1、细菌细菌LD50测定方法测定方法报告人:张玉晴报告人:张玉晴指导老师:李槿年教授指导老师:李槿年教授大纲1LD50基本概念2LD50计算方法LD50具体操作步骤3注意事项4w半数致死量:LD50(Lethal dose)表示在规定时间内,通过指定感染途径,使一定体重或年龄的某种动物半数死亡所需最小细菌数或毒素量。1LD50基本概念w1、寇氏法/改良寇氏法w2、累计法(Reed-Muench法)w3、霍恩氏法(Horn氏法)w4、加权法w5、序贯法w6、固定剂量法w7、logistic模型法LD50计算方法2w1、寇氏法/改良寇氏法 公式:LD50=lg-1Xm i(P 0.5)X50=lgLD
2、50 LD50 95%可信限=lg-1(X50 1.96SX50)LD50平均可信限=LD50 (LD50可信限高限-低限)/2 Xm:最大剂量的对数值i:相邻两组剂量对数值之差P:各组动物死亡率,用小数表示P:各组动物死亡率之总和 n:每组动物数w预试验找出引起0%死亡率和100死亡率剂量的所在范围w反应量大致呈正态分布w剂量必须按等比级数分布w各组动物数相等w2、累计法(Reed-Muench法)它是先将实验死亡动物数和存活动物数进行累计加和,再用加和的数据计算死亡率。在死亡率中有2个数据A和B,且A刚好大于50%,B刚好小于50%w计算方便,更多地运用在微生物学中,尤其在稀释分析中w不考
3、虑操作误差,计算结果不够精确,粗略判断LD50。拟态弧菌对草鱼LD50的测定335%来苏尔浸泡24h自来水冲洗15432一、实验准备:二、细菌总数测定 挑取HX4单个菌落10mL生理盐水重悬100mLBHI液体培养基离心收集菌体洗涤菌体3次测量菌落大小30 150r/min振荡培养24h8000r/min离心8min平板菌落计数法计数4保存用于攻毒10-110-310-210-410-510-610-710-810-930倒置倒置培养培养24h记录平板上菌落数记录平板上菌落数量,肉眼观察量,肉眼观察+放放大镜检查大镜检查w数据处理 选取同一稀释度平均菌落数在30300个之间的平板1、一个稀释度
4、,平均菌落数在30300个之间时,乘以稀释倍数报告。2、如有两个稀释度平均菌落数均在30300个之间,则应求出两者总菌数之比,比值小于或等于2应报告平均数,大于2则报告其中较小的数字。3、如所有稀释度的平均菌落数均多于300个,应按稀释度最高的平均菌落数,乘以稀释倍数报告。4、如所有稀释度的平均菌落数均少于30个,则按稀释倍数最低的平均菌落数,乘以稀释倍数报告。5、如所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间,其中一个稀释度大于300,而相邻的另一稀释度小于30,则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告。w三、攻毒0.01g/LMS-222麻醉0.3mL1.210102.41094.8
5、1089.61071.9107分别腹腔注射5组鱼三、攻毒 观察7天内草鱼的发病和死亡情况,记录结果,按Reed-Muench氏法计算LD50 病死鱼无菌解剖,观察内脏病变情况,并用接种环蘸取内脏接种于BHI固体培养基上,30培养2d,对分离到的细菌进行革兰氏染色镜检。组组别别剂量CFU/mL只数死亡数 存活数累计结果(result)生死死亡比例 死亡率11.2101055014/14100.0%24.01095419/1090.0%31.31095325/862.5%44.41085232/822.2%51.51085050/110.0%LD50=4.2107CFU/mL0表1 HX4菌对斑马
6、鱼的毒力(LD50)13611149520数据汇总:组别 稀释比例 死亡率1 原液 100%2 1:3 90.0%3 1:9 62.5%4 1:27 22.2%5 1:81 0.0%w7、LD50计算 距离比例r=(高于50%死亡率50)(高于50%死亡率低于50%死亡率)=(62.550)(62.522.2)=0.310 lgLD50=高于50%死亡率稀释度倒数的对数+距离比例稀释倍数的对数 =lg9+0.310lg3=1.1021 LD50=14.3515 即当细菌原液稀释成1:14.3515时,腹腔注射斑马鱼,能使50%斑马鱼发生死亡。综上所述:拟态弧菌HX4对斑马鱼半数致死量=1/14.35151.210100.05 =4.2107w1、稀释度确定:3倍比?5倍比?or 10倍比?w2、注射方法:防止溢出注意事项4