电泳技术方王楷.pptx

电泳的基本原理电泳的基本原理带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。n在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（X）的乘积。F FQXQX n质点的前移同样要受到阻力（f f ）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：f f 6 r 6 r（r为质点半径，为介质粘滞系数，为质点移动速度）n当质点在电场中作稳定运动时：F F f 即：QXQX6r6r 迁移率u：单位电场强度下的电泳速度，：单位电场强度下的电泳速度，粒子的迁移率在一定条件下决定于粒子本身的性质即其所带电荷及大小和形状。uv/E=q/6rv=QX/6r 在具体实验中，移动速度V为单位时间t（单位为s）内移动的距离d（单位为cm），即Vd/t。电场强度X为单位距离L（单位为cm）内电势差E（单位为伏特），即XE/L。将这两个公式代入上述公式，得到U=v/X=dL/Etd=u*Et/L由此可以得到两种物质移动距离的差为d=(dA-dB)=(uA-uB)Et/L从这个公式可以看出物质能否进行分离决定于二者的迁移率。影影 响响 因因 素素1.1.待分离大分子的性质待分离大分子的性质 ：所带的电荷、分子大小和形状，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快 2.2.缓冲液缓冲液pHpH和离子强度和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为0.02-0.2之间。3.电场强度电场强度：过高，产热，样品和Buffer扩散增加，条带增宽；蛋白变性。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置4.电渗电渗：在 电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。5.5.支持介质的筛孔支持介质的筛孔 ：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大分分 类类按支持介质支持介质的不同可分为：纸电泳（Paper electrophorisis）醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis）琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis）聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis）（PAGE）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）。按支持介质形状支持介质形状不同可分为：薄层电泳；板电泳；柱电泳 聚丙烯酰胺电泳（聚丙烯酰胺电泳（PAGE）血血 清清 蛋蛋 白白 醋醋 酸酸 纤纤 维维 薄薄 膜膜 电电 泳泳目的：1.1.掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义2.2.熟悉电泳仪器的使用和操作熟悉电泳仪器的使用和操作原 理：血清蛋白在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，分子大小、形状各有差异。在电场作用下，可在醋酸纤维膜上分离成。A、1、2、五条区带。电泳结束后，将醋酸纤维膜置于染色液。使蛋白固定并染色，再脱色（洗去多余染料）。将染色后的区带分别剪开，将其溶与碱液，进行比色测定，计算各区带的百分数。实验操作步骤及注意点实验操作步骤及注意点1、准备与点样1）将已充分浸透的醋酸纤维膜取出，用滤纸吸去多余的缓冲液。在膜的无光泽面距一端 2cm 处点样（膜不能折；在膜上标记记号）。2）用点样器蘸血清少许（不能看见有液滴形成），按在点样处（点样要与膜边缘垂直，且大小均匀）。2、电泳将膜无光泽面向下，点样端置于阴极，膜与电极紧密接触（不能留有气泡），平衡5min。通电，电压100V,时间1h。3、染色电泳结束，将膜放入氨基黑 10B 染色，3min 后取出，漂洗，反复几次，至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。4、定量1）取 6 支试管并编号，分别加入 0.4N 氢氧化钠 4ml。2）剪下各条蛋白带和在膜空白部位剪一条带（空白带的宽度以最窄的条带为准，why？），将各条带浸入试管，不时摇动，洗脱蓝色。3）光光度计比色，波长为 650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取其它 5 管的光密度值。5、计算总吸光度 光密度总和 TA12 各部分蛋白质的百分数：蛋白质A/T100+白蛋白(A)12等等 电电 聚聚 焦焦 电电 泳泳 不同物质由于带电性质不同，因而在一定的电场强度下移动的方向和速度不同,可以进行分离。蛋白质具有许多可解离的酸性基团（COOH）和碱性基团（NH2）及其它基团,在一定溶液的pH条件下可解离成带正电荷或负电荷的基团。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，净电位为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。NH3+OHNH3+OHNH2PPPCOOHHCOOHCOO蛋白质的阳离子蛋白质的兼性离子蛋白质的阴离子操作步骤及注意要点操作步骤及注意要点 凝胶配制凝胶配制：a 取10 0.5cm内径的玻璃管，从一端量出7cm作好标记，用橡皮片封底（用两条橡皮圈扎紧），垂直放置。b 按实验指导page 17 配制凝胶液（按顺序，每加一种试剂后都要轻轻充分摇匀，TEMED最后才加入，加入摇匀后要立即灌胶），用长滴管吸取配好的凝胶液，沿玻璃管注入至7 ml标记平面，缓缓注入，避免产生气泡。c 立即用5ml注射器配针头注入约0.5cm高的蒸馏水，垂直放置（将长滴管及时清洗）注意：丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。电电 泳泳 将已聚合的凝胶去除水层，垂直插入电泳槽的橡皮管中，注意不要漏液。上槽注入5%H3PO4，下槽注入2%NaOH，检查凝胶管上下口内有无气泡，如有必须排除。上槽接正极，下槽接负极，50V预电泳30min，然后将电压维持在250 V，电泳2小时。剥剥 胶胶 用带有针头的注射器吸入蒸馏水，将针头插入凝胶与水之间，使针头慢慢螺旋前进。靠水流压力将胶与玻璃管分开，最后可用吸耳球在一端轻轻施压，将其取下。测测 量量 样样 品品 pI 直接用pH试纸插入所需测定的蛋白区带中测量