实验六细胞器的分离与观察.pptx

实验六实验六细胞器的分离与观察细胞器的分离与观察一、细胞核的分离与观察一、细胞核的分离与观察二、线粒体的分离与观察二、线粒体的分离与观察一、实验目的一、实验目的o了解细胞器的分离原理了解细胞器的分离原理o掌握差速离心和密度梯度离心技术掌握差速离心和密度梯度离心技术二、实验原理二、实验原理o细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官，细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种物理方法（研磨、超声从细胞中分离出来。利用各种物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释放出来。分即从细胞中释放出来。o细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分级分离的方法有级分离的方法有差速离心和密度梯度离心差速离心和密度梯度离心两种。两种。o分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织其过程包括组织细胞匀浆细胞匀浆、分级分离分级分离和和分析分析三三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。成、理化特性及其功能的主要手段。(1)细胞匀浆细胞匀浆(Homogenization)：低温条件下，：低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即即0.25molL蔗糖蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。胞器及其包含物的匀浆。(2)分级分离分级分离(Fractionation)：由低速到高速离心逐：由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化离心加以纯化.(3)分析分析：分级分离得到的组分，可用细胞化学和生：分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。化方法进行形态和功能鉴定。Unna染色法（甲基绿染色法（甲基绿-派洛宁染色）派洛宁染色）细胞核分析：细胞核分析：甲基绿甲基绿-派洛宁对派洛宁对DNA和和RNA有选择有选择性的染色效果。核酸是酸性的，它们对于碱性染料性的染色效果。核酸是酸性的，它们对于碱性染料甲基绿和派洛宁的亲和力不同，而使这两种染料对甲基绿和派洛宁的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。两类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来。酸分布显示出来。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的的部分，主要是染料的“电化学电化学”特性起重要作用。特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表现带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子现带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用。或阳离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用。中性红中性红-詹纳斯绿染色詹纳斯绿染色线粒体分析线粒体分析：詹纳斯绿（：詹纳斯绿（JanusgreenB）是对）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。由于线粒体内具有细胞色素氧化酶粒体膜上。由于线粒体内具有细胞色素氧化酶系，能使詹纳斯绿保持在氧化状态（淡蓝绿色）系，能使詹纳斯绿保持在氧化状态（淡蓝绿色）。中性红为弱碱性染料，对液泡系。中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体即高尔基体)的染色有专一性，将活细胞中的液泡系染红色。的染色有专一性，将活细胞中的液泡系染红色。洋葱内表皮细胞的线粒体分布洋葱内表皮细胞的线粒体分布植物根尖液泡的中性红染色植物根尖液泡的中性红染色三、材料和试剂三、材料和试剂o材料：小鼠的肝脏材料：小鼠的肝脏o器材：高速冷冻离心机、天平、显微镜、器材：高速冷冻离心机、天平、显微镜、Eppendorf管、冰块、冰盒、载玻片、盖玻片、玻管、冰块、冰盒、载玻片、盖玻片、玻璃匀浆器璃匀浆器o试剂：生理盐水、试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、蔗糖溶液、0.34mol/L蔗糖溶液蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、溶液、0.88mol/L蔗糖溶液蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、溶液、95%乙醇溶液、丙酮、乙醇溶液、丙酮、PBS液、液、甲基绿甲基绿-派洛宁染液、中性红派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液。詹纳斯绿染液。四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤o1.细胞核的分离细胞核的分离（1）组织匀浆）组织匀浆:将饥饿将饥饿24h的大白鼠处死的大白鼠处死,立即剪开腹部立即剪开腹部,迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污洗去血污,用滤纸用滤纸吸干。称取吸干。称取0.5g肝组织肝组织,在小烧杯中剪碎在小烧杯中剪碎,用预冷的用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组织蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组织倒入匀浆管中进行匀浆倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。匀匀浆过程要在冰浴中进行。匀浆完毕浆完毕,移入移入1.5ml离心管中。离心管中。（2）离心：低温离心机（）离心：低温离心机（4）中进行。）中进行。每次每次离心前一定要在天平（离心前一定要在天平（托盘天平托盘天平）上将两离心）上将两离心管配平。第一次以管配平。第一次以600g(3005rpm)离心离心10min。将其上清夜移入。将其上清夜移入Eppendorf管中，盖好盖子管中，盖好盖子置于冰浴中，留待后面使用（置于冰浴中，留待后面使用（分离线粒体分离线粒体）。）。沉淀使用沉淀使用1ml预冷的预冷的0.25mol/L蔗糖溶液离心洗蔗糖溶液离心洗涤涤2次，每次次，每次1000g(3880rpm)离心离心10min。（3）纯化：将沉淀用）纯化：将沉淀用5倍体积倍体积0.34mol/L蔗糖溶蔗糖溶液液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混悬，用长针头注射溶液混悬，用长针头注射器再混悬液下轻轻加入器再混悬液下轻轻加入4倍体积倍体积0.88mol/L蔗糖溶蔗糖溶液液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。尽量使两种溶液明溶液。尽量使两种溶液明显分层。以显分层。以1500g(4752rpm)离心离心1520min。弃上清液弃上清液，沉淀即为经过纯化的细胞核，用，沉淀即为经过纯化的细胞核，用PBS溶液悬浮，溶液悬浮，4C保存。保存。o细胞经甲基绿细胞经甲基绿-派洛宁混合液处理后，其中的派洛宁混合液处理后，其中的DNA和和RNA出现不同的呈色反应，一般认为这出现不同的呈色反应，一般认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料派洛宁和是由于带有负电荷的核酸对碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选甲基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择性，甲基绿染高聚分子的择性，甲基绿染高聚分子的DNA呈蓝绿色，派呈蓝绿色，派洛宁染低聚分子的洛宁染低聚分子的RNA呈红色。呈红色。下次实验内容：下次实验内容：（4）鉴定：将分离纯化的细胞核制成涂片，空气干）鉴定：将分离纯化的细胞核制成涂片，空气干燥。将干燥的涂片浸入燥。将干燥的涂片浸入95乙醇溶液固定乙醇溶液固定5min，晾，晾干，滴加甲基绿干，滴加甲基绿-派洛宁染液染色派洛宁染液染色2030min，丙酮，丙酮分色分色30s，蒸馏水漂洗，滤纸吸干水，镜检。，蒸馏水漂洗，滤纸吸干水，镜检。核核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈红呈红色。色。六、实验报告六、实验报告o1.线粒体提取分离过程中，为什么要在线粒体提取分离过程中，为什么要在04进行进行？o2.要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？根据你的实际活性鉴定的过程中需注意哪些问题？根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法。体会，写出操作注意事项及改进方法。o3.分离介质分离介质0.34mol/L及及0.88mol/L缓冲蔗糖溶液缓冲蔗糖溶液哪一种在下层哪一种在下层?有什么作用有什么作用?2.线粒体的分离线粒体的分离o(1)分离分离:将分离细胞核时收集的上清液以将分离细胞核时收集的上清液以10000g(12270rpm)离心离心10min。沉淀用预冷。沉淀用预冷0.25mol/L蔗糖溶液悬浮蔗糖溶液悬浮,10000g离心离心10min,反复反复2次。次。o(2)鉴定鉴定:在干净的载玻片中央滴加在干净的载玻片中央滴加12滴滴中性红中性红-詹纳斯詹纳斯绿染液绿染液,用牙签挑取沉淀物均匀涂片用牙签挑取沉淀物均匀涂片。盖上盖片盖上盖片,染色染色5min,镜检镜检。线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。五、实验结果五、实验结果o核核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈红色。呈红色。o线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。o观察每个视野中所见完整细胞核和线粒体的观察每个视野中所见完整细胞核和线粒体的数量及纯度。数量及纯度。差速离心差速离心（differentialcentrifugation）o主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。沉淀沉淀 转速转速x x时间时间 内内 容容 物物 A A150g x 20min150g x 20min完整细胞完整细胞 B B1000g x 20min 1000g x 20min 细胞核，细胞碎片细胞核，细胞碎片C C3000g x 6min 3000g x 6min 叶绿体叶绿体 D D10000g x20min 10000g x20min 线粒体、溶酶体、微体线粒体、溶酶体、微体 E E105000g x120min105000g x120min微粒体微粒体 F F105000g x 20min 105000g x 20min 0.26%脱氧胆酸纳脱氧胆酸纳 核糖体核糖体 密度梯度离心密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）o用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。o如果分离的颗粒在具有密度梯度的介质中离心如果分离的颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种大小的颗粒沉降到与自粒沉降得快，并且每种大小的颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种不同大小的颗粒在离心管中被分成独最后各种不同大小的颗粒在离心管中被分成独立的区带。立的区带。o细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相，蔗糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上，能保持细胞器的结构和功能，在一定程度上，能保持细胞器的结构和功能，保持酶的活性，避免细胞器的聚集。保持酶的活性，避免细胞器的聚集。