激光扫描共聚焦显微镜.pptx

激光扫描共聚焦显微镜在微激光扫描共聚焦显微镜在微生物研究中的应用生物研究中的应用刘盛荣刘盛荣2011-09-09CTC 染色Baclight Live/Dead 染色 Baclight Live/Dead 染色 激光扫描共聚焦显微成像主要内容主要内容1 1、分子荧光的形成、分子荧光的形成2 2、微生物研究中常用的荧光染料、微生物研究中常用的荧光染料3 3、共聚焦显微镜基本原理、共聚焦显微镜基本原理4 4、共聚焦显微镜在微生物研究中的应用、共聚焦显微镜在微生物研究中的应用一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生1.1 1.1 分子荧光产生的条件分子荧光产生的条件1.基态分子受到能量激发，吸收一定能量后，跃迁至激发态,通常为*、n*跃迁2.激发态分子在很短时间内，以电磁辐射的形式释放能量并返回基态，便产生了分子发光（荧光或磷光）1.2 影响荧光的因素影响荧光的因素1.溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加3.溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制二、微生物研究中常用的荧光探针二、微生物研究中常用的荧光探针荧光探针主要基于测定微生物的某一生理进行分类荧光探针主要基于测定微生物的某一生理进行分类1、膜通透性（、膜通透性（membrane integrity）2、代谢活性、代谢活性(metabolic activity)3、膜电位、膜电位(membrane potential)4、酯酶活性、酯酶活性(esterase activity)5、pH 梯度梯度(pH gradient)6、其它、其它微生物研究中主要的荧光探针：微生物研究中主要的荧光探针：1 1、膜通透性、膜通透性(membrane integrity)BacLight Live/Dead(PI/SYTO9)PIPIPIPIPIPISYTO9SYTO9SYTO9PIPIPIPIPIViable cellDamaged cellSYTO9SYTO9链霉菌不同发酵时期：菌丝活性及内部结构Example 1.Staining of Streptomyces sp.with BacLight live/dead L70072、代谢活性代谢活性(metabolic activity)微生物代谢活性分析的荧光探针主要有微生物代谢活性分析的荧光探针主要有：5-Cyano-2.3-ditolyl tetrazolium chloride(CTC)3-(4,5-Dimethyl-2-thiazyl)-2,5-diphenyl-2-tetrazolium bromide(MTT)2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium bromide(INT)红色荧光分子红色荧光分子无色非荧光分子无色非荧光分子Viable cellCTCCTC的微生物细胞还的微生物细胞还原原CTCCTFCTFExample 2:Staining of Streptomyces sp.with CTCCTC 染色CTC 染色3、酯酶活性酯酶活性(esterase activity)工作原理：在活性微生物细胞酯酶作用下，将非荧工作原理：在活性微生物细胞酯酶作用下，将非荧光分子水解，释放出荧光分子并依靠膜的完整性保光分子水解，释放出荧光分子并依靠膜的完整性保留于胞内留于胞内1.Fluorescein diacetate(FDA)2.5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE)荧光染料作为底物由酯酶所水解产产生荧光分子荧光染料作为底物由酯酶所水解产产生荧光分子荧光染料作为底物由酯酶所水解产产生荧光分子荧光染料作为底物由酯酶所水解产产生荧光分子活性微生物细胞活性微生物细胞CFDA-SECFDA-SECFDA-SE活性微生物细胞将其还原为荧光分子并沉淀于微生物细胞内4、膜电位（、膜电位（membrane potential）工作原理：活性微生物细胞可维持细胞的膜电位，工作原理：活性微生物细胞可维持细胞的膜电位，可作为微生物细胞活性的一个评价的生理指标可作为微生物细胞活性的一个评价的生理指标1.带正电荷荧光探针Rhodamine 123(Rh123);DiOC6(3)进入活性细胞2.带负电荷荧光探针Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine oxonol DiBAC4(3)进入死细胞5 5、pHpH荧光探针荧光探针 工作原理：活性细胞可以维持胞内外一个合适的工作原理：活性细胞可以维持胞内外一个合适的pHpH梯度，因此，测定微生物细胞内的梯度，因此，测定微生物细胞内的pHpH可作为细胞可作为细胞生理状态的一个评价标准生理状态的一个评价标准1.5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE)2.Pranine3.BCECFProbePhysiological functionExcitation(nm)Emission(nm)PIMembrane integrity 535617CTCMetabolic activity450580-660DiBAC4(3)Membrane potential493516Rh123Membrane potential507529FDACFDA-SEEsteraseactivity492517SYTO9Membrane permeant488509一些常见荧光染料的激发与发射波长一些常见荧光染料的激发与发射波长三、激光扫描共聚焦显微镜三、激光扫描共聚焦显微镜3.1 3.1 激光扫描共聚焦显微镜的组成激光扫描共聚焦显微镜的组成显微镜光学系统扫描装置激光光源检测系统 整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。3.2 3.2 共聚焦成像原理共聚焦成像原理1.More Color Possibilities2.Less Cross Talk（串色）（串色）3.3 3.3 激光扫描共聚焦显微镜与荧光显微镜比较激光扫描共聚焦显微镜与荧光显微镜比较4.Three-Dimensional Reconstruction of Specimen（三维重构）（三维重构）5.Improved Resolution（更高的分辨率）（更高的分辨率）3.Optical Sectioning of Objects Without Physical Contact（光学切片）（光学切片）Example 3:Comparison of confocal microscopy with fluorescent microscopyFluorescent microscopyFluorescent microscopyConfocal microscopy 显示的是一个光学切面样品的3D-重建激光扫描共聚焦显微镜主要功能激光扫描共聚焦显微镜主要功能1、荧光定性、荧光定性2、荧光定量、荧光定量3、动态荧光监测、动态荧光监测4、断层扫描、断层扫描5、三维重构、三维重构6、共聚焦图像分析、共聚焦图像分析7、荧光显微切割、荧光显微切割四、激光扫描共聚焦显微镜在微生物研四、激光扫描共聚焦显微镜在微生物研究中的应用究中的应用4.1 共聚焦在链霉菌研究中的应用共聚焦在链霉菌研究中的应用1 1、发育分化的研究、发育分化的研究2 2、内部结构及活性研究、内部结构及活性研究3 3、菌体大小测量、菌体大小测量4 4、产物合成的研究、产物合成的研究链霉菌链霉菌Streptomyces antibioticus 的生长分化的生长分化4.2 4.2 共聚焦在真菌研究中的应用共聚焦在真菌研究中的应用1、真菌浸染机制的研究、真菌浸染机制的研究2 2、真菌发育分化的研究、真菌发育分化的研究3 3、真菌生长的研究、真菌生长的研究4 4、真菌活性的研究（、真菌活性的研究（FDA/PIFDA/PI）5 5、真菌的原位研究、真菌的原位研究6 6、真菌细胞融合的研究、真菌细胞融合的研究7 7、一些机制的研究，如胞吞等、一些机制的研究，如胞吞等4.3 4.3 微生物的群落分析微生物的群落分析1 1、环境中微生物的分布及活性的原位分析（光学切片、环境中微生物的分布及活性的原位分析（光学切片功能）功能）2 2、食品污染分析、食品污染分析1 1、荧光原位杂交研究、荧光原位杂交研究（In situ hybridization）2 2、生物膜的研究、生物膜的研究(bioflim)3 3、细菌在植物根部的定植研究、细菌在植物根部的定植研究4 4、细菌的活性分析、细菌的活性分析5 5、抗菌分析、抗菌分析4.4 4.4 共聚焦显微镜的其它相关的研究共聚焦显微镜的其它相关的研究实验：激光扫描共聚焦显微基本步骤实验：激光扫描共聚焦显微基本步骤1 1、选择荧光探针：主要依据实验目的，选择好荧光探、选择荧光探针：主要依据实验目的，选择好荧光探针，目前，荧光探针的种类已经成千上万，人们可针，目前，荧光探针的种类已经成千上万，人们可以根据所研究问题的不同，选择不同的荧光探针以根据所研究问题的不同，选择不同的荧光探针。2 2、样品染色：染色时间长短与染料及微生物有关，短、样品染色：染色时间长短与染料及微生物有关，短的几分钟的几分钟3 3、制片：与普通显微镜类似，制片后尽快观察、制片：与普通显微镜类似，制片后尽快观察4 4、上机观察：仪器参数设置、上机观察：仪器参数设置感谢您的关注！感谢您的关注！欢迎相互交流！欢迎相互交流！