目的基因的克隆与鉴定.pptx

实验24 目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定 一、实验目的n学习和掌握细菌转化与目的基因DNA分子增殖及其鉴定的原理和方法。n重组DNA（基因克隆）示意图重组载体的构建二、主要仪器设备及器材主要仪器设备及器材n设备：低温离心机、恒温水浴器、台式离心机、超净工作台、琼脂糖凝胶电泳系统、恒温培养箱、高压灭菌锅、陶瓷研钵、吸头、紫外分光光度计、PCR仪、电泳仪、水平式电泳槽、微量离心管、紫外线透射仪。n试剂：TRIzol TM试剂、高保真DNA 聚合酶混合物、Reverse Transcription System、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、溴化乙锭、Tris、EDTA、SDS、pUCm-T载体、大肠杆菌、琼脂糖、T4 DNA连接酶。三、实验内容与基本要求实验内容与基本要求 n1、用碱裂解法提取质粒DNA：方法同前。n2、目的基因DNA分子的PCR扩增：方法同前。n3、PCR产物的检测与回收：方法同前。n4、质粒DNA与目的基因DNA分子的连接：利用pUCm-T载体构建T-A重组克隆。将上述PCR产物和质粒DNA，利用T4 DNA连接酶体系14连接过夜，获得连接产物。三、实验内容与基本要求实验内容与基本要求 n5、在感受态细胞中加入连接产物转化入大肠杆菌BL21中，获得转化的感受态细胞：取感受态细胞悬液100L转移到无菌的微量离心管中,每管加连接产物10L，轻轻混匀，在冰上放置30min。42的循环水浴中2min。快速将反应管转移到冰浴中，使细菌冷却2min。每管加500L 无氨苄青霉素的LB培养液。37，200 rpm，培养1h。三、实验内容与基本要求实验内容与基本要求 n6、已转化的感受态细胞涂板培养，观察并鉴定：将400L 菌涂在氨苄青霉素平板上。平板在37正向放置1h，以吸收过多液体，然后倒置平皿，于37培养过夜。挑取阳性克隆至含氨苄青霉素的LB培养液中，37培养过夜，小规模扩增后，用碱变性法制备质粒并鉴定。n7、阳性克隆目的基因DNA分子的鉴定：挑取阳性菌落至含氨苄青霉素的LB培养液中，37培养过夜，小规模扩增后，用碱变性法制备质粒并鉴定。取阳性克隆菌液，采用PCR方法和鉴定阳性克隆。超净工作台高速冷冻离心机和超速离心机等高速冷冻离心机和超速离心机等漩涡混匀器垂直电泳装置凝胶成像系统四、四、实验结果报告实验结果报告 1、转化效率的计算、转化效率的计算：转化子总数菌落数转化子总数菌落数（转化反应原液总体积（转化反应原液总体积/涂涂板菌液体积）板菌液体积）转化效率转化效率（每微克质粒每微克质粒DNA的转化子数的转化子数）转化转化子总数（个转化子）子总数（个转化子）/加入质粒加入质粒DNA的量（的量（g）2、质粒提取与酶切鉴定结果，贴上打印实验照片、质粒提取与酶切鉴定结果，贴上打印实验照片并标明照片上各并标明照片上各DNA条带的含义。条带的含义。五、思考题五、思考题1 1、何谓感受态细胞？制备感受态细胞的理论、何谓感受态细胞？制备感受态细胞的理论依据是什么？依据是什么？2 2、CaClCaCl2 2制备细菌感受态细胞及其转化的基制备细菌感受态细胞及其转化的基本原理。本原理。3 3、阳性克隆鉴定的方法有哪些？阳性克隆鉴定的方法有哪些？简述简述