第二代测序数据分析原理.pptx

问题出发正常样本与异常样本，如肿瘤等；药物处理前后样本状态变化，如尼古丁刺激前后；发育不同阶段的样本改变 .第二代测序数据分析原理徐汪节2024/8/22 周四3三代三代DNA测序技术之比较测序技术之比较第一代测序技术：Sanger测序法第二代测序技术：454测序 第三代测序技术：？直接测序法：？2024/8/22 周四4第一代测序技术：Sanger测序法简便、快速2024/8/22 周四5逐渐被遗忘的测序技术：Maxam-Gilbert的 DNA化学降解法2024/8/22 周四6Sanger测序的局限通过几十年的改进，第1 代测序仪的读长可以超过1000bp，原始数据的准确率可以高达99.999%，测定每千碱基序列的成本是0.5 美元,每天的数据通量可以达到60万碱基。但是，不管怎么改进，第1 代测序技术在速度和成本方面都已达到了极限（因为对电泳分离技术的依赖,使其难以进一步提升分析的速度和提高并行化程度，并且难以通过微型化降低测序成本）。在此种情况下，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。概要主要的测序平台基因组分析原理转录组分析原理分析策略的选择2024/8/22 周四8第二代测序技术454测序Illumina SOLID Polonator Complete Genomics2024/8/22 周四9 4542024/8/22 周四10 SOLID2024/8/22 周四11 Illumina 2024/8/22 周四12其他Polonator Complete Genomics2024/8/22 周四132024/8/22 周四14第二代测序技术的共同点1 将目标DNA剪切为小片段2 单个小片段DNA分子结合到固相表面3 单分子独立扩增4 每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号5 高分辨率的成像系统。2024/8/22 周四15第二代测序技术的局限与第一代测序仪相比，以合成测序为基础的下一代测序平台速度显著提高，成本明显降低。每台设备每天产出千兆碱基的序列不足为奇。但是,除了罗氏的454平台之外，读长短成了下一代测序平台的致命伤，这主要是由于DNA簇中存在的光学信号移相造成的。而应运而生的单分子测序技术是解决这一问题的一种方法。2024/8/22 周四16第三代测序技术：单分子测序Helicos BiosciencesVisiGenPacific BiosciencesMobious Nexus I2024/8/22 周四172024/8/22 周四18直接测序法在所有上述三 代测序技术中，序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下，通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中释放出的光学信号而间接确定的。除了需要昂贵的光学监测系统，还要记录、存储并分析大量的光学图像，这都使仪器的复杂性和成本增加。依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用，在目前测序成本中比例相当大。直接读取序列信息，不使用化学试剂，对于进一步降低测序成本是非常可取的。为了实现这样的目标，目前就有很多人在研究纳米物理技术。在全球，许多公司和组织，如Agilent，DNA Electronics，IBM,NabSys，Oxford Nanopore Technologies，Sequenom 等都在进行纳米孔测序的开发，不同的只是采用的方法或策略。2024/8/22 周四192024/8/22 周四20Second generation sequenceRoche 454 Metagenomics De novo sequencing RNA-seqillumia Solexa De novo sequencing Re-sequencing RNA-seq (ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)Meth-seqABI SOLiD Re-sequencing ChIP-seq RNA-seqExperimentsDNA-seq:de novo,resequencingRNA-seq:mRNA,ncRNA,smRNA.ChIP-seq:Chromatin ImmunoPrecipitationMethyl-seq:methylated DNA(epigenome)主要的测序平台基因组分析原理转录组分析原理分析策略的选择Sequencing GlossaryReads.A collection of clones that over-sample the target genome.Pair-end reads.Sequence reads derived from both ends of a sequencing-library clone.Mate-pair reads.Sequence reads derived from both ends of a mate-pair library clone which insert size is usually1kb.Insert size.The size of the clone-insert from which a clone-end pair is taken.Contig.The result of joining an overlapping collection of sequence reads.Scaffold.The result of connectiing non-overlapping contiges by using pir-end reads.N50 size.As applied to contigs or scaffolds,that size above which 50%od the assembled 全基因组de nove分析工具PlatformCorrectionAssemblySolexaSOAPdenovoSOAPdenovo Velvet,AbyssSolidSAETVelvet454newbler分析所需工具Bowtie software-http:/bowtie- tools-http:/ softare-http:/tophat.cbcb.umd.edu/Cufflinks software-http:/Cufflinks.cbcb.umd.edu/CummeRbund software-http:/compbio.mit.edu/cummeRbund/外显子组分析工具PlatformAlignmentFind VariationsSolexaSOAP,bwaSOAPsnp samtoolsSolidBioscope,BFASTBioscope,BFAST454BLAST,NEWBLERnewbler主要的测序平台基因组分析原理转录组分析原理分析策略的选择常规分析Transcripts quantificationSplicing sites discovery and quantificationGene discoverySNP/INDEL detectionAllele specific expressionUniGene拼接拼接目的：将预处理后reads进行拼接，得到拼接结果。原理：应用 de Bruijn graph path 算法对reads进行denovo拼接；对上一步的拼接结果，再用Hamilton Path算法拼接。结果：UniGene序列，UniGene统计信息，序列长度分布图 3.数据库注释数据库注释目的：对拼接得到的UniGene进行功能注释 原理：通过blast+算法将拼接得到的UniGene序列与数据库进行比对 结果：比对结果表格，物种分布统计和Evalue分布统计 UniGene表达分析表达分析目的：UniGene定量分析。原理：以UniGene为reference，分别将每个样本的reads进行reference mapping,从而得到每个样本在每个UniGenes中的一个reads覆盖度，然后应用RPKM/FPKM标准化公式对富集片段的数量进行归一化。RPKM：Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads，公式下:UniGene表达分布图，表达分布图，1X，5X分别为分别为FPKM=1，FPKM=5分界点，可以大体观察到低表达，中表分界点，可以大体观察到低表达，中表达以及高表达的比例关系达以及高表达的比例关系UniGene样本间表达相关性散点图样本间表达相关性散点图样本间表达差异程度的样本间表达差异程度的MA图，可以体现差异表达图，可以体现差异表达总体偏差总体偏差UniGene表达差异分析表达差异分析目的：对定量结果进行统计检验分析，找出差异表达UniGene 原理：双层过滤筛选差异基因 FC值筛选：采用Fold-change(FC)，表达差异倍数进行第一层此的差异基因筛选 FDR检验：一般采用卡方检验中的fisher精确检验进行p值检验，采用Benjamini FDR(False discovery ratio)校验方法对p值进行假阳性检验，即，通过FDR显著性参数进行第二层次的差异基因筛选。组间差异基因上调与下调个数统计，可以通过此图观察上调与下调的一个总体趋势组间差异基因上调与下调个数统计，可以通过此图观察上调与下调的一个总体趋势差异基因火山图，可以观察到差异基因总体分布差异基因火山图，可以观察到差异基因总体分布GO功能分类功能分类目的：利用数据库注释信息将 UniGene进行 GO 功能分类。原理：利用数据库的注释结果，应用blast2GO算法进行GO功能分类，得到所有序列在Gene Ontology 的三大类：molecular function,cellular component,biological process 的各个层次所占数目，一般取到14层。结果：MF，BP，CC三大分类结果文件以及 UniGene2GO 关系列表，三大类别中第二层次上的柱状分布图和饼图，GO功能的层次分布图。KEGG代谢通路分析代谢通路分析目的：对拼接得到 UniGene 进行 KEGG pathway 映射。原理：应用KEGG KAAS在线 pathway比对分析工具对拼接得到的UniGene进行KEGG映射分析。结果：标记的Pathway通路图。IPA pathway analysis(http:/ UniGene 进行 COG功能分类。原理：利用blast+算法将拼接得到的UniGene与CDD库中的COG/KOG库进行比对，进行COG功能分类预测，将其映射到COG分类中。结果：COG分类分布情况图。SSR重复序列注释重复序列注释目的：对拼接得到 UniGene进行 SSR 简单重复序列的查找。原理：筛选标准：单核苷酸重复的次数在10次或10次以上，二核苷酸重复的次数在 6次或6次以上，三至六核苷酸重复的次数在 5次或 5次以上。同时，也筛选中间被少数碱基(间隔小于100或等于100)打断的不完全重复的SSR。结果：重复序列的信息文件以及统计文件。LncRNA预测预测目的：对拼接得到的UniGene进行LncRNA(Long noncoding RNA)预测。原理：通过以下过程对UniGene进行过滤，最终得到候选LncRNA序列。1)Unigene length 200bp；2)Unigene ORF(Open Reading Frame)length 300；3)将满足长度条件的UniGene与多个近源物种进行进化分析，得到序列的保守性和进化特性；4)根据上述的特性和已知数据库中coding、noncoding区域的特性建立编码筛选模型；5)将符合noncoding模型的UniGene与Pfam等蛋白域数据库进行同源性比对，进一步去除可能的编码特性，最终得出LncRNA预测结果。RSAM 01：模式动植物基因组数据和注释信息整合RSAM 07：可变剪接分析 可变剪接体 与Exon skipping junction 的识别RSAM 08：转录起始位点（TSS）分析TSS 类和转录起始位点模式的识别（1）通过tag 聚类方法将5端read 进行聚类，识别出不同模式的TSS，例如下图所示：确定cluster 的边界（黄色区域）。（2）每个cluster 至少包含100 reads,并统计这些cluster 的定位和分布数量（3）统计不同TSS cluster 大小宽度分布，以及转录起始模式的识别RSAM 09.融合基因的发现（Fusion gene Discovery）RSAM 10.非长编码RNA 与多外显子反义转录本的识别图例 蛋白质编码效能分析(a，b)，进化保守性水平(c)与lincRNA 表达量，多外显子反义转录本表达量(d)进行对比分析RSAM 11.结构变异SNV 识别与计算RNAseq 是相对于全基因组测序相对廉价的探测SNV 变异体的策略。根据RNAseq 数据，我们采用探测算法准确地识别出SNV。主要的测序平台基因组分析原理转录组分析原理分析策略的选择按照研究需求选择实验需求分为：医疗、基础科研、问题方向等；样本本身原因：样本量、分析难度、周期等