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第一章第一章 蛋白质（酶）、核酸的分离纯化蛋白质（酶）、核酸的分离纯化第三章第三章 层析技术层析技术第二章第二章 离心技术离心技术第四章第四章 电泳技术电泳技术第一章第一章 蛋白质（酶）、核酸的分离纯化蛋白质（酶）、核酸的分离纯化第一节第一节引言引言 一、分离纯化的意义一、分离纯化的意义二、分离纯化的要求二、分离纯化的要求三、分离纯化的一般程序三、分离纯化的一般程序第二节第二节蛋白质（酶）、核酸分离纯化的前处理蛋白质（酶）、核酸分离纯化的前处理 一、材料的选择与预处理一、材料的选择与预处理 二、细胞的破碎二、细胞的破碎 三、细胞器的分离三、细胞器的分离 四、提取四、提取第三节第三节分离纯化分离纯化 一、一、粗提纯粗提纯 二、二、精提纯精提纯 三、三、纯度鉴定纯度鉴定第四节第四节生物大分子的浓缩、干燥及保存生物大分子的浓缩、干燥及保存 第一节第一节引言引言n蛋白质（酶）、核酸存在于一切生物体中，蛋白质（酶）、核酸存在于一切生物体中，是非常重要的生物大分子；是非常重要的生物大分子；n蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能；识别等多种生理功能；n核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指导核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指导各种蛋白质的合成。各种蛋白质的合成。性质性质 方法方法v分子大小分子大小 透析、超滤、差速离心、凝胶过滤透析、超滤、差速离心、凝胶过滤v溶解度溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀v电荷电荷 电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析v吸附性质吸附性质 吸附层析吸附层析v对配体分子对配体分子 的生物亲和力的生物亲和力 亲和层析亲和层析生物大分子的分离纯化的方法很多，主要是根据分子之间特异生物大分子的分离纯化的方法很多，主要是根据分子之间特异性的差异，如分子大小性的差异，如分子大小、溶解度、电荷等建立起来的。、溶解度、电荷等建立起来的。一、分离纯化的意义一、分离纯化的意义从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义；生命现象的本质有重大意义；工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂；工业，需要大量的高活性的酶制剂；（如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等）（如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等）医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病；医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病；基因工程的需要。基因工程的需要。二、分离纯化的要求二、分离纯化的要求1、纯度纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究其一级结构和空间结构的蛋白、一级结构与功为研究其一级结构和空间结构的蛋白、一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。2、活性活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。活性。3、收率收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失，而且提纯步骤越多，损失越大。不少损失，而且提纯步骤越多，损失越大。三、分离纯化的一般程序三、分离纯化的一般程序生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段：生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段：材料的选择和预处理；材料的选择和预处理；破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）；破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）；分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离。分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离。其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。第二节第二节蛋白质（酶）、核酸蛋白质（酶）、核酸分离纯化的前处理分离纯化的前处理一、材料的选择与预处理一、材料的选择与预处理n选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。虑上述问题，只要能达到实验目的即可。n实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理，另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理，若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。二、细胞的破碎二、细胞的破碎n分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失其生物活性。因此应选持原来的天然状态，不丢失其生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。行组织细胞的破碎。n组织细胞的破碎方法很多，根据不同的实验规模，组织细胞的破碎方法很多，根据不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同件也不同。v一般动物组织和细胞可用一般动物组织和细胞可用电动捣碎机电动捣碎机或或匀浆器匀浆器破碎或用破碎或用超声波超声波处理破碎；处理破碎；v植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起起研磨研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的；的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的；v细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。三、细胞器的分离三、细胞器的分离n细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。还有叶绿体。n如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。n细胞器的分离一般采用细胞器的分离一般采用差速离心法差速离心法，即将破碎后的细胞在，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。分步离心后，即可获得所需组分。四、提取四、提取n组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内含组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和物被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物的分解的天然状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏，这就是破坏，这就是提取提取。提取实际上就是将制备物从复杂的生物体系中转移到提取实际上就是将制备物从复杂的生物体系中转移到特定的人工液相体系中（通常是水、缓冲液、稀盐溶液特定的人工液相体系中（通常是水、缓冲液、稀盐溶液或有机溶剂）。或有机溶剂）。1、蛋白质（酶）的提取蛋白质（酶）的提取n大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如似生理条件下的缓冲液，如20-50m mol/L的磷酸盐的磷酸盐缓冲液（缓冲液（pH7.0-7.5）或）或0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0）缓冲液作提取液。）缓冲液作提取液。n对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常在提蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。正丁醇等。2、核酸的提取核酸的提取nDNA和和RNA在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。白的形式存在。nDNA的提取的提取：一般是利用：一般是利用DNA-核蛋白（核蛋白（DNP）易溶于易溶于1mol/L NaCl溶液。溶液。nRNA的提取的提取：利用：利用RNA-核蛋白（核蛋白（RNP）易溶于）易溶于0.14mol/LNaCl溶液，先提取得到溶液，先提取得到RNP。提取得到提取得到DNP或或RNP后，再将蛋白质除去即可后，再将蛋白质除去即可得到相应的核酸。得到相应的核酸。n蛋白质的去除可以选择去污剂法或有机溶剂法。蛋白质的去除可以选择去污剂法或有机溶剂法。n去污剂法去污剂法是利用是利用SDS等阴离子去污剂与蛋白质带正电等阴离子去污剂与蛋白质带正电荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液，使浓醋酸钾溶液，使SDS-蛋白质复合物沉淀，并使多余蛋白质复合物沉淀，并使多余的的SDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。n有机溶剂法有机溶剂法是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水相，下层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。相，下层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。最后利用乙醇或异丙醇将核酸沉淀离心收集即可。最后利用乙醇或异丙醇将核酸沉淀离心收集即可。蛋白质的去除蛋白质的去除 第三节第三节 分离纯化分离纯化n从细胞中提取得到的生物大分子往往是不从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这一阶段可分为纯化，这一阶段可分为粗分级分离和细分粗分级分离和细分级分离级分离两步进行。两步进行。一、粗提纯一、粗提纯1.蛋白质的粗提纯蛋白质的粗提纯主要是利用主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开。这些方法的特点是简便，处杂蛋白分开。这些方法的特点是简便，处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。白质，但分辨率低。（1）盐析盐析l向蛋白质溶液中加入大量的中性盐向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（NHNH4 4)2 2SOSO4 4，NaNa2 2SOSO4 4，NaClNaCl，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。l盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白破坏蛋白质分子表面的水化层质分子表面的水化层。l 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质中盐的浓度，可以使一样，因此调节蛋白质中盐的浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：不同的蛋白质分别沉淀。如：血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白(NH(NH4 4)2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度饱和饱和析出析出析出析出分段盐析分段盐析（2）等电点沉淀等电点沉淀n蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液变化而变化。在溶液pH值值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。n不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。（3）有机溶剂法有机溶剂法n与水互溶的极性有机溶剂如与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。n有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个：有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个：v降低水的介电常数降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。了蛋白质分子的聚集沉淀。v是极性有机溶剂是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水与蛋白质争夺水化水，而使蛋，而使蛋白质分子沉淀。白质分子沉淀。n室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。解决变性问题。不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。度的有机溶剂分离不同的蛋白质。2.核酸的粗提纯核酸的粗提纯n从细胞中提取得到的核酸，常混杂有蛋白质及各种从细胞中提取得到的核酸，常混杂有蛋白质及各种大小的核酸同类物等杂质，可采用适当方法进行粗大小的核酸同类物等杂质，可采用适当方法进行粗提纯。提纯。n粗提纯中，进一步将蛋白质除去粗提纯中，进一步将蛋白质除去,可用去污剂或有机可用去污剂或有机溶剂多次反复提取。溶剂多次反复提取。n从从RNA除去混杂的除去混杂的DNA，可用，可用DNAase将将DNA降解降解掉。掉。n从从DNA中除去混杂的中除去混杂的RNA，可用，可用RNAase将将RNA降降解掉。解掉。二、精提纯二、精提纯1.蛋白质精提纯蛋白质精提纯一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率的大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率的柱层析及电泳柱层析及电泳方法。方法。常用的柱层析方法有凝胶过滤、离子交换层析、常用的柱层析方法有凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析。吸附层析、亲和层析。常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳。焦电泳。另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。n核酸样品进行精提纯，一般常用核酸样品进行精提纯，一般常用超离心、电泳、超离心、电泳、柱层析柱层析等方法。等方法。n超离心包括超离心包括速度区带离心、沉降平衡超离心速度区带离心、沉降平衡超离心。n电泳包括电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。前者凝胶孔径小，适合分离前者凝胶孔径小，适合分离1000个核苷酸以下的核个核苷酸以下的核酸分子。后者孔径大，适合分离较大的核酸分子。酸分子。后者孔径大，适合分离较大的核酸分子。n柱层析主要有柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层析、凝胶过滤柱层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱层析羟基磷灰石柱层析。2.核酸核酸精提纯精提纯三、三、纯度鉴定纯度鉴定n生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。的纯度。n蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。、超速离心沉降分析法等。v选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用白质的纯度，必须同时采用2-3种不同的方法种不同的方法才能确定。才能确定。n核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280）等方法。）等方法。v同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种方法才能确定。种方法才能确定。第四节生物大分子的浓缩、干燥及保存第四节生物大分子的浓缩、干燥及保存一、浓缩一、浓缩1.吸收法吸收法2.超滤法超滤法二、干燥二、干燥1.真空干燥真空干燥2.冷冻真空干燥冷冻真空干燥三、样品的保存三、样品的保存1.干态保存干态保存2.液态保存液态保存 离心技术概论离心技术概论 一般制备离心一般制备离心 超离心技术超离心技术第二章第二章 离心技术离心技术台式高、超台式高、超速离心机速离心机0.6-10万万rpm离心机离心机制备性制备性分析性分析性分析性超速离心机分析性超速离心机普通离心机普通离心机冰冻离心机冰冻离心机台式（或台式（或地面式）地面式）普通离心普通离心机机大容量冰大容量冰冻离心机冻离心机小于小于0.6万万rpm高速冰冻高速冰冻离心机离心机0.6-2.5万万超速冰冻超速冰冻离心机离心机2.5-8万或万或更高更高(分析性超速离心主要用于检测大分析性超速离心主要用于检测大分子物质的沉降特征和结构等分子物质的沉降特征和结构等)概述概述一般制备离心一般制备离心v 一一般般制制备备离离心心是是指指在在分分离离、浓浓缩缩、提提纯纯样样品品中中，不不必必制制备备密密度度梯梯度度的的一一次次完完成成的的离离心心操操作作，实实验验室室用用低、高速离心机可应用于此项技术。低、高速离心机可应用于此项技术。台式或地面式普通离心机台式或地面式普通离心机高速冰冻离心机高速冰冻离心机科研人员将采集的脐带血放置到低温科研人员将采集的脐带血放置到低温超速离心机内进行技术处理超速离心机内进行技术处理超速冰冻离心机超速冰冻离心机应用范围：应用范围：病毒及亚细胞组份分离病毒及亚细胞组份分离 蛋白梯度分离蛋白梯度分离 脂蛋白分离脂蛋白分离 RNA梯度沉淀梯度沉淀 质粒质粒DNA提纯提纯 v制备性超速离心主要制备性超速离心主要利用离心机转子高速旋转时所产生利用离心机转子高速旋转时所产生的强大离心力，加快颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降的强大离心力，加快颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数或浮力密度差的物质分开。系数或浮力密度差的物质分开。v沉降系数指单位沉降系数指单位(cm)离心场中颗粒沉降的速度，用离心场中颗粒沉降的速度，用s表表示，其单位是示，其单位是110-13秒，简称秒，简称S，即，即1S110-13秒。秒。v沉沉降降速速度度是是指指在在强强大大离离心心力力作作用用下下，单单位位时时间间内内物物质质运运动的距离。动的距离。v制备超离心的关键是制备超离心的关键是如何根据颗粒和介质的性质以及转如何根据颗粒和介质的性质以及转子的某些参数来子的某些参数来确定确定转速和离心时间转速和离心时间。v颗粒沉降的时间和速度取决于：离心力、颗粒的大小形颗粒沉降的时间和速度取决于：离心力、颗粒的大小形状和密度、沉降介质的密度和粘度。状和密度、沉降介质的密度和粘度。超离心技术超离心技术一、一、原理和计算原理和计算二、二、转子离心管及选择转子离心管及选择三、三、离心技术类型离心技术类型四、四、梯度回收梯度回收一、原理和计算一、原理和计算（一）离心力和相对离心力（一）离心力和相对离心力v当当离离心心机机转转头头以以一一定定的的角角速速度度w（弧弧度度/秒秒）旋旋转转，颗颗粒粒的的旋旋转转半半径径为为r（厘厘米米）时时，任任何何颗颗粒粒均均受受一一个个向向外外的的离离心心力力，此此离离心力为：心力为：F=m2r 式式中中，F通通常常以以地地心心引引力力表表示示，称称为为相相对对离离心心力力（RCF），相相对对离离心心力力指指在在离离心心力力场场中中，作作用用于于颗颗粒粒的的离离心心力力相相当当于于地地球球重重力力的的倍倍数数，单单位位是是重重力力加加速速度度g（980厘厘米米/秒秒2），这这时时RCF可可表示如下：表示如下：RCF=2r/980 v实实际际上上，这这一一关关系系式式常常用用每每分分钟钟转转数数n（或或rpm），以以更更通通用用表达式来表示，由于表达式来表示，由于=2n/60 于是：于是：RCF=42（rpm）2r/3600*980 简化得：简化得：RCF=1.11910-5（rpm）2r v一般低转速时常用一般低转速时常用rpm来表示，高转速离心则以来表示，高转速离心则以g表示。表示。半径半径相对离心力相对离心力转速转速方法：方法：三点一线，三点一线，左对左，左对左，右对右右对右v为了便于为了便于进行转速和进行转速和相对离心力相对离心力之间的换算，之间的换算，人们在式人们在式的基础上制的基础上制作了三者关作了三者关系的列线计系的列线计算图算图RCF=1.11910-5（rpm）2r二、转子离心管及选择二、转子离心管及选择（一）离心管（一）离心管v常见的玻璃离心管质硬且脆，不能承受超离心的压力。常见的玻璃离心管质硬且脆，不能承受超离心的压力。v用于超离心机转子中的离心管分为塑料管及不锈钢管两类。用于超离心机转子中的离心管分为塑料管及不锈钢管两类。v离离心心时时样样品品一一般般应应装装满满离离心心管管，否否则则将将可可能能因因有有气气泡泡而而使使管管的外部受压不均，造成离心管破裂，使转子不平衡产生事故。的外部受压不均，造成离心管破裂，使转子不平衡产生事故。（二）离心管帽（二）离心管帽v超超离离心心机机所所用用离离心心管管一一般般都都附附有有管管帽帽，离离心心时时离离心心管管需需戴戴上上管帽。管帽。（三）转子及选择（三）转子及选择v 主主要要有有角角转转子子、水水平平转转子子、垂垂直直转转子子、区区带带转转子子等等几几种种类型。类型。1、角转子、角转子指离心管腔与转轴成一定倾角的转子，角度越大，沉降越指离心管腔与转轴成一定倾角的转子，角度越大，沉降越结实，分离效果越好，相反，角度越小，颗粒沉降距离短，结实，分离效果越好，相反，角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效果差。颗粒在角转子中沉降时，先沿沉降速度快，但分离效果差。颗粒在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积，称为一侧会出现颗粒沉积，称为“壁效应壁效应”。最适合差速离心，。最适合差速离心，强度大、方便，但加速或减速时，对样品有搅动。强度大、方便，但加速或减速时，对样品有搅动。2、水平转子、水平转子转转子子活活动动管管套套内内的的离离心心管管，旋旋转转时时随随着着转转子子的的转转动动，从从垂垂直直悬悬吊吊上上升升到到水水平平位位置置（约约200800rpm）时时。颗颗粒粒在在水水平平转转子子中中的的沉沉降降是是沿沿管管子子方方向向的的，梯梯度度离离心心中中颗颗粒粒沉沉降降区区带带横横过过离离心心管管，离离心心后后区区带带不不必必重重新新定定位位，但但只只有有处处于于样样品品区区带带中中心心的的颗颗粒粒才才直直接接向向管管底底沉沉降降，其其它它颗颗粒粒则则撞撞向向壁壁的的两两侧侧，产产生生“壁壁效效应应”，但但受受振振动动和和变变速速搅搅乱乱后后对对流流现象小得多。现象小得多。3、垂直转子、垂直转子角角式式转转子子的的特特殊殊形形式式，主主要要用用于于等等密密度度梯梯度度离离心心，这这种种转转子子颗颗粒粒移移动动距距离离短短，比比水水平平式式和和角角式式转转子子节节约约大大量量时时间间，但但速度剧变容易产生对流扰乱。速度剧变容易产生对流扰乱。4、区带转子、区带转子三、离心技术类型三、离心技术类型v 常常用用离离心心技技术术一一般般包包括括差差速速离离心心法法，速速度度区区带带法法和和等等密密度梯度沉降法。度梯度沉降法。（一）差速离心法（一）差速离心法原原理理：采采用用逐逐渐渐增增加加离离心心速速度度或或低低速速和和高高速速交交替替进进行行离离心心，使使沉沉降降速速度度不不同同的的颗颗粒粒在在不不同同的的分分离离速速度度及及不不同同的的离离心心时时间间下分批分离的方法，称为差速离心法。下分批分离的方法，称为差速离心法。当当以以一一定定离离心心力力在在一一定定的的离离心心时时间间内内进进行行离离心心时时，在在离离心心管管底底部部就就会会得得到到最最大大和和最最重重颗颗粒粒的的沉沉淀淀，分分出出的的上上清清液液在在加加大大转转速速下下再再进进行行离离心心，又又得得到到第第二二部部分分较较大大、较较重重颗颗粒粒的的“沉沉淀淀”及及含含小小和和轻轻颗颗粒粒“上上清清液液”，如如此此多多次次离离心心处处理理，即即能能把把液液体体中中的的不不同同颗颗粒粒较较好好分分开开。这这时时所所得得沉沉淀淀是是不不纯纯的的，需经再悬浮和再离心（需经再悬浮和再离心（23次），才能得到较纯颗粒。次），才能得到较纯颗粒。用用于于分分离离不不同同大大小小的的细细胞胞和和细细胞胞器器。在在差差速速离离心心中中细细胞胞器器沉沉降降的的顺顺序序依依次次为为：核核、线线粒粒体体、溶溶酶酶体体与与过过氧氧化化物物酶酶体体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。内质网与高基体、最后为核蛋白体。已破碎的细胞已破碎的细胞 沉淀（细胞核）沉淀（细胞核）上清液上清液 沉淀（细胞膜碎片、沉淀（细胞膜碎片、线粒体、溶酶体）线粒体、溶酶体）上清液上清液 沉淀（核糖核蛋白体）沉淀（核糖核蛋白体）上清液（可溶上清液（可溶性组分）性组分）500 g，10 10 000 g，10 100 000 g，3h（二）速度区带法（二）速度区带法速速度度区区带带主主要要用用于于分分离离密密度度相相近近而而大大小小不不等等的的细细胞胞或或细细胞胞器器。这这种种沉沉降降方方法法所所采采用用的的介介质质密密度度较较低低，介介质质的的最最大大密密度度应应小小于于被分离生物颗粒的最小密度。被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。（三）等密度梯度沉降法（三）等密度梯度沉降法原原理理：等等密密度度梯梯度度沉沉降降（isopycnic sedimentation）适适用用于于分分离离密密度度不不等等的的颗颗粒粒。细细胞胞或或细细胞胞器器在在连连续续梯梯度度的的介介质质中中经经足足够够大大离离心心力力和和是是够够长长时时间间则则沉沉降降或或漂漂浮浮到到与与自自身身密密度度相相等等的的介介质质处处，并并停停留留在在那那里里达达到到平平衡衡，从从而而将将不不同同密密度度的的细细胞胞或细胞器分离。或细胞器分离。等等密密度度梯梯度度离离心心一一般般常常用用CsCl、RuCl、蔗蔗糖糖、甘甘油油等等做做介介质质。介介质质梯梯度度不不需需预预先先制制备备，离离心心时时把把密密度度均均一一的的介介质质液液和和样样品品混混合合后后装装入入离离心心管管，通通过过离离心心形形成成梯梯度度，让让颗颗粒粒在在梯梯度度中进行再分配。中进行再分配。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。四、梯度回收四、梯度回收1、穿刺法、穿刺法 这这是是一一种种简简易易的的手手工工操操作作法法，采采用用针针穿穿刺刺离离心心管管底底部部，使使梯梯度度靠靠重重力力自自由由滴滴出出，然然后后依依次次作作分分布布收收集集，此此法法适适用用于于薄薄壁壁塑塑料料管管，流流出出液液部部分分收收集集于于小小试试管管中中，经经分分析析决决定定取取舍舍或或合并。合并。此此法法对对梯梯度度扰扰动动小小，但但离离心心管管不不能能再再用用，不不适适合合回回收收管管底底有沉淀的梯度，也不使用于不锈钢或厚壁塑料管。有沉淀的梯度，也不使用于不锈钢或厚壁塑料管。2、取代法、取代法 回回收收梯梯度度中中最最常常使使用用的的一一种种方方法法，分分为为向向上上及及向向下下取取代代两两种种。取取代代法法优优点点是是不不破破坏坏离离心心管管，能能用用于于较较粘粘梯梯度度，可可借借光光学学（放放射射性性）系系统统进进行行流流出出液液跟跟踪踪，简简化化分分析析化化验验工工作作。缺缺点点是是开开始始取取代代操操作作时时易易引引起起扰扰乱乱，操操作作需需特特别别小小心，梯度粘度太大时也不合适。心，梯度粘度太大时也不合适。浓浓取取代代液液 稀稀 浓浓通入空气、轻液体通入空气、轻液体收集收集 浓浓 稀稀收集收集3、虹吸法、虹吸法 用用一一根根聚聚乙乙烯烯小小管管插插到到管管底底部部，用用虹虹吸吸法法吸吸出出梯梯度度，它它也也不不损损伤伤离离心心管管，尤尤其其适适用用于于不不锈锈钢钢管管中中物物质质的的分分级级分分离离，但但虹虹吸吸时时易易引引起起分分离离区区带带扰扰乱乱，最好使用专门的装置。最好使用专门的装置。除除取取代代法法和和虹虹吸吸法法外外，有有时时从从管管上上部部直直接接仔仔细细地用注射器或吸管定量移出梯度液，效果也较好。地用注射器或吸管定量移出梯度液，效果也较好。4、切割法、切割法 适适用用于于极极粘粘梯梯度度，就就是是用用离离心心管管切切割割器器将将冻冻结结的的塑塑料料管管切切成成薄薄片片，从从而而将将梯梯度度分分部部收收集集，此此法法仅仅适用于赛璐璐或硝酸纤维素管。适用于赛璐璐或硝酸纤维素管。梯度的分析梯度的分析分分析析梯梯度度中中的的回回收收物物质质常常用用紫紫外外吸吸收收法法、酶酶活活力力测测定定法法、放放射射标记法。标记法。蛋蛋白白质质、核核酸酸或或某某些些含含蛋蛋白白质质、核核酸酸占占优优势势的的细细胞胞器器、病病毒毒可可用用紫紫外外吸吸收收法法测测定定。细细胞胞器器一一般般可可测测定定标标志志酶酶活活性性，通通常常每每一一组组分分至至少少选选二二种种标标志志酶酶，如如一一时时找找不不到到更更好好的的测测定定目目的的物物，也也可可测测光光吸吸收收来来推推断断分分布布的的组组分分，对对于于同同位位素素标标记记物物，最最好好是是测测定定其其放放射射活活性性。此此外外，某某些些情情况况下下也也可可用用免免疫疫法法，电电泳泳法法测测定定物物质质在在梯梯度度中中的的分分布布，亚亚细细胞胞成成分分可可用用电电镜镜或或光光学学显显微微镜镜观观察分析各分部的组分，最后分析结果。察分析各分部的组分，最后分析结果。第三章第三章 层析技术层析技术引言引言层析法的基本原理层析法的基本原理层析法的分类层析法的分类第一节第一节吸附层析技术吸附层析技术第二节第二节分配层析技术分配层析技术第三节第三节凝胶过滤层析技术凝胶过滤层析技术第四节第四节离子交换层析法离子交换层析法第五节第五节亲和层析法亲和层析法第六节第六节高压液相层析（高压液相层析（HPLC）引言引言n层析法也称色谱法，是层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为名为“色谱法色谱法”（Chromatography)。n后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。n1944年出现纸层析。年出现纸层析。n以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。层析法的基本原理层析法的基本原理n层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。到分离的目的。层析法的分类层析法的分类n按两相所处的状态分类：按两相所处的状态分类：流动相有两种状态：流动相有两种状态：*液体作为流动相液体作为流动相*气体作为流动相气体作为流动相固定相也有两种状态：固定相也有两种状态：*固体吸附剂作为固定相固体吸附剂作为固定相*以吸附在固体上的液体作为固定相以吸附在固体上的液体作为固定相按两相所处的状态分为：按两相所处的状态分为：液相层析液相层析液液-固层析固层析液液-液层析液层析气相层析气相层析气气-固层析固层析气气-液层析液层析n按层析过程的机理分类：按层析过程的机理分类：吸附层析吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。的分配系数不同，使之分离。离子交换层析离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。力的不同。凝胶层析凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。分阻滞作用的不同。n按操作形式不同分类：按操作形式不同分类：柱层析柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向：将固定相装于柱内，使样品沿一