现代生物技术-09生物技术与人类健康.pptx

9生物技术与人类健康学习目的学习目的 认识医学领域是现代生物技术应用最广泛、成绩最显著、发展最迅速的领域。了解生物技术对疫苗生产、疾病诊断、生物制药等领域的影响；了解生物技术对人类健康、延长人类寿命、提高生活质量所具有的不可估量的作用。医药卫生领域是现代生物技术应用最广泛、医药卫生领域是现代生物技术应用最广泛、成绩最显著、发展最迅速、潜力也最大的一成绩最显著、发展最迅速、潜力也最大的一个领域。个领域。生产常规方法不能生产的药品或制剂。生产常规方法不能生产的药品或制剂。生产灵敏度高、反应专一、实用性强的临床生产灵敏度高、反应专一、实用性强的临床诊断新试剂。诊断新试剂。提供安全性能好、免疫能力强的新一代疫苗。提供安全性能好、免疫能力强的新一代疫苗。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9 9 生物技术与人类健康生物技术与人类健康生物技术与人类健康生物技术与人类健康引言引言广义的疫苗是指将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。其中，由细菌制成的称为菌苗；由病毒、立克次体、螺旋体等制成的称为疫苗。9.1 生物技术与疫苗生物技术与疫苗9.1.1 疫苗概说 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9 9 生物技术与人类健康生物技术与人类健康生物技术与人类健康生物技术与人类健康公元公元10世纪，在宋朝的真宗时代，我国世纪，在宋朝的真宗时代，我国 就有了接种人痘预防天花的记载。就有了接种人痘预防天花的记载。1796年英国医生年英国医生Jenner发现用牛痘代替发现用牛痘代替人痘接种同样可预防天花。人痘接种同样可预防天花。特点：直接用未减毒的病原体作为疫苗。特点：直接用未减毒的病原体作为疫苗。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.1 疫苗概说疫苗概说疫苗的发展历史 早期疫苗 第一代疫苗 19世纪中叶，法国科学家世纪中叶，法国科学家Parsteur首先首先发明了减毒疫苗的制备技术。用病原体减毒发明了减毒疫苗的制备技术。用病原体减毒或弱化制成疫苗，称之为第一代疫苗。或弱化制成疫苗，称之为第一代疫苗。特点：特点：以减毒、弱化或灭活的病原体做以减毒、弱化或灭活的病原体做疫苗。疫苗。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.1 疫苗概说疫苗概说 第二代疫苗第二代疫苗(基因工程疫苗基因工程疫苗)将病原体的抗原（某种蛋白质）基因克将病原体的抗原（某种蛋白质）基因克隆在细菌或真核细胞内，利用其生产的病原隆在细菌或真核细胞内，利用其生产的病原体抗原作为疫苗。体抗原作为疫苗。特点：特点：利用病原体的利用病原体的 某些抗原成分作为疫苗。某些抗原成分作为疫苗。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.1 疫苗概说疫苗概说 第三代疫苗第三代疫苗(核酸疫苗核酸疫苗)将含有编码病原体抗原基因序列的质粒将含有编码病原体抗原基因序列的质粒载体直接作为疫苗，经肌肉注射或微弹轰载体直接作为疫苗，经肌肉注射或微弹轰击等方法导入体内，通过宿主细胞表达系击等方法导入体内，通过宿主细胞表达系统表达抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原统表达抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。蛋白的免疫应答。特点：特点：用含有病原体抗原基因序列的质用含有病原体抗原基因序列的质粒载体直接作为疫苗。粒载体直接作为疫苗。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.1 疫苗概说疫苗概说DNA VaccinesplasmidMuscle cellGene for antigenMuscle cell expresses protein-antibody madeCTL responseDNA Vaccines Plasmids are easily manufactured in large amounts DNA is very stable DNA resists temperature extremes so storage and transport are straight forward DNA sequence can be changed easily in the laboratory.This means that we can respond to changes in the infectious agent By using the plasmid in the vaccinee to code for antigen synthesis,the antigenic protein(s)that are produced are processed(post-translationally modified)in the same way as the proteins of the virus against which protection is to be produced.This makes a far better antigen than purifying that protein and using it as an immunogen.DNA Vaccines Mixtures of plasmids could be used that encode many protein fragments from a virus/viruses so that a broad spectrum vaccine could be produced The plasmid does not replicate and encodes only the proteins of interest No protein component so there will be no immune response against the vector itself Because of the way the antigen is presented,there is a CTL response that may be directed against any antigen in the pathogen.A CTL response also offers protection against diseases caused by certain obligate intracellular pathogens(e.g.Mycobacterium tuberculosis)DNA VaccinesPossible Problems Potential integration of plasmid into host genome leading to insertional mutagenesis Induction of autoimmune responses(e.g.pathogenic anti-DNA antibodies)Induction of immunologic tolerance(e.g.where the expression of the antigen in the host may lead to specific non-responsiveness to that antigen)AbAg静止静止B 细胞细胞辅佐细胞辅佐细胞(巨噬细胞）巨噬细胞）静止静止T 细胞细胞病原微生物病原微生物激活激活记忆记忆B 细胞细胞浆细胞浆细胞活化的活化的T细胞细胞激活激活9.1.2 9.1.2 免疫系统及疫苗的作用机理免疫系统及疫苗的作用机理免疫系统及疫苗的作用机理免疫系统及疫苗的作用机理 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1 生物技术与疫苗生物技术与疫苗艾滋病艾滋病：人类和灵长类动物免疫缺陷型严人类和灵长类动物免疫缺陷型严重疾重疾 病。病。1999年，全世界已有年，全世界已有3400万人感万人感染了艾滋病病毒，其中染了艾滋病病毒，其中1600万人死于艾滋万人死于艾滋病。每天估计有病。每天估计有1.6万人受到感染。万人受到感染。乙型肝炎：乙型肝炎：乙型肝炎患者及健康带毒者在乙型肝炎患者及健康带毒者在我国大约有我国大约有1.3亿人，每亿人，每10个人就有一个。个人就有一个。流感病毒：流感病毒：人类的常见病和多发病。人类的常见病和多发病。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1 生物技术与疫苗生物技术与疫苗9.1.3 病毒性疾病的疫苗病毒性疾病的疫苗19811981年年年年EdmanEdman等克等克等克等克隆了该抗原基因并大隆了该抗原基因并大隆了该抗原基因并大隆了该抗原基因并大量表达。量表达。量表达。量表达。美国、日本采用酵母美国、日本采用酵母表达系统生产表面抗表达系统生产表面抗原而制成原而制成 疫苗。疫苗。以色列等国采用仓鼠以色列等国采用仓鼠细胞生产疫苗。细胞生产疫苗。我国可采用以上两种我国可采用以上两种表达系统生产疫苗。表达系统生产疫苗。9.1.3.1 9.1.3.1 肝炎病毒疫苗肝炎病毒疫苗肝炎病毒疫苗肝炎病毒疫苗乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBsAg）生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.3 病毒性疾病的疫苗病毒性疾病的疫苗New Methods Recombinant DNASingle gene(subunit)S-antigen mRNAcDNAExpress plasmidS-antigen mRNA proteinHepatitis B vaccineraised in yeast国外已有甲型肝炎病毒灭活疫苗面市。国外已有甲型肝炎病毒灭活疫苗面市。我国使用的减毒疫苗也取我国使用的减毒疫苗也取 得了很好的效果。国内基得了很好的效果。国内基 因工程空壳甲肝病毒及痘因工程空壳甲肝病毒及痘 苗活病毒疫苗也显示了很苗活病毒疫苗也显示了很 好的免疫原性。好的免疫原性。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.3.1 肝炎病毒疫苗肝炎病毒疫苗 甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒戊型肝炎是乙肝和甲肝之外的又一种重要的病毒性肝炎。在临床症状上与甲肝相似,患者有明显的乏力、食欲减退、恶心、呕吐，部分患者可出现黄疸。接种疫苗是预防戊肝的最好办法。不过，迄今为止世界上仍未有疫苗获批上市。厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心科研人员经过艰苦的联合攻关，首次成功地利用大肠杆菌表达系统获得了戊型肝炎类病毒颗粒，目前正准备进入III期临床试验。如果获得成功，该疫苗将成为继乙肝疫苗之后,世界上第二个基因工程病毒疫苗。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.3.1 肝炎病毒疫苗肝炎病毒疫苗 戊型肝炎病毒戊型肝炎病毒丙型肝炎是由丙肝病毒（HCV）所引起，是通过输血或血制品、破损的皮肤和黏膜、静脉注射毒品、性传播、母婴传播等传染引起的。丙型肝炎病毒感染后，大部分患者转为慢性肝炎，其中部分患者可发展为肝硬化甚至肝癌。对感染者的危害远大于乙肝病毒感染。由于丙型肝炎病毒目前尚未能培养成功。而且丙肝病毒还存在着高突变率，尤其是包膜区的多变性，目前已知至少存在6种不同基因型的病毒，各型之间的异源性高达25%30%，给丙肝疫苗的研究带来了重重困难。这也是为什么至今仍未见有丙肝疫苗上市的原因之一。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.3.1 肝炎病毒疫苗肝炎病毒疫苗 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.3 病毒性疾病的疫苗病毒性疾病的疫苗9.1.3.2 艾滋病病毒疫苗艾滋病病毒疫苗HIV模式图艾滋病疫苗的研究主要是通过克隆病毒外艾滋病疫苗的研究主要是通过克隆病毒外膜蛋白和膜蛋白和gp160及及gp120基因后在不同的表基因后在不同的表达系统中表达，以获得基因工程疫苗达系统中表达，以获得基因工程疫苗。目。目前该疫苗大多处于临床试验阶段前该疫苗大多处于临床试验阶段,尚未大规尚未大规模使用。模使用。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.3.2 艾滋病病毒疫苗艾滋病病毒疫苗电子显微镜下的HIV 小儿麻痹症疫苗 小儿麻痹症是由脊髓灰质炎病毒引起的中枢神经系统疾病。通过基因工程方法改变脊髓灰质炎病毒的基因结构，获得弱化了的脊髓灰质炎病毒，用它研制成了小儿麻痹口服疫苗。通过基因工程方法制得脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3作为注射疫苗。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.3 病毒性疾病的疫苗病毒性疾病的疫苗9.1.3.3 9.1.3.3 其他病毒性疾病疫苗其他病毒性疾病疫苗其他病毒性疾病疫苗其他病毒性疾病疫苗1000010001001010Reported cases195019551960196519701975Killed(Salk)vaccineTotal casesSweden and Finland 流感疫苗 流感病毒极易发生变异,能逃避抗体的作用。所以长期未有有效的疫苗面市。1993年Ulmer首先将流感病毒高度保守的NP基因插入质粒中制成核酸疫苗免疫小鼠，并取得了令人满意的效果。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.3.3 其他病毒性疾病的疫苗其他病毒性疾病的疫苗流感病毒 狂犬病疫苗 狂犬病疫苗是继天花之后，人类最早应用的第二个疫苗。狂犬病疫苗经历了脑组织细胞培养、基因工程、合成肽及抗独特型抗体疫苗等几个发展阶段。最近又发展了动物实验效果较好且更为安全的金丝雀痘病毒活疫苗。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.3.3 其他病毒性疾病的疫苗其他病毒性疾病的疫苗狂犬病毒 疱疹病毒疫苗 EB（Epstein-Barr）病毒是5种疱疹病毒之一。在非洲，这种病毒主要侵染B淋巴细胞引起波克梯氏淋巴瘤，在地中海地区及包括我国在内的亚洲地区则主要浸染口、咽上皮细胞引起鼻咽癌。现在已成功地构建EB病毒膜抗原的重组痘苗病毒，以及中国仓鼠表达系统，并完成了成人、儿童和幼儿的免疫观察。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.3.3 其他病毒性疾病的疫苗其他病毒性疾病的疫苗Smallpox天花 Mummies China/India Crusaders W Europe:fatality rate 25%History changed:CortesLouis XIVSmallpox Variolation1%v.25%mortalityLife-long immunity:No drift or shift(proof reading)UK:1700s China 1950Pakistan/Afghanistan/Ethiopia 1970SmallpoxVaccination Jenner 1796:Cowpox/Swinepox 1800s Compulsory childhood vaccination 1930s Last natural UK case 1940s last natural US case 1958 WHO program October 1977:Last case(Somalia)将多种病原体的相关抗原融合在一起，产将多种病原体的相关抗原融合在一起，产生一种带有多种病原体抗原的融合蛋白。生一种带有多种病原体抗原的融合蛋白。将多种病原体相关抗原克隆在同一个载体将多种病原体相关抗原克隆在同一个载体（多价表达载体）上。（多价表达载体）上。美国于美国于1986年年10月首先研制了一种含有疱月首先研制了一种含有疱疹病毒、肝炎病毒和流感病毒的疫苗。疹病毒、肝炎病毒和流感病毒的疫苗。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.3 病毒性疾病的疫苗病毒性疾病的疫苗9.1.3.4 9.1.3.4 基因工程多价疫苗基因工程多价疫苗基因工程多价疫苗基因工程多价疫苗霍乱疫苗接种已有100多年的历史，传统疫苗是采用肌肉注射的灭活或减毒霍乱弧菌菌体苗。效果不佳，副作用大，已被WHO宣布不再推荐此疫苗的应用。9.1.4.1 9.1.4.1 霍乱弧菌疫苗霍乱弧菌疫苗霍乱弧菌疫苗霍乱弧菌疫苗 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1 生物技术与疫苗生物技术与疫苗9.1.4 细菌性疾病的疫苗细菌性疾病的疫苗根据霍乱弧菌的致病机理，科学家们利用基因工程技术研制了重组B亚单位疫苗，是已被WHO推荐应用的疫苗。我国军事医学科学院生物工程研究所经过十多年的研究研制出了国家一类新药rBS-WC口服霍乱疫苗，并已上市。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.4.1 霍乱弧菌疫苗霍乱弧菌疫苗霍乱弧菌疫苗霍乱弧菌疫苗 IdentificationVibrios are highly motile,gram-negative,curved or comma-shaped rods with a single polar flagellum,whose natural habitat is usually salt or fresh water.Caused by miasmaMisguided NotionsPrevented by alcoholCould be spread by contact with patient or patients clothesMisguided NotionsV.Cholerae Afflicted Areas(2000)Transmission Contaminated food or waterInadequate sewage treatmentLack of water treatmentImproperly cooked shellfish Transmission by casual contact unlikelyEpidemicsFecal-oral transmissionFeces of infected person contaminates water supplyResulting diarrhea makes it easy for bacteria to spread in unsanitary conditionsSymptoms Occur 2-3 days after consumption of contaminated food/water Usually mild,or no symptoms at all 75%asymptomatic 20%mild disease 2-5%severe Vomiting Cramps Watery diarrhea(1L/hour)Without treatment,death in 18 hours-several daysVaccinesNeed localized mucosal immune responseOral VaccineNot recommendedTravelers have very low risk of contracting disease:1-2 cases per million international tripsNot cost-effective to administer vaccines in endemic regionsBrief and incomplete immunityTwo types approved for humans:Killed whole-cellLive-attenuated Vaccines:Killed Whole-cell VaccinesProvides antigens to evoke protective antitoxic and antibacterial immunityContains:1 x 1011 heat inactivated bacteriaMixture of V.cholerae O1 El Tor and classical strains1 mg of B subunit of cholera toxin1976年起利用犰狳研制麻风疫苗。美国Young和Whitehead生物医学研究所和麻省理工学院生物学系等单位合作，将麻风杆菌的DNA片段重组到大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因上，将这种融合基因再重组到gt11载体中，由此获得了-半乳糖苷酶和麻风杆菌基因编码的蛋白质的融合蛋白。Bloom等人则将麻风杆菌的基因克隆到活的卡介苗中制备成多价疫苗。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.4 细菌性疾病疫苗细菌性疾病疫苗细菌性疾病疫苗细菌性疾病疫苗 9.1.4.2 9.1.4.2 麻风杆菌疫苗麻风杆菌疫苗麻风杆菌疫苗麻风杆菌疫苗Lepromatous vs.Tuberculoid LeprosyLepromatous Leprosy(Early/Late Stages)Lepromatous Leprosy Pre-and Post-Treatment幽门螺杆菌的灭活全细胞或经超声波破碎后的无细胞提取物均具有一定的免疫原性。1995年Lee等人报道用HP的尿素酶及大肠杆菌不耐热肠毒素为佐剂免疫小鼠，可产生保护性抗体。9.1.4.4 9.1.4.4 幽门螺杆菌疫苗幽门螺杆菌疫苗幽门螺杆菌疫苗幽门螺杆菌疫苗 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.4 细菌性疾病疫苗细菌性疾病疫苗细菌性疾病疫苗细菌性疾病疫苗 目前疟原虫的基因工程疫苗有抗子孢子疫苗，如CSP蛋白质；抗裂殖子疫苗；抗配子母细胞疫苗等。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1 生物技术与疫苗生物技术与疫苗9.1.5 寄生虫病疫苗寄生虫病疫苗9.1.5.1 9.1.5.1 疟原虫疫苗疟原虫疫苗疟原虫疫苗疟原虫疫苗9.1.5.2 血吸虫疫苗 血吸虫基因工程疫苗主要有两大类：一类是虫体蛋白质，如28 kDa蛋白和25kDa蛋白的基因工程疫苗就具有良好的抗原性；另一类是酶性抗原，如谷胱甘肽S-巯基转移酶（GST）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、磷酸葡萄糖同分异构酶（TPI）等候选抗原。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.5 寄生虫病疫苗寄生虫病疫苗DNA疫苗是利用克隆于载体上的抗原基因直接注射机体（包括皮下、皮内或肌肉等）、口服、鼻内滴注、鼻腔喷雾及阴道接种等方式，被细胞摄取并在细胞内表达相应的抗原，通过不同途径诱导机体的特异免疫应答。DNA疫苗的最大优点易于制备、便于保存、基因在细胞的持续表达可达到持续免疫的效果并且易于制成多联多价疫苗。缺点是DNA是否会整合到染色体上而引起严重的后果，是否会引起免疫病理作用，如诱发自身抗核抗体，是否会产生免疫耐受等问题仍有待研究与观察。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1 生物技术与疫苗生物技术与疫苗9.1.6 DNA9.1.6 DNA疫苗疫苗疫苗疫苗9.1.7.1 精子避孕疫苗 主要有乳酸脱氢酶C-4、SP-10、顶体蛋白、FA-1、AH-20和PH-20等几种。同时，利用基因工程技术已成功地克隆了多个蛋白质基因。头尾线粒体 顶体（顶体蛋白）鞭毛核 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1 生物技术与疫苗生物技术与疫苗9.1.7 9.1.7 避孕疫苗避孕疫苗避孕疫苗避孕疫苗9.1.7.2 激素类避孕疫苗 精子和卵子的产生过程、受精过程以及妊娠过程需要多种激素的参与。人们设想以这些激素作为抗原,免疫男性或女性以产生相应的中和抗体，降低机体内相应的激素水平使得精子或卵子不能产生或不能受精或不能怀孕，同样可以达到避孕的目的。目前进入临床试验的已有人绒毛膜促性腺激素（HCG）、促性腺激素释放激素（GnRH）和绵羊促卵泡激素（oFSH）等。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.7 避孕疫苗避孕疫苗所谓治疗性疫苗是指有别于传统的对传染病有预防作用的疫苗，而是指具有积极治疗意义的一类新型疫苗。预防性疫苗主要针对健康的人群，目的是预防，所以其普遍性、安全性和有效性是非常重要的，因此靶抗原主要以病原体或其自身的组成成分为主；而治疗性疫苗则是针对少数感染或患病个体，目的是治疗，因此它注重的是个体的病理学特殊性，针对性较强，靶位的选择趋于特殊性。9.1.8 9.1.8 治疗性疫苗治疗性疫苗治疗性疫苗治疗性疫苗 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1 生物技术与疫苗生物技术与疫苗非特异性疫苗是指具有增强肌体免疫系统的活性的疫苗。如病毒性疾病（如丙型肝炎、乙型肝炎、艾滋病等）的治疗性疫苗以及肿瘤疫苗。特异性疫苗则是指用于治疗某一特定疾病的疫苗。如自身免疫性疾病疫苗，如多角性硬化病、系统性红斑狼疮等；心血管疾病疫苗，如动脉粥样硬化和高血压；认知性疾病，如朊病毒疾病、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病等。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.1.8 治疗性疫苗治疗性疫苗ELISAELISA：酶联免疫吸附检测技术：酶联免疫吸附检测技术(e enzyme nzyme l linked inked i immunommunos sorbent orbent a assay)ssay)9.2.1.1 ELISA9.2.1.1 ELISA技术的原理技术的原理技术的原理技术的原理 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.1 ELISA技术与单克隆抗体技术与单克隆抗体9.2 生物技术与疾病诊断生物技术与疾病诊断测定抗体的测定抗体的 测定抗原的测定抗原的间接间接ELISA法法 双抗体夹心法双抗体夹心法底物底物显色产物显色产物酶酶Ab Ab Ag9.2.1.2 9.2.1.2 常用常用常用常用ELISA ELISA 诊断技术诊断技术诊断技术诊断技术 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.1 ELISA技术与单克隆抗体技术与单克隆抗体 ELISA检验必须首先制备大量的检验必须首先制备大量的抗原抗原 传统的抗原制备方法本身存在很大的危险，传统的抗原制备方法本身存在很大的危险，因为制造抗原时，要大量培养病原体，如果这些因为制造抗原时，要大量培养病原体，如果这些病原体逸出，将会造成很大危害；其次，产品的病原体逸出，将会造成很大危害；其次，产品的质量难以控制，难以标准化，从而导致各批次产质量难以控制，难以标准化，从而导致各批次产品质量的差异；再次，生产费用高，特别是那些品质量的差异；再次，生产费用高，特别是那些体外不能培养的病原体更是如此。体外不能培养的病原体更是如此。基因工程抗原可以克服上述的不足。基因工程抗原可以克服上述的不足。9.2.1.3 9.2.1.3 基因工程抗原基因工程抗原基因工程抗原基因工程抗原 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.1 ELISA技术与单克隆抗体技术与单克隆抗体 多克隆抗体 由于一个抗原往往会有多个抗原决定簇，由于一个抗原往往会有多个抗原决定簇，直接免疫动物后，从被免疫的动物的血清直接免疫动物后，从被免疫的动物的血清制备的抗体是一种含有可分别与多个抗原制备的抗体是一种含有可分别与多个抗原决定簇结合的多种抗体的混合物，这种混决定簇结合的多种抗体的混合物，这种混合物称之为多克隆抗体。合物称之为多克隆抗体。9.2.1.4 多克隆抗体与单克隆抗体多克隆抗体与单克隆抗体 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.1 ELISA技术与单克隆抗体技术与单克隆抗体 单克隆抗体 利用细胞融合技术，在体外大量培养融合细胞，由融合细胞产生大量的抗体。单克隆抗体只识别某一特定的抗原决定簇，所以它具有特异性强、成分均一、灵敏度高、产量大、容易标准化生产等优点而明显优于多克隆抗体。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.1.4 多克隆抗体与单克隆抗体多克隆抗体与单克隆抗体多克隆抗体与单克隆抗体多克隆抗体与单克隆抗体 1978年Kan和Dozy首先应用羊水细胞DNA限制性片段长度多态性（RFLP）做镰状细胞贫血症的产前诊断，从而开创了DNA诊断的新技术。20多年来，DNA诊断技术取得了飞速的发展，建立了多种多样的检测方法，这些检测方法可以用于遗传性疾病、肿瘤、传染性疾病等多种疾病的诊断。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2 生物技术与疾病诊断生物技术与疾病诊断9.2.2 DNA诊断技术诊断技术 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2 DNA诊断技术诊断技术9.2.2.1 DNA探针杂交技术探针杂交技术 PCR:polymerase chain reaction，即聚合酶链式反应技术是一项体外扩增特异DNA片段的技术。特点：灵敏度极高，可以检测极微量的病原体。但如果操作不当很容易产生假阳性反应。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2 DNA诊断技术诊断技术9.2.2.2 PCR9.2.2.2 PCR技术技术技术技术 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2.2 PCR技术技术 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2.2 PCR技术技术 利用利用PCR诊断遗传病诊断遗传病遗传病的诊断包括遗传病的诊断包括：临症诊断（临症诊断（symptomatic diagnosissymptomatic diagnosis）：）：是指遗传病出是指遗传病出现临床症状后所做的诊断。现临床症状后所做的诊断。症状前诊断（症状前诊断（presymptomatic diagnosispresymptomatic diagnosis）：）：是指临床是指临床症状出现前所做的诊断。症状出现前所做的诊断。产前诊断：产前诊断：胎儿出生前所做的诊断。由于目前大多数遗胎儿出生前所做的诊断。由于目前大多数遗传病无有效的治疗方法，因此产前诊断对于降低遗传病传病无有效的治疗方法，因此产前诊断对于降低遗传病的发病率，提高人口素质具有重要的意义。的发病率，提高人口素质具有重要的意义。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2.2 PCR技术技术 夫妇之一有染色体畸变。夫妇之一有染色体畸变。35岁以上的高龄产妇。岁以上的高龄产妇。夫妇之一有开放性神经管畸形。夫妇之一有开放性神经管畸形。夫妇之一有先天性代谢缺陷。夫妇之一有先天性代谢缺陷。X-连锁遗传病基因携带者孕妇。连锁遗传病基因携带者孕妇。有原因不明的习惯性流产的孕妇。有原因不明的习惯性流产的孕妇。羊水过多的孕妇。羊水过多的孕妇。夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇。夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇。具有遗传病家族史，又系近亲结婚的孕妇。具有遗传病家族史，又系近亲结婚的孕妇。需要进行产前诊断的对象需要进行产前诊断的对象需要进行产前诊断的对象需要进行产前诊断的对象 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2.2 PCR技术技术 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2.2 PCR技术技术 可利用可利用PCR技术诊断的部分传染因子技术诊断的部分传染因子 病毒 细菌 寄生虫 单纯性疱疹病毒 大肠杆菌 衣原体 肝炎病毒 沙门氏菌 锥虫 巨细胞病毒 耶尔森氏菌 丝虫 腺病毒 分支杆菌 疟原虫 风疹病毒 弯曲菌 血吸虫 Epstein-Barr病毒 军团菌 利什曼原虫 轮状病毒 博代氏杆菌 旋毛虫 乳头状瘤病毒 弧菌 小泰氏梨浆虫 人免疫缺陷病毒 链球菌 弓形虫 细小病毒 葡萄球菌 鼻病毒 淋病奈瑟氏菌 立克次氏体 支原菌 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2.2 PCR技术技术利利用用PCR诊断传染病诊断传染病 限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP）是指由于碱）是指由于碱基的改变导致基的改变导致DNA上的某一限制性内切核酸酶水上的某一限制性内切核酸酶水解位点增加或减少。当这种解位点增加或减少。当这种DNA用内切酶水解时，用内切酶水解时，产生的产生的DNA片段数将相应的增加或减少，并且其片段数将相应的增加或减少，并且其DNA片段的分子质量也发生相应的改变，这种片段的分子质量也发生相应的改变，这种DNA片段的变化就称为限制性片段长度多态性。片段的变化就称为限制性片段长度多态性。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2 DNA诊断技术诊断技术9.2.2.3 PCR-RFLP9.2.2.3 PCR-RFLP技术技术技术技术 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2.3 PCRRFLP技术技术RFLP：restriction fragment length poly-morphism,限制性片段长度多态性。许多遗传性疾病就是由于许多遗传性疾病就是由于DNA上碱基的上碱基的改变引起的。如果这种改变正好增加或减改变引起的。如果这种改变正好增加或减少了少了DNA限制性内切核酸酶的水解位点限制性内切核酸酶的水解位点,那那么就可以用么就可以用PCR技术先扩增包括这一突变技术先扩增包括这一突变位置在内的位置在内的DNA片段，获得大量的片段，获得大量的DNA片片段后通过段后通过RFLP方法进行分析。方法进行分析。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2.3 PCRRFLP技术技术 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2.3 PCRRFLP技术技术ASO称为等位基因寡核苷酸。称为等位基因寡核苷酸。PCR-ASO的的检测方法是将待测的样品先经检测方法是将待测的样品先经PCR扩增获得扩增获得大量的待分析的大量的待分析的DNA片段，然后将这些片段片段，然后将这些片段分别点样在固相支持膜（如尼龙膜）上。另分别点样在固相支持膜（如尼龙膜）上。另一方面，人工合成包括突变热点在内的一方面，人工合成包括突变热点在内的1730个核苷酸的正常的和突变的寡核苷酸，并个核苷酸的正常的和突变的寡核苷酸，并分别进行放射性同位素标记成为寡核苷酸探分别进行放射性同位素标记成为寡核苷酸探针。利用这两种探针分别与膜上的针。利用这两种探针分别与膜上的PCR产物产物进行杂交。进行杂交。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2 DNA诊断技术诊断技术9.2.2.4 9.2.2.4 PCR-ASOPCR-ASO技术技术技术技术 目前发现的遗传病中，许多疾病并不是目前发现的遗传病中，许多疾病并不是基因的缺失或与限制性内切核酸酶水解位基因的缺失或与限制性内切核酸酶水解位点有关联的点突变。绝大部分只是一些单点有关联的点突变。绝大部分只是一些单纯的碱基突变，每一种遗传性疾病都有一纯的碱基突变，每一种遗传性疾病都有一些经常发生突变的位点，称为突变的热点。些经常发生突变的位点，称为突变的热点。生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2.4 PCRASO技术技术 该方法是该方法是PCR技术和技术和ELISA技术的技术的结合，所以它是一种两级放大系统，即结合，所以它是一种两级放大系统，即PCR放大和放大和ELISA放大，故而它的灵敏放大，故而它的灵敏度更高。同时这种方法避免了度更高。同时这种方法避免了PCR产物产物分析时的电泳及染色过程，所以更为快分析时的电泳及染色过程，所以更为快速简便。速简便。9.2.2.5 9.2.2.5 PCR-ELISAPCR-ELISA技术技术技术技术 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2 DNA诊断技术诊断技术 该方法称为聚合酶链反应该方法称为聚合酶链反应-DNA单链单链构型多态性，原理是利用正常的和突变构型多态性，原理是利用正常的和突变的的DNA单链在三维空间构型上的差异，单链在三维空间构型上的差异，这种差异在电泳时将会有不同的电泳格这种差异在电泳时将会有不同的电泳格局。局。9.2.2.6 PCR-SSCP9.2.2.6 PCR-SSCP技术技术技术技术 生物技术与人类健康生物技术与人类健康9.2.2 DNA诊断技术诊断技术 该方法称为聚合酶链反应该方法称为聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳技变性梯度凝胶电泳技术，是将正常基因和突变基因分别进行术，是将正常基因和突变基因分别进行PCR扩增，扩增，然后将扩增后的两种然后将扩增后的两种PCR产物混合后变性再复性。产物混合后变性再复性。此时，可形成两种同源双链此时，可形成两种同源双链DNA，即正常的双链，即正常的双链DNA和突变的双链和突变的双链DNA，及两种异源双链，及两种异源双链DNA，即，即正反两种由正常单链正反两种由正常单链DNA和突变单链和突变单链DNA形成的双形成的双链链DNA。将此复性后的混合物在变性剂递增梯度凝。将此复性后的混合物在变性剂递增梯度凝胶中电泳。混合物中的异源双