色谱基础知识及原理.pptx

液相色谱基础知识戴安中国戴安中国HPLC销售培训销售培训2005年年关于色谱关于色谱色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器仪器常见的分离方式：常见的分离方式：蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤等等等等色谱是其中一种分离工具是其中一种分离工具色谱法简介色谱法简介色谱法（色谱法（ChromatographyChromatography）溯源溯源俄国科学加俄国科学加19031903年发现色谱的吸附原理，开创年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献于俄文的文献19061906年正式命名（见诸文献）年正式命名（见诸文献）色谱法；色谱法；ChromatographyChromatography3030年代开始广泛研究和应用年代开始广泛研究和应用主要是气相色谱及薄层色谱主要是气相色谱及薄层色谱高效液相色谱法的广泛应用始于高效液相色谱法的广泛应用始于7070年代年代色谱的发明人色谱的发明人俄国科学家：俄国科学家：M.S.TswettM.S.Tswett正式命名正式命名“色谱色谱”的文献的文献色谱分离的机理色谱分离的机理分离是一个物理的过程流动相（流动相（Mobile Phase）固定相（固定相（Stationary Phase）样品（溶解于流动相中的溶质）样品（溶解于流动相中的溶质）什么是液相色谱什么是液相色谱气相色谱：流动相是气相气相色谱：流动相是气相液相色谱：流动相是液相液相色谱：流动相是液相什么是高效液相色谱什么是高效液相色谱High Performance Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography高效液相色谱法，简称：高效液相色谱法，简称：HPLCHPLC是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段：效能分离手段：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器及高灵敏度的检测器广泛应用于各个领域：广泛应用于各个领域：医药医药 /环保环保 /石化石化 /生命科学生命科学 /食品及农业食品及农业在技术，理论及应用上仍处于发展阶段在技术，理论及应用上仍处于发展阶段HPLC的仪器配置及流程的仪器配置及流程溶剂溶剂溶剂溶剂 色谱泵自动进样器 HPLCHPLC色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱检测器废液数据处理系统HPLC的仪器配置及流程的仪器配置及流程色谱泵色谱泵色谱泵色谱泵自动进样器自动进样器自动进样器自动进样器色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱检测器检测器检测器检测器数据处理系统数据处理系统数据处理系统数据处理系统溶剂溶剂溶剂溶剂色谱图：色谱图：HPLC图形图形结果（结果（Chromatogram）色谱图色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。色谱峰色谱峰保留时间（分）保留时间（分）基线基线峰高峰高峰宽峰宽响应值响应值液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语色谱峰色谱峰 PeakPeak色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线曲线峰底峰底 Peak BasePeak Base峰的起点与终点之间连接的直线峰的起点与终点之间连接的直线峰高峰高 Peak HeightPeak Height峰最大值到峰底的距离峰最大值到峰底的距离峰宽峰宽 Peak WidthPeak Width在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离半（高）峰宽半（高）峰宽 Peak Width at Half HeightPeak Width at Half Height通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离交两点之间的距离液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语峰面积峰面积 Peak AreaPeak Area峰与峰底之间的面积峰与峰底之间的面积,又称响应值又称响应值标准偏差；标准偏差；Standard ErrorStandard Error0.6070.607倍峰高处所对应峰宽的一半倍峰高处所对应峰宽的一半拖尾峰拖尾峰 Tailing PeakTailing Peak后沿较前沿平缓的不对称峰后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰前伸峰 Leading PeakLeading Peak前沿较后沿平缓的不对称峰前沿较后沿平缓的不对称峰鬼峰鬼峰 Ghost PeakGhost Peak并非由试样所产生的峰并非由试样所产生的峰；亦称假峰亦称假峰液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语基线基线 BaselineBaseline在正常操作条件下在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的仅由流动相所产生的响应信号的曲线曲线基线飘移基线飘移 Baseline DriftBaseline Drift基线随时间定向的缓慢变化基线随时间定向的缓慢变化基线噪声；基线噪声；N N Baseline NoiseBaseline Noise由各种因素所引起的基线波动由各种因素所引起的基线波动谱带扩展谱带扩展 Band BroadeningBand Broadening由于纵向扩散由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象内移动过程中谱带宽度增加的现象液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语死时间，死时间，t t0 0 Dead timeDead time不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间的时间保留时间，保留时间，t tR R Retention timeRetention time组分从进样到出现峰最大值所需的时间组分从进样到出现峰最大值所需的时间死体积死体积，V V0 0 Dead volumeDead volume不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积的流动相体积保留体积，保留体积，V VR R Retention volumeRetention volume组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积液相色谱应用：制备型液相色谱液相色谱应用：制备型液相色谱分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用 对分离及纯化的要求对分离及纯化的要求化合物的稳定性化合物的稳定性样品的复杂性样品的复杂性制备量的要求制备量的要求纯度的要求，及纯度的鉴定纯度的要求，及纯度的鉴定方法的安全性方法的安全性液相色谱应用：分析型液相色谱液相色谱应用：分析型液相色谱定量分析主要基于与标准品的比较定量分析主要基于与标准品的比较是其最大应用领域是其最大应用领域定性分析；不是色谱的强项定性分析；不是色谱的强项基于样品的保留时间比较基于样品的保留时间比较借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器对定量及定性分析的要求对定量及定性分析的要求灵敏度、精度及准确度的要求灵敏度、精度及准确度的要求样品量的要求；复杂样品的分析能力样品量的要求；复杂样品的分析能力容易使用容易使用液相色谱原理液相色谱原理 基本概念及方法开发基本概念及方法开发液相色谱实验所需的基本参数液相色谱实验所需的基本参数流动相：种类及配比，等度或梯度流动相：种类及配比，等度或梯度固定相：色谱柱类型及内径、长短固定相：色谱柱类型及内径、长短流动相输送系统参数：流速流动相输送系统参数：流速检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等温度控制温度控制进样量进样量以上参数即构成一个具体的以上参数即构成一个具体的HPLCHPLC方法；亦称色方法；亦称色谱条件谱条件评价液相色谱方法的标准评价液相色谱方法的标准问题：什么样的分离结果是好的？分离度？什么是色谱的分离度什么是色谱的分离度分离度的公式：R：分离程度的量度影响分离度的因素：影响分离度的因素：K、及及N分离度方程：分离度方程：K K 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱间作用的强弱 是分离因子，描述两个被分离组份分离的好是分离因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素坏程度，是化学因素 N N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度若若 N 增加增加 2倍倍 或或 3倍倍,R会如何变化会如何变化?分离度方程解析：柱效项分离度方程解析：柱效项N 理论塔板数：分离效率的量度理论塔板数：分离效率的量度PW=.5PW=2色谱柱的柱效色谱柱的柱效 N N理论塔板数计算公式：Ws 方法Wtan16切线法Wh5.54半峰高W3s9 3sW4s16 4sW5s25 5s峰宽与塔板数的关系峰宽与塔板数的关系理论塔板数理论塔板数峰宽（峰宽（L）k 2，Vo 1000 L塔板数与流速的关系塔板数与流速的关系流速（流速（cm/min）塔板数塔板数 103 分离度与分离度与 N 的关系的关系分离度方程解析：分离因子项分离度方程解析：分离因子项 若若 =1.1 or 1.4，R 会如何变化？会如何变化？分离因子：峰分离程度的量度分离因子：峰分离程度的量度V1 V2V3 V0时间 0.5 1 2 5分离因子：分离因子：定义：定义：a a=1 =1 时两组分分不开，时两组分分不开，改变改变a a的途径的途径 改变固定相或改变流动相改变固定相或改变流动相 改变温度改变温度 改变样品的本身性质改变样品的本身性质通过改变流动相改变通过改变流动相改变，同样强度的不同溶剂，同样强度的不同溶剂改变色谱柱改变色谱柱改变分离因子改变分离因子 的例子的例子若若 =1,2,10 or 20,R会如何变化会如何变化?分离度方程解析：容量因子项分离度方程解析：容量因子项K 容量因子：保留能力的量度容量因子：保留能力的量度 V0V1 V2V3时间 0.5 1 2 5 k 值值 k 项项 k 对对分离度影响分离度影响 0 0 0 1 1/2 .50 2 2/3 .67 3 3/4 .75 10 10/11 .91 20 20/21 .95 容量因子容量因子 k 与分离度与分离度的关系的关系与 R 的关系容量因子容量因子 k 与峰高的关系与峰高的关系改变改变 k k 值的方法：值的方法：调节流动相的极性、调节流动相的极性、pHpH、离子强度等、离子强度等梯度淋洗梯度淋洗改变容量因子改变容量因子 K 的例子的例子谱图、k k 及及 N N 如何控制分离度如何控制分离度液相色谱原理液相色谱原理 更进一步的探讨更进一步的探讨离子型化合物的分离方式离子型化合物的分离方式多数化合物是离子型的！多数化合物是离子型的！使用离子交换柱：离子交换法使用离子交换柱：离子交换法主要用于主要用于“强强”阴、阳离子阴、阳离子使用反相柱使用反相柱离子抑制色谱法：通过改变流动相的离子抑制色谱法：通过改变流动相的pHpH值，使值，使样品成中性样品成中性离子对色谱法：加入离子对色谱法：加入“对离子对离子”，使样品呈中，使样品呈中性性离子抑制色谱离子抑制色谱离子型化合物在反相色谱柱上不保留离子型化合物在反相色谱柱上不保留改变流动相的改变流动相的pHpH值，抑制样品离子的电离值，抑制样品离子的电离主要适用于弱酸性化合物的分离主要适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的降低流动相的pHpH值，使样品降低离子化值，使样品降低离子化使用硅胶基质使用硅胶基质C C1818填料填料使用条件应在填料基质的范围内使用条件应在填料基质的范围内硅胶柱的硅胶柱的pHpH在在2-82-8（较保险值（较保险值3-73-7）内）内离子抑制色谱实例离子抑制色谱实例而而 在在 乙乙 腈腈/水水 并并 且且pH=7pH=7时时，多多数数组组份份保保留留时时间间很很短短，无无法完全分离。法完全分离。离子抑制色谱的使用范围离子抑制色谱的使用范围下列情况下不能使用离子抑制方法，如果：下列情况下不能使用离子抑制方法，如果：一些酸在一些酸在pHpH低于低于2 2时还保持离子化时还保持离子化一些碱在一些碱在pHpH高于高于7 7时还保持离子化时还保持离子化可以有以下的选择可以有以下的选择离子交换色谱离子交换色谱使用聚合物或其他耐碱性流动相的反相柱，在使用聚合物或其他耐碱性流动相的反相柱，在pHpH高于高于7 7时用离子抑制法时用离子抑制法使用使用“离子对色谱法离子对色谱法”在高在高pH值下用离子抑制值下用离子抑制色谱柱：色谱柱：D18-613(D18-613(聚合物基质聚合物基质)，室温，室温流动相：乙腈流动相：乙腈/0.01M NH/0.01M NH4 4OHOH+0.01M TBA+0.01M TBA流流 速：速：1.0ml/min1.0ml/min检检 测：测：UV-240nmUV-240nm样样 品：巴比妥的衍生物品：巴比妥的衍生物 巴比妥巴比妥 己琐巴比妥己琐巴比妥 甲基苯巴比妥甲基苯巴比妥 速可巴比妥速可巴比妥离子对色谱法离子对色谱法在反相色谱流动相内加入在反相色谱流动相内加入“离子对离子对”试剂试剂与样品中可电离的组份形成与样品中可电离的组份形成“对离子对离子”在反相色谱柱上分离离子型化合物在反相色谱柱上分离离子型化合物离子对试剂的类型：离子对试剂的类型：磷酸季丁铵（磷酸季丁铵（PIC APIC A），适用于弱酸），适用于弱酸烷基磺酸盐（烷基磺酸盐（PIC BPIC B），适用于弱碱），适用于弱碱烷基长度不同，形成对离子的能力不同通常有：B5，B6，B7，B8 后面的数字是碳链的长度磷酸二丁胺（磷酸二丁胺（PIC D4PIC D4），适用于弱碱），适用于弱碱离子对色谱机理离子对色谱机理使用五烷基磺酸盐使用五烷基磺酸盐Packing:Bondapak C18Column:4 mm ID x 30cmSolvent:Methanol/H2O with 0.005M PENTANE Sulfonic Acid&1%HOAc(50/50)Flow Rate:2.0 ml/minDetector:UV,254 nm,0.1 AUFS1.Maleic Acid2.Phenylephrine-HCl 3.Phenylpropanolamine-HCl 4.Naphazoline-HCl 5.Phenacetin6.Pyrilamine Maleate使用六烷基磺酸盐使用六烷基磺酸盐Packing:Bondapak C18Column:4 mm ID x 30cmSolvent:Methanol/Water with 0.005M HEXANE Sulfonic Acid&1%HOAc(50/50)Flow Rate:2.0 ml/minDetector:UV,254 nm,0.1 AUFS1.Maleic Acid2.Phenylephrine-HCl 3.Phenylpropanolamine-HCl 4.Naphazoline-HCl 5.Phenacetin6.Pyrilamine Maleate用离子对、还是用离子抑制方法？用离子对、还是用离子抑制方法？开发液相色谱方法的考虑因素开发液相色谱方法的考虑因素分离度是色谱分离中主要考虑的因素分离度是色谱分离中主要考虑的因素除除分分离离度度之之外外，在在开开发发色色谱谱方方法法时时，以以下下几几个个因因素也都要考虑：素也都要考虑：灵敏度灵敏度载样量载样量分析速度分析速度溶剂损耗溶剂损耗成本成本容易使用容易使用色谱柱寿命色谱柱寿命效率效率基本的基本的HPLC系统系统溶剂 色谱泵色谱泵色谱泵色谱泵自动进样器 HPLC色谱柱检测器检测器检测器检测器废液数据处理系统数据处理系统数据处理系统数据处理系统色谱泵及液相色谱对泵的要求色谱泵及液相色谱对泵的要求稳定平滑并且重现性好的流速稳定平滑并且重现性好的流速可靠且充分的溶剂混合可靠且充分的溶剂混合准确及重现的自动溶剂混合准确及重现的自动溶剂混合准确及重现的梯度形成准确及重现的梯度形成有效的流速范围有效的流速范围制备色谱或微柱、窄柱色谱更为关注制备色谱或微柱、窄柱色谱更为关注滞后体积滞后体积仅仅应用于梯度实验仅仅应用于梯度实验目的：在任何情况下保持最高精度目的：在任何情况下保持最高精度梯度：高压混合梯度：高压混合高压梯度高压梯度使用多台色谱泵，在泵后混合使用多台色谱泵，在泵后混合配置灵活、简单，脱气简单配置灵活、简单，脱气简单易调节梯度的滞后体积易调节梯度的滞后体积梯度：低压混合梯度：低压混合低压梯度低压梯度用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合对脱气要求高对脱气要求高不易调节梯度的滞后体积不易调节梯度的滞后体积如设计不当，梯度的如设计不当，梯度的准确性受影响准确性受影响滞后体积（系统滞后体积（系统体积）设计合理体积）设计合理梯度滞后：系统体积的影响死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)检测器进样器色谱柱色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度注意注意 滞后体积包括进样器、阻尼滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路器、混合器及其管路比例阀检测器进样器ABCD色谱柱色谱柱溶剂输送系统(泵)低压梯度 阻尼器 混合器梯度滞后大小的影响梯度滞后大小的影响滞后体积太大会引起梯度变化的延迟滞后体积太大会引起梯度变化的延迟例如：滞后体积为例如：滞后体积为2.0ml2.0ml，流速，流速1.0ml/min1.0ml/min实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题对微柱色谱影响更大，同上例但流速对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min0.1ml/min实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受滞后体积的不同会使方法转换麻烦滞后体积的不同会使方法转换麻烦滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现滞后体积的变化会导致梯度重现性不好滞后体积的变化会导致梯度重现性不好普通分析型液相色谱的滞后体积为普通分析型液相色谱的滞后体积为24ml24ml滞后体积变化的影响滞后体积变化的影响设计不好的设计不好的HPLCHPLC系统，滞后体积随反压变化系统，滞后体积随反压变化滞后体积随反压变化的后果：滞后体积随反压变化的后果：梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性梯度百分比保留时间梯度曲线好的梯度滞后曲线保留时间梯度百分比不好的梯度滞后曲线固定滞后体积，改善了梯度性能普通的低压梯度系统色谱柱反压变化对梯度实验的影响色谱柱反压变化对梯度实验的影响P680A LPG without pulse damperBack-pressure:60 bar,85 bar and 105 barVariation:2%Acclaim 120,C18,5 m,4.6 x 100 mm;0.5 mL/min;25C;5 L injection volume;UV detection at 256 nm;Eluent(A)Water and(B)Acetonitril;Gradient:30%b to 100%B in 10 min;Methyl-,Ethyl-,Propyl-and Butylparabene,10 mg/L each液相色谱的检测器液相色谱的检测器常规检测器常规检测器示差折光检测器（示差折光检测器（Refractive IndexRefractive Index）紫外紫外/可见光吸收检测器（可见光吸收检测器（UV-VisUV-Vis）荧光检测器（荧光检测器（FluorescenceFluorescence）蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（Evaporative Light Evaporative Light ScatteringScattering）其他检测器（其他检测器（Other DetectorsOther Detectors）高端检测器高端检测器光电二极管矩阵检测器（光电二极管矩阵检测器（Photodiode ArrayPhotodiode Array）质谱检测器（质谱检测器（Mass SpectrometryMass Spectrometry）HPLC检测器应提供的功能检测器应提供的功能对样品有响应并有一个输出信号对样品有响应并有一个输出信号应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系但是：但是：但是：但是：由于受由于受HPLCHPLC系统其他部件的影响会产生响应与系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象浓度之间关系的与线性偏离现象并不是所有的检测器是线性的并不是所有的检测器是线性的受受HPLCHPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可系统其他部件的影响，检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距能与其最佳水平有较大的差距用于用于HPLC的检测器的检测器没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！色谱分离！HPLCHPLC检测器可以分为：检测器可以分为：检测器可以分为：检测器可以分为：溶质性质检测器（溶质性质检测器（Solute property detectorsSolute property detectors）对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型）动相的变化（选择型）整体性质检测器（整体性质检测器（Bulk property detectorsBulk property detectors）不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）化作出响应（通用型）不同种类的检测器的分类不同种类的检测器的分类整体性质整体性质整体性质整体性质示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器电导检测器电导检测器电导检测器电导检测器溶质性质溶质性质溶质性质溶质性质荧光检测器荧光检测器荧光检测器荧光检测器固定波长固定波长可变波长可变波长光电二极管矩阵光电二极管矩阵电化学检测器电化学检测器电化学检测器电化学检测器放射化学检测器放射化学检测器放射化学检测器放射化学检测器氮氮氮氮/硫检测器硫检测器硫检测器硫检测器质谱检测器质谱检测器质谱检测器质谱检测器紫外紫外紫外紫外/可见光检测器可见光检测器可见光检测器可见光检测器理想的理想的HPLC检测器检测器高灵敏度；可忽略的基线噪音高灵敏度；可忽略的基线噪音宽的线性范围宽的线性范围独立于流动相及操作参数的响应独立于流动相及操作参数的响应对压力、温度及流速等变化不敏感对压力、温度及流速等变化不敏感长时间操作的稳定性长时间操作的稳定性低死体积低死体积非破坏性非破坏性选择性选择性灵敏度：信噪比灵敏度：信噪比灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（的比值（S/NS/N）检测限（检测限（LODLOD）：）：S/N=3S/N=3定量限（定量限（LOQLOQ）：）：S/N=10S/N=10好的信噪比有利于：好的信噪比有利于：更好的色谱峰确认更好的色谱峰确认更好的定量更好的定量更好地完成色谱峰纯度更好地完成色谱峰纯度/均一性均一性6:1NS方法开发的过程方法开发的过程Adapted from:Snyder,L.R.;Kirkland,J.J.;Glajch,J.L;Practical HPLC Method Development 2nd Ed.,Wiley-Interscience,New York,1997,p.21.1.得到样品信息，确定分离目标得到样品信息，确定分离目标得到样品信息，确定分离目标得到样品信息，确定分离目标2.2.确定特定确定特定确定特定确定特定HPLCHPLC过程、样品预处理等的需求过程、样品预处理等的需求过程、样品预处理等的需求过程、样品预处理等的需求3.3.选择检测器及其条件选择检测器及其条件选择检测器及其条件选择检测器及其条件4.4.选择选择选择选择HPLCHPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件方法；初步分离；建立最佳分离条件方法；初步分离；建立最佳分离条件方法；初步分离；建立最佳分离条件5.5.优化分离条件优化分离条件优化分离条件优化分离条件6.6.检查特定过程的问题及需要检查特定过程的问题及需要检查特定过程的问题及需要检查特定过程的问题及需要7.7.定量校正定量校正定量校正定量校正8.8.日常使用的确认日常使用的确认日常使用的确认日常使用的确认选择液相色谱的检测器选择液相色谱的检测器要考虑的因素：要考虑的因素：要考虑的因素：要考虑的因素：你要分离的化合物你要分离的化合物/样品的化学特性样品的化学特性化学结构、分子量及紫外光谱等等化学结构、分子量及紫外光谱等等流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）梯度还是等度梯度还是等度灵敏度需求灵敏度需求是否有双检测的需求是否有双检测的需求选择液相色谱的检测器选择液相色谱的检测器通用检测器通用检测器 RI ELSDMS灵敏度mgngpg线性范围104否103流速敏感是否是温度敏感是否否破坏性否是是选择性检测器选择性检测器 ABSFLEC Cond MS灵敏度ngpgfgpgpg线性范围105103106105103流速敏感否否是是是温度敏感否否是是是破坏性否否是否是可供选择的液相色谱检测器可供选择的液相色谱检测器Absorbance(UV/Vis)Absorbance(UV/Vis)Chemiluminescence Chemiluminescence Circular Dichroism(Chiral)Circular Dichroism(Chiral)Conductivity Conductivity ElectrochemicalElectrochemicalEvaporative Light ScatteringEvaporative Light ScatteringFluorescenceFluorescenceLaser Induced FlorescenceLaser Induced FlorescenceLaser Interferometer Laser Interferometer Laser PolarimeterLaser PolarimeterMass Spectrometric(LC/MS)Mass Spectrometric(LC/MS)Nitrogen Specific Detector Nitrogen Specific Detector Nuclear Magnetic Resonance Nuclear Magnetic Resonance Offline MethodsOffline MethodsOptical Rotation DetectorOptical Rotation DetectorPhoto Diode ArrayPhoto Diode ArrayRefractive IndexRefractive IndexRadiochemicalRadiochemicalSulfur Specific Detector Sulfur Specific Detector ViscometryViscometryMulti Angle Light ScatteringMulti Angle Light Scattering示差折光（示差折光（Refractive Index）检测）检测示差折光检测器（示差折光检测器（RIRI）是第一个商品化的液相色）是第一个商品化的液相色谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初）谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初）通常被认为是一种通用检测器通常被认为是一种通用检测器检测溶液中所有被溶解的溶质检测溶液中所有被溶解的溶质 非特异性非特异性任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值与真空中的速度之比值R RS S示差检测器示差检测器 基本原理基本原理检测基于被分析物的折光指数的差异检测基于被分析物的折光指数的差异测量样品流路与参比流路在折光指数上的差别测量样品流路与参比流路在折光指数上的差别当折光指数差异最大时灵敏度也达到最大当折光指数差异最大时灵敏度也达到最大并不测量绝对的折光指数而是测定折光指数的并不测量绝对的折光指数而是测定折光指数的差别（差别（Differential RIDifferential RI）典型的应用领域典型的应用领域没有紫外吸收、荧光的化合物，例如：没有紫外吸收、荧光的化合物，例如：碳水化合物（Carbohydrates）、聚合物（Polymers）脂肪酸（Fatty Acids）及油脂类（Lipids）示差检测器的优、缺点示差检测器的优、缺点优点优点通用检测器通用检测器容易使用；通常来说是比较耐用的检测器容易使用；通常来说是比较耐用的检测器维护成本低维护成本低缺点缺点灵敏度低、选择性差灵敏度低、选择性差对流速、温度及粘度的变化敏感对流速、温度及粘度的变化敏感不能用于梯度方法不能用于梯度方法色谱峰可能是正的，也可能是负的色谱峰可能是正的，也可能是负的示差检测器的优点示差检测器的优点 通用性通用性根据随机统计；任何一对液体都会有大约根据随机统计；任何一对液体都会有大约0.070.07的的折光率差异折光率差异因此；除非正好被分析的样品与溶液的折光指数因此；除非正好被分析的样品与溶液的折光指数完全相同，都会被检测到完全相同，都会被检测到Separation of Lactose-Reduce MilkMV-20-100102030405060708090100110Minutes4.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.510.0 10.5 11.0 11.512.0 12.5葡萄糖乳糖半乳糖示差检测器的缺点示差检测器的缺点 灵敏度灵敏度缺乏灵敏度缺乏灵敏度 和其他检测器相比，和其他检测器相比，RI检测器一般灵敏度较低检测器一般灵敏度较低UV254 nm S/N 15000:1MV-30.00-25.00-20.00-15.00-10.00-5.000.005.0010.0015.00Minutes2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5AU0.000.020.040.060.080.100.120.14Refractive Index S/N 125:1流动相：MeOH/H2O 60:40流速：1.0 mL/min色谱柱：C18色谱柱温：30 C检测温度：35 C样品：Paraben Mixture示差检测器的缺点示差检测器的缺点 不适宜作梯度不适宜作梯度流动相：A=CH3CN/H2O 75:25B=CH3CN流速：1.4 mL/min色谱柱：NH2色谱柱温：30 C检测温度：35 CMV-2600-2400-2200-2000-1800-1600-1400-1200-1000-800-600-400-2000200400Minutes0246810 12 14 16 18 20 22 24 26 28 300%B25%BChromatography Forum:Is RI with a Reverse Phase gradient possible?ByXXXXXXXXX:Ihaveagoodseparationofamulti-substituted,cyclohexanethatfullyresolves12differentoligomers.IcandetectthecomponentsbyMS,butIwouldliketouseastandardLCdetectorinstead.Thereisvirtuallynoadsorptionabove230nmandbelow230nmpicksupsolventinterference.ImconsideringusingRIdetectionandafterwardsubtractingablankrun.IsthereanyhopeofthisworkingorwouldIbewastingmytime?http:/ 对温度敏感对温度敏感流动相 甲醇 0.25mL/minute检测器温度 35C；没有使用柱温箱Temp.(Deg C)18.519.019.520.0MV-1.000.001.002.00Minutes51015202530354045505560657075室温变化RI 基线吸光度（吸光度（Absorbance UV/Vis）检测）检测目前实验室中最流行的选择目前实验室中最流行的选择多数公司约多数公司约75%75%的检测器是吸光度检测器（其的检测器是吸光度检测器（其中中50%50%是多波长，是多波长，25%25%是是PDAPDA）测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失吸光度与样品浓度呈线性关系吸光度与样品浓度呈线性关系在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大吸光度检测器（吸光度检测器（UV/Vis）优点优点这种检测器简单、可靠这种检测器简单、可靠多数人熟悉并喜欢这种技术多数人熟悉并喜欢这种技术可以作梯度实验并且是非破坏性的可以作梯度实验并且是非破坏性的大多数有机化合物有一定程度的吸光度大多数有机化合物有一定程度的吸光度一般来说灵敏度还可以一般来说灵敏度还可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabens at 254 nm吸光度检测器（吸光度检测器（UV/Vis）缺点缺点由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用检测器检测器对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波长检测，或使用折衷的波长使用多波长检测，或使用折衷的波长受流动相组成的影响：受流动相组成的影响：用截止波长以上至少用截止波长以上至少5 510nm10nm作为工作波长作为工作波长缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响背景吸收的影响背景吸收的影响背景吸收降低背景吸收降低了线性范围了线性范围多数流动相有多数流动相有紫外吸收紫外吸收实际浓度浓度理想10吸光度吸光度210背景吸收背景吸收背景吸收背景吸收背景吸收对紫外检测器噪音的影响背景吸收对紫外检测器噪音的影响UV Spectrum of Eluents with 0.1%TFA Against HPLC Grade H2O BlankAU0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.901.001.101.201.301.401.50nm200.00210.00220.00230.00240.00250.00260.00270.00280.00290.00H20 with 0.1%TFA50%ACN with 0.1%TFA溶剂混合的基线噪音溶剂混合的基线噪音色谱条件色谱条件色谱柱：C18,5 m,3.9x150mm at 35 C.流动相：A:0.1%TFA in