孵箱孵箱真菌真菌真菌真菌污染污染污染污染培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，培养液一般不发生混浊；培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，培养液一般不发生混浊；镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间，有镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间，有的呈链状排列的呈链状排列;细胞生长变慢，最后由于营养耗尽及毒性作用细胞生长变慢，最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。而使细胞脱落死亡。LOGO支原体支原体支原体支原体污染污染污染污染难发现难发现,难去除难去除;预防为主预防为主新一代支原体抗生素可杀灭支原体新一代支原体抗生素可杀灭支原体一般过滤除菌无法去除，光镜下难以看清形态结构一般过滤除菌无法去除，光镜下难以看清形态结构;能在偏碱条件下生存能在偏碱条件下生存;对青霉素有抗药性对青霉素有抗药性;多吸附于细胞表面或散在于细胞之间多吸附于细胞表面或散在于细胞之间;多数细胞污染后无明显变化多数细胞污染后无明显变化如果发现如果发现破碎的细胞甚多破碎的细胞甚多，培养细胞，培养细胞需要频繁改善营养环境需要频繁改善营养环境才能才能支持长期传代培养时，应该怀疑支原体污染支持长期传代培养时，应该怀疑支原体污染LOGO扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体LOGO处理处理:更换血清更换血清;增加细胞的接种密度，以提高细胞的生存率增加细胞的接种密度，以提高细胞的生存率 黑胶虫黑胶虫黑胶虫黑胶虫污染污染污染污染可以穿过滤膜可以穿过滤膜.低倍镜下为黑色点状低倍镜下为黑色点状,高倍镜下可见黑点游动高倍镜下可见黑点游动;培养液培养液一般不受影响一般不受影响;细胞增殖旺盛时可自然消失细胞增殖旺盛时可自然消失LOGO淋巴细胞转化实验淋巴细胞转化实验2010.12.21LOGOv淋巴细胞在体外培养时，受到刺激剂的刺激后可表淋巴细胞在体外培养时，受到刺激剂的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现象称为淋增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）。巴细胞转化现象（简称为淋转）。v淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。原理原理LOGOvT细胞、细胞、B细胞表面具有抗原识别受体和有丝分裂原细胞表面具有抗原识别受体和有丝分裂原受体受体植物血凝素（植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白）、刀豆蛋白A（ConA）可选择）可选择性刺激性刺激T细胞增殖；细胞增殖；脂多糖（脂多糖（LPS）可刺激）可刺激B细胞增殖；细胞增殖；LOGO作用于人和小鼠作用于人和小鼠T/BT/B淋巴细胞的重要丝裂原淋巴细胞的重要丝裂原对对T/B淋巴细胞的粗增殖作用淋巴细胞的粗增殖作用人人T细胞细胞人人B细胞细胞小鼠小鼠T细胞细胞小鼠小鼠B细胞细胞刀豆蛋白刀豆蛋白A（ConAn）+_+_植物血凝素植物血凝素（PHA）+_+_美洲商陆美洲商陆（PWM）+脂多糖脂多糖（LPS）_+葡萄球菌葡萄球菌A蛋蛋白菌体白菌体（SAC）_+LOGOv分离人外周血单个核细胞（分离人外周血单个核细胞（PBMC）v分离人淋巴细胞分离人淋巴细胞(磁珠分离，流式细胞术磁珠分离，流式细胞术)v淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验实验流程实验流程LOGO实验流程实验流程PBMC的分离的分离v基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，红细胞、中性粒细胞比重为红细胞、中性粒细胞比重为1.0921.092，单个核细胞，单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）比重为（淋巴细胞和单核细胞）比重为1.0751.0751.0901.090；FicollFicoll比重为比重为1.0770.0011.0770.001。将血液标本置于分。将血液标本置于分层上，经离心沉淀，比重高的红细胞、多核白细层上，经离心沉淀，比重高的红细胞、多核白细胞沉于管底，而比重小的淋巴细胞和单核细胞悬胞沉于管底，而比重小的淋巴细胞和单核细胞悬浮于血浆和分层液的界面层中。浮于血浆和分层液的界面层中。LOGO淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液 红细胞、粒细红细胞、粒细胞、血小板胞、血小板血浆血浆LOGO实验流程实验流程淋巴细胞转化实验淋巴细胞转化实验基本原理：基本原理：v在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖；增殖；v有丝分裂原可作为多克隆刺激剂，使相应淋巴细有丝分裂原可作为多克隆刺激剂，使相应淋巴细胞发生增殖。胞发生增殖。LOGOv形态计数法、形态计数法、MTTMTT法、法、CCK-8CCK-8法、同位素法。法、同位素法。（一）形态计数法：计数淋巴母细胞的比例，计算转（一）形态计数法：计数淋巴母细胞的比例，计算转化百分率。化百分率。（二）（二）MTTMTT法：法：MTTMTT是一种噻唑盐。活细胞内线粒体琥是一种噻唑盐。活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶以珀酸脱氢酶以MTTMTT为底物，形成蓝色的甲臜为底物，形成蓝色的甲臜（FormazanFormazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经溶解后为紫色溶液，可用酶标测定仪测定溶解后为紫色溶液，可用酶标测定仪测定OD570OD570的值。的值。实验流程实验流程结果观察结果观察LOGO（四）（四）3 3H-TdR H-TdR 掺入法：掺入法：3 3H-TdRH-TdR即胸腺嘧啶核苷，是即胸腺嘧啶核苷，是DNADNA合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNADNA合成的原料。细胞合成的合成的原料。细胞合成的DNADNA越多，则所掺入的越多，则所掺入的3 3H-TdRH-TdR就越多。该方法与就越多。该方法与MTTMTT比较，灵敏度高、准确性好。比较，灵敏度高、准确性好。（三）（三）CCK-8(Cell Counting Kit-8)CCK-8(Cell Counting Kit-8)法法:原理同原理同法。法。是的升级替代产品，是的升级替代产品，可被还原成橙黄色的甲可被还原成橙黄色的甲臜，且为水溶性。本方法重复性好，灵敏度高，对细胞臜，且为水溶性。本方法重复性好，灵敏度高，对细胞的毒性低。的毒性低。实验流程实验流程结果观察结果观察LOGOLOGOv取静脉血取静脉血3ml,用用PBS（吸管（吸管1）稀释稀释1倍倍（滴管（滴管1）（共（共6ml）v将稀释好的静脉血沿管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液（将稀释好的静脉血沿管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液（3ml）的上方）的上方（滴（滴管管1）,2000rpm,20minv将滴管将滴管（滴管（滴管2）插入到白膜层，吸取单个核细胞层，转移至另一离心管中，插入到白膜层，吸取单个核细胞层，转移至另一离心管中，加入加入PBS（吸管（吸管1）至至5ml,1500rpm,10min.弃上清，再洗涤细胞弃上清，再洗涤细胞1次次（吸管（吸管1）（滴管（滴管2）.离心之前计数细胞离心之前计数细胞v弃上清弃上清,加入完全培养基加入完全培养基（吸管（吸管2）,重悬细胞重悬细胞（滴管（滴管2）.将细胞浓度调整为将细胞浓度调整为2*106个个/ml.将细胞加入将细胞加入96孔板孔板（加样枪）（加样枪）,100ul/孔孔vA组：加入不同浓度的组：加入不同浓度的ConA,100ul/孔孔.每个浓度为每个浓度为2复孔复孔.留留2个孔仅加个孔仅加入培养基，作为空白对照入培养基，作为空白对照.B组：加入组：加入100ul ConA(10ug/ml),则终浓度为则终浓度为5ug/ml.4复孔复孔.设空设空白对照白对照.实验步骤实验步骤LOGOvA组：置培养箱中培养组：置培养箱中培养66h,加入加入MTT溶液溶液20ul/孔孔,继续培继续培养养6hr后后,去掉上清去掉上清,加入加入DMSO100ul/孔孔,弃分混匀弃分混匀,测测OD570nm值值.B组：置培养箱中培养组：置培养箱中培养66h，制备流式标本，上机检测，制备流式标本，上机检测细胞数细胞数/ml4大格中细胞总数大格中细胞总数410104 4 稀释倍数稀释倍数LOGOConA的倍比稀释的倍比稀释10ug/ml5ug/ml 2.5ug/ml450L440L220L220LOriginal sample tubetube 1tube 2220LConA 20ug/ml 250ul 加250ul全培LOGOv注意注意无菌无菌操作操作v操作中尽可能短时间内完成，以减少死细胞数操作中尽可能短时间内完成，以减少死细胞数v将稀释血加于分离液时，动作要将稀释血加于分离液时，动作要轻柔轻柔v离心时，加速度与减速度要均匀平稳，不能用离心机离心时，加速度与减速度要均匀平稳，不能用离心机“刹车刹车”档档v分离不同种属动物的分离不同种属动物的PBMCPBMC要用不同的淋巴细胞分离液要用不同的淋巴细胞分离液v细胞数量、刺激剂浓度需要在预实验中摸索最适条件细胞数量、刺激剂浓度需要在预实验中摸索最适条件注意事项注意事项LOGO