囊泡库的循环综述.pptx

囊泡库的循环葛建龙2013-6-24神经递质释放和突触囊泡循环囊泡库及其可塑性突触囊泡以及其和其他对象相互作用的分子结构突触囊泡摄取神经递质胞吐时的膜融合及调控SV2s对钙浓度水平的调节突触蛋白对囊泡库的调控神经递质释放和突触囊泡循环钙诱导的神经递质释放钙内流触发快速的同步释放和慢速的非同步释放花萼状突触：研究在一个动作电位就能触发的同步释放的最好例子花萼的terminal有600个突触连接，而一个动作电位就能触发200个突触连接产生释放钙电流开始于动作电位的峰值之前，并在完全再极化之前结束钙内流导致胞内0.5ms左右的浓度瞬变，使动作电位和囊泡释放之间只有一个短暂的延时（0.05ms-0.5ms），然后钙很快消散，能及时阻止囊泡的继续释放需要多少的钙能导致释放？20M:饱和因此钙高效快速的结合到钙感受蛋白是很有必要的依赖钙的释放的假说Bollmann：一个动作电位产生一个大致的钙离子瞬变持续时间的高斯分布，瞬变的平均持续时间为0.4ms，平均每一个待释放囊泡（pool size=800 vesicles）处于9um浓度的钙环境中，并有25%的释放概率现在更多的研究表明：释放与钙离子浓度呈线性关系钙通道如何被组织？EGTA阻断50%释放：大多数囊泡并不连在钙通道上囊泡在活性区随机成簇分布，囊泡离钙通道距离30-300nm不等不同的囊泡不同的释放概率，但不能排除囊泡异质性影响释放概率的可能性钙与钙感受蛋白的结合导致融合孔打开 钙触发的快速释放预示着钙结合到钙感受蛋白仅仅触发融合孔的打开而不是复杂的级联效应 融合孔的开放概率决定于相应细胞膜的张力和构成：高渗和拉伸细胞膜都影响了神经递质的释放突触小泡内吞与循环胞吐之后的内吞能有多块？单个囊泡胞吐（自发放）后的内吞回收值约56ms一个或低频率的多个动作电位导致的约两百或上千囊泡释放后的值约115msAt 20Hz或333Hz的值分别为2.3s和8.3s刺激的频率增加内吞速率显著减慢，但减慢的速度依赖于净的膜面积的增加未回收的囊泡数量决定了内吞的速率，预示着局部膜的张力不仅驱动胞吐，也驱动内吞参与内吞体回收的一些蛋白的介绍 Vti1a：参与反式高尔基体网络和内吞体中的融合反应，但不参与细胞膜的融合 Rab5：招募效应蛋白（例如磷脂酰激酶3，它的阻断导致神经递质释放受损）运输囊泡使其与内吞体融合。网格蛋白介导的内吞体的存在价值？为什么需要高频刺激的诱导？假设1：局部快速循环容量有限，不能维持在高频率刺激下的持续稳定的释放，而内吞体的循环容量大而弥补了速度的不足 假设2：内吞体作为囊泡好坏的分选站囊泡库及其可塑性 循环库：在长刺激的情况下参与胞吐与内吞的所有囊泡，包括可释放囊泡库（RRP）和储备库（RP），RP用来填充可RRP 海马神经元荧光标记实验显示每一个突触的循环库有21-25个囊泡，RRP只有4-8个囊泡 不同的突触中囊泡库的数量和大小不同突触前的可塑性调节递质释放的两个要点：动作电位引导的最大钙浓度在给定钙浓度下的释放概率 钙离子最高浓度依赖于动作电位形状（例如动作电位的持续时间），钙通道打开概率和钙通道打开时的胞外钙浓度 对应钙浓度下的释放概率主要依赖于可释放囊泡数量，以及他们对钙的响能力 例如在重复刺激时可释放囊泡库的减少会 导致短时程抑制研究突触功能的方法研究突触传递可以通过生理学描述和分子生物学鉴定的方法相结合生理学描述现象，分子生物学试图对其解释，因此生理学往往处于发展的最前端。生理学发展可以让我们看到突触的很多现象，但是分子机制往往并不清楚突触前生理的分子机制解释重要的分子需要在生化特征和结构特征上被鉴定，例如蛋白-蛋白的相互作用，细胞的亚定位重要分子的功能需要通过体内扰乱来研究1：过表达2：加入化学药剂来干扰3：遗传修饰，如基因敲除突触囊泡的分子结构以及和它相互作用的成分突触囊泡 囊泡非常小，大概20nm的半径，蛋白与磷脂的构成比例为1:3。包含两类必要的成分：1，转运蛋白，涉及递质的摄取，它又由质子泵和递质转运子组成；2，交易蛋白质组（trafficking proteome），包括内在膜蛋白和周边蛋白等等活性区和突触前膜活性区：活性区由定位于突触前膜的高电子密度的非可溶性物质组成有多个大的蛋白质在活性区形成了极大的单复合体，他们包括：Munc13，RIM，ERC（(ELKS/Rab3-interacting molecule/CAST)），RIM-BP，Piccolo，Bassoon等。RIM（Rab3-interacting molecule）RIM是活性区的中心成分，它直接或间接连接到囊泡膜蛋白，结构包括 1，N端的锌指结构域，和囊泡蛋白Rab3及活性区蛋白Munc13-1相互作用2，一个中心PDZ区域，连接ERC的C端3，两个C端结构域与囊泡蛋白的2种相互作用方式：1，GTP依赖的与Rab3的结合2，钙依赖的与syt1的结合囊泡对神经递质的摄取 神经递质的摄取由质子泵驱动，它是一个大的多蛋白复合体，主要由具有ATP酶活性的外周复合体V1和介导质子移位的内源性膜复合体V0组成 质子泵产生的电化学梯度驱动所有神经递质的摄取，囊泡摄取由代表4个摄取系统的7个转运子所介导 谷氨酸盐：3种转运子 一元胺：2种转运子 GABA和甘氨酸：1种转运子 乙酰胆碱：1种转运子特定转运子的表达是特定神经递质存在的决定因素，而神经递质可以共表达在神经递质中每个突触中递质释放的数量不一样，一个解释是囊泡大小的差异，另外质子泵和转运子的表达情况也可能影响单个囊泡的递质释放数量胞吐时的膜融合 胞内膜融合涉及到SNARE蛋白形成核心紧密复合体。SNARE蛋白由一个70残基序列的称作SNARE基序的结构所界定。当4类SNARE基序被组成一个平行4螺旋束时核心复合体就形成，可以促使相应的膜靠得更近而融合 4类SNARE 基序：R，Qa，Qb，Qc，当4类基序都存在时稳定的核心复合体才会形成 囊泡与前膜的融合就由3种SNARE蛋白介导：囊泡膜上的Synaptobrevin（R-SNARE 基序）以及前膜上Syntaxin 1（Qa-SNARE 基序）和SNAP-25（Qb，Qc-SNARE 基序）Complexins：一种小神经蛋白，结合到核心复合体上，对突触囊泡的融合并不必须，但可以增强syt1的作用 SNARE复合体的形成由称作SM的蛋白控制，他们与syntaxin-like SNARE蛋白相互作，例如Munc18-1结合到syntaxin的关闭构象上，阻止它的基序参与复合体的形成SM（Sec1/Munc18-like）另外几种突触蛋白调节复合体的组装，如tomosyn能取代synaptobrevin，干扰其行为阻断胞吐。synaptophysin作为囊泡膜蛋白。直接结合到synaptobrevin，而结合了synaptophysin的synaptobrevin又不能参与复合体的形成是否仅凭SNARE基序就可以驱动膜融合？当消除synaptobrevin，引起了胞吐的大部分损伤，但留下10%的完整胞吐，预示着还有别的蛋白参与，SNAP-25KO也是如此 消除Munc18-1可以完全阻断胞吐，而消除synaptobrevin不会完全阻断胞吐 目前数据都支持SNARE是最好的触发融合的因子，但是使膜靠得更近或许要被别的细胞机制所取代 除了synaptobrevin，囊泡还存在具有Qb基序的SNARE蛋白Vtila，它在内吞体和高尔基体的融合反应中起作用，不需要与synaptobrevin作用，说明复合体的形成并不是都一定要SNARE基序介导钙结合到synaptotagmin（Syt）触发的融合 快速的胞吐涉及到钙结合到钙感受蛋白上，Syt1和Syt2是作为钙的感受蛋白的囊泡蛋白synaptotagmin（Syt）Syt由一个短的胞内氮端序列，一个单次跨膜区，一个短的连接区和两个C2区（the C2A and C2B domains）组成。Syt1和Syt2有高度相似的序列，但他们与钙的结合能力不同，相差了2倍。Syt1对于快速胞吐是必须的 Syt1KO mice产生一个致命表型，该表型包含了钙激发的快速胞吐的消失 C2A的突变改变了Syt1与快速胞吐的钙结合力 Syt1的C2A，C2B可以分别结合3,2个钙，他们在平时与钙的结合力差，但是当C2结构域结合到磷脂时与钙的结合力会攀升Syt1的活动机制 Syt1能够部分钙依赖性的与SNARE结合，是否钙依赖的Syt1与SNARE的结合对于钙触发的胞吐是必须的？Sr2+能够取代钙触发胞吐，但它无法使SNARE与Syt1结合，因此，即使SNARE与Syt1不结合，细胞也会发生胞吐 非依赖钙的Syt1与SNARE的结合的作用：1，在融合孔打开之前，SNARE复合体组装之后能使Syt1与SNARE复合体靠得更近2，招募更多的囊泡到RRPSNARE，Syt，complexin的囊泡胞吐模型 SNARE复合体的形成促使囊泡与前膜形成一个不稳定的融合态，可通过complexin结合到SNARE复合体而变得稳定，Syt1可在缺乏钙的情况下结合到SNARE，但是一旦结合钙，就会迅速结合到磷脂膜上，使融合中间体不稳定，于是打开融合孔 非同步释放的钙感受蛋白 Syt家族中的Syt3,6,7等成员可以作为胞吐慢成分的钙感受蛋白，他们有很强的钙亲和力，可以在低钙浓度下触发非同步释放Rab3对胞吐的调节Rab蛋白形成一个大的GTP结合蛋白家族，它们可以调控细胞内的运输。突触囊泡至少包含3个Rab家族的成员：Rab3，Rab5和Rab11，而Rab3A占了所有Rab蛋白的25%Rab3的循环结合GTPRab3-GTP与囊泡结合囊泡与前膜融合GTP水解成为GDP，Rab3-GDP被GDI从囊泡解离Rab3再次结合GTPRab3-GTP重新结合到囊泡Rab3A KO表型1，海马CA1区域的Rab3A KO表现出短时程可塑性的改变2，CA3区域的KO则剥夺了mossy-fiber LTP，LTP受PKA激活，而Rab3A不是PKA的底物，因此，LTP并不是简单地由Rab3A的磷酸化而被激活从以上Rab3的KO表型表明Rab3在不同区域有不同的功能，而兴奋性突触由此可分为两类，1，可以依赖PKA的LTP，但是还需要Rab3的介导；2，没有LTP，但是依赖Rab3的短程可塑性。Rab3的效应蛋白有2类Rab3的效应蛋白，他们只结合到Rab3-GTP：Rabphilin：使Rab3结合到突触囊泡上，并可结合钙RIM1/2：属于活性区蛋白，没有钙结合位点Rabphilin敲除小鼠没有引起很大的损伤，也没有表现出Rab3A敲除的表现RIM1 KO却引起突触强度很大的下降，在短程可塑性中引起了很大的改变，在CA3区域也没有了LTP，Munc13-1水平下降（Rab3A中Munc13-1不变）Rab3A结合到RIM1可以使囊泡停靠，但是RIM1 KO没有改变停靠囊泡的数量，与Rab3A KO表型一致RIM1调节囊泡释放，通过它的N端与Rab3和Munc13-1连接，通过PDZ区域与ERC连接，通过C端与-liprins及Syt1相连Betz et al.2001,Ohtsuka et al.2002,Schoch et al.2002,Wang et al.2002Rab3与RIM1如何参与mossy fiber-type LTP？LTP的出现需要2个信号的一致：1，GTP依赖的Rab3A结合到RIM12，RIM1通过PKA的磷酸化这个机制也许引起活性区的重构导致了可释放囊泡数量或钙所触发的释放的概率的增加。Munc13-1和Rab3竞争性结合到RIM1的N端，Rab3结合到RIMs就会失活Munc13，可能然后允许Munc13招募更多的RIN到活性区而增加了活性区的面积导致释放增加。SV2s也许调节钙水平SV2s是囊泡的组成部分，包括SV2A，SV2B和SV2C。SV2蛋白有12个跨膜结构域，N端和C端都在胞质中SV2A或SV2B缺陷的细胞没有表现出释放的下降或RRP的减小，若两个亚型都缺乏，则钙依赖的突触传递增加，它可被EGTA逆转，表明缺失SV2引起钙在突触前膜的累积SV2缺陷突触预示着SV2也许是钙的转运者，但是在嗜铬细胞中SV2缺乏却表现出了胞吐的减小。一个可能的假说是囊泡腔内的钙可以稳定嗜铬颗粒结构，钙的减小导致囊泡的不稳定，导致RRP的缺失synapsins对囊泡库的控制synapsin：非常丰富的突触囊泡蛋白，作为一种周边膜蛋白包被在囊泡表面，是cAMP,Ca2+/calmodulin激活酶的底物，确切功能还不十分清楚3种synapsin有类似的N端和中心结构域，但是C端序列不同synapsin1：仅在有钙的条件下结合ATPsynapsin2：无论是否有钙都结合ATPsynapsin3：仅在无钙的条件下结合ATPsynapsin结合到通过N端的结构域可结合到磷脂膜上，但是一旦其被PKA,Ca2+/calmodulin-dependent 蛋白激酶磷酸化就剥夺了synapsin与囊泡的结合synapsin KO表型KOmice分析表明synapsin1和synapsin2对于老鼠生存或囊泡胞吐并不是必须的，它们只是用来保持正常的囊泡数量以及调节短时程可塑性我演讲的主要内容就是突触囊泡蛋白的分子特性以及它们的相互作用能够在多大程度上来解释囊泡循环的生理特征。谢谢人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。