酶与细胞固定化技术.pptx

河南科技学院河南科技学院第五章第五章 酶、细胞与原生质体的酶、细胞与原生质体的 固定化技术固定化技术Immobilized Enzyme,Cells and Protoplast 第一节第一节 概概 述述一、游离酶使用中的局限性一、游离酶使用中的局限性 1.1.稳定性差稳定性差 2.2.提取纯化繁琐提取纯化繁琐,价格昂贵；难以重复使用价格昂贵；难以重复使用,成本高成本高 3.3.产物的分离纯化较困难（酶反应后成为产物的分离纯化较困难（酶反应后成为杂质）杂质）第一节第一节 概概 述述二、固定化酶研究二、固定化酶研究l克服游离酶缺点的方法之一克服游离酶缺点的方法之一l5050年代开始年代开始l6060年代后期，固定化技术迅速发展年代后期，固定化技术迅速发展l19691969年，千田一郎首次在工业生产规模应用固年，千田一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从定化氨基酰化酶从DL-AADL-AA连续生产连续生产L-AAL-AA实现实现酶应用史上的一大变革酶应用史上的一大变革第一节第一节 概概 述述三、基本概念三、基本概念1 1、固定化酶（、固定化酶（19711971第一次国际酶工程学术会议）第一次国际酶工程学术会议）（Immobilized Enzyme)Immobilized Enzyme)l 指在一定空间范围内呈闭锁状态存在的酶，指在一定空间范围内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用复利用l包括酶与不溶性载体结合的包括酶与不溶性载体结合的“固相酶固相酶”“”“水不水不溶性酶溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中的酶及包埋在凝胶或超滤装置中的酶第一节第一节 概概 述述三、基本概念三、基本概念2 2、固定化细胞（原生质体）、固定化细胞（原生质体）l指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间范围内，但学等因素约束或限制在一定空间范围内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力使用的活力第一节第一节 概概 述述四、固定化酶优点四、固定化酶优点l增加了酶的稳定性增加了酶的稳定性l能降低酶的总体费用能降低酶的总体费用l酶的分离和回收变得容易，并可重复使用酶的分离和回收变得容易，并可重复使用l使反应过程的连续操作成为可能使反应过程的连续操作成为可能l反应产物也易于提取纯化反应产物也易于提取纯化l有利于过程设计和优化有利于过程设计和优化l拓广了酶的应用范围（多酶系统的酶反应，非拓广了酶的应用范围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等）水相酶反应，生物传感器探头等）一、酶的固定化方法一、酶的固定化方法1 1、酶的固定化方法（四大类方法）、酶的固定化方法（四大类方法）l吸附吸附法法l包埋包埋法法l交联交联法法l化学化学共价法共价法其它其它（酶的逆胶束包囊法）（酶的逆胶束包囊法）第二节第二节 固定化酶的制备固定化酶的制备一、酶的固定化方法一、酶的固定化方法2 2、选择方法、选择方法依据依据l酶酶的性质的性质l载体载体的来源、价格、机械性能、载体的功能的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度基团和交联度等等l制备制备方法简便易行方法简便易行第二节第二节 固定化酶的制备固定化酶的制备一、酶的固定化方法一、酶的固定化方法3 3、衡量依据、衡量依据l测定测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力活力回收率回收率l研究研究它的最适反应条件（底物浓度、它的最适反应条件（底物浓度、pH pH 值、值、温度、离子强度等温度、离子强度等）l稳定性稳定性和不稳定原因的和不稳定原因的探究探究l对对酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到较为理想的构型和较为理想的构型和相容性相容性第二节第二节 固定化酶的制备固定化酶的制备二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（一）吸附法一）吸附法l原理原理：主要是利用细胞与载体之间的吸：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（范德华力、离子键和氢键），使引力（范德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，常用的吸附剂有玻细胞固定在载体上，常用的吸附剂有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维维等等 l此外此外还可利用专一的亲和力来还可利用专一的亲和力来固定细胞固定细胞l例例：伴刀豆球蛋白与酿酒酵母细胞壁伴刀豆球蛋白与酿酒酵母细胞壁-甘露聚糖具有亲和作用，甘露聚糖具有亲和作用，故可将伴故可将伴刀豆球蛋白先连接到载体上，然后把刀豆球蛋白先连接到载体上，然后把酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白上上二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（一）吸附法（一）吸附法l酶材料酶材料 酶酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上的酶或酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上的酶或酶系系l常用吸附剂常用吸附剂各种各种矿物质以及无机载体矿物质以及无机载体(氧化铝，氧化铁，氧化钛，氧化铝，氧化铁，氧化钛，硅藻土，多空陶瓷，多空玻璃，羟基磷灰石等硅藻土，多空陶瓷，多空玻璃，羟基磷灰石等)，及天，及天然高分子载体淀粉、白蛋白然高分子载体淀粉、白蛋白等等离子交换剂离子交换剂(离子强度离子强度增加或介质的增加或介质的pHpH、温度变化时，、温度变化时，这种结合发生这种结合发生分解分解)二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（一）吸附法（一）吸附法l优点优点操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活载体廉价易得，且可反复利用载体廉价易得，且可反复利用l缺点：缺点：结合相当弱结合相当弱酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失高浓度盐溶液或底物溶液可加速蛋白质的脱附。高浓度盐溶液或底物溶液可加速蛋白质的脱附。当要求酶的固定绝对牢靠时当要求酶的固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不采用吸附法是很不可靠的可靠的二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（一）吸附法（一）吸附法l例：例：将伴刀豆球蛋白将伴刀豆球蛋白A-A-琼脂糖琼脂糖4B 50 ml4B 50 ml（在（在10mM 10mM PBS pH 7.4 PBS pH 7.4 含含 0.5M NaCl,1mM CaCl0.5M NaCl,1mM CaCl2 2和和1mM 1mM MnClMnCl2 2）与酶液）与酶液(10 mg/ml)5ml,(10 mg/ml)5ml,在在44，搅匀过夜，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物便成琼脂糖复合物用用10 mM NaAc pH4.510 mM NaAc pH4.5（1mMCaCl2 1mMCaCl2 和和1mMnCl1mMnCl2 2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于于10 ml NaAc PBS10 ml NaAc PBS中备用中备用二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（二）包埋法（二）包埋法l概念：将酶或含酶菌体包埋在各种多空概念：将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中，使酶固定的方法。载体中，使酶固定的方法。可分为凝胶可分为凝胶包埋法（网格型）和半透膜包埋法（微包埋法（网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种囊型）两种l优点：一般不需酶的优点：一般不需酶的AAAA残基进行结合反残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高率高l缺点：包埋时发生化学聚合反应，酶易缺点：包埋时发生化学聚合反应，酶易失活，须巧妙设计反应条件。另外网格失活，须巧妙设计反应条件。另外网格结构影响底物和产物的扩散，有时，这结构影响底物和产物的扩散，有时，这种扩散会导致酶动力学行为的改变，所种扩散会导致酶动力学行为的改变，所以此法只适合于小分子底物和产物的酶以此法只适合于小分子底物和产物的酶二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（二）包埋法（二）包埋法l海藻酸盐包埋法海藻酸盐包埋法 海藻酸钠与海藻酸钠与CaCa2+2+,Mg,Mg2+2+,Al,Al3+3+等多价离子间的转移凝胶作等多价离子间的转移凝胶作用用,形成固定化细胞颗粒形成固定化细胞颗粒优点优点:海藻酸盐价格便宜；包埋条件温和海藻酸盐价格便宜；包埋条件温和缺点缺点:在高浓度电介质（在高浓度电介质（K K+,Na,Na+）溶液中）溶液中,固定化颗粒变得固定化颗粒变得不稳定不稳定CaCa2+2+等多价离子在磷酸缓冲溶液中易形成沉淀等多价离子在磷酸缓冲溶液中易形成沉淀,固定化固定化颗粒溶解颗粒溶解二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（二）包埋法（二）包埋法l角叉菜糖包埋法角叉菜糖包埋法 K-K-角叉菜是一种含有许多硫酸根基团的多糖化角叉菜是一种含有许多硫酸根基团的多糖化合物。在合物。在K K+离子存在下，它能立即生成凝胶离子存在下，它能立即生成凝胶缺点缺点:对高浓度的对高浓度的NaNa+离子敏感离子敏感固定化温度高固定化温度高,需要在需要在3755 3755 第二节第二节 固定化酶的制备固定化酶的制备二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（二）包埋法（二）包埋法l聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 在含酶在含酶(或细胞或细胞)的水溶液中，加入一定比例的单体丙的水溶液中，加入一定比例的单体丙烯酰胺和胶联剂烯酰胺和胶联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺，然后在催化甲叉双丙烯酰胺，然后在催化剂剂(二甲氨基丙腈二甲氨基丙腈)和引发剂和引发剂(过硫酸钾过硫酸钾)的作用下低温的作用下低温(冰浴冰浴)聚合聚合,形成凝胶形成凝胶缺点缺点:丙烯酰胺对酶具有变性作用丙烯酰胺对酶具有变性作用第二节第二节 固定化酶的制备固定化酶的制备二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（二）包埋法（二）包埋法l聚乙烯醇（聚乙烯醇（PVAPVA）包埋法）包埋法 循环冷冻法，磷酸盐硬化法，硼酸硬化法循环冷冻法，磷酸盐硬化法，硼酸硬化法优点优点:原材料价格便宜原材料价格便宜条件温和条件温和无毒害作用无毒害作用第二节第二节 固定化酶的制备固定化酶的制备间同立构聚合物间同立构聚合物全同立构聚合物全同立构聚合物循环冷冻法循环冷冻法聚乙烯醇水溶液在聚乙烯醇水溶液在极稀条件下，经冷极稀条件下，经冷冻融化循环处理，冻融化循环处理，随着循环次数的增随着循环次数的增加，高分子链发生加，高分子链发生收缩，形成大量的收缩，形成大量的分子内凝聚缠结点分子内凝聚缠结点硼酸硬化法硼酸硬化法将聚乙烯醇在将聚乙烯醇在70 70 8080进行水浴加热进行水浴加热至完全溶解至完全溶解,然后冷然后冷却至却至35,35,与酶溶液与酶溶液(细胞悬浮液细胞悬浮液)混匀混匀,滴滴加到饱和硼酸溶液加到饱和硼酸溶液中中二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（二）包埋法（二）包埋法l半透膜包埋法半透膜包埋法界面沉淀法界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成被膜将酶包埋低而形成被膜将酶包埋操作：酶液在操作：酶液在油溶性表面活性剂油溶性表面活性剂存在下在与水不互存在下在与水不互溶的溶的有机相有机相中乳化形成油包水的微滴，再将溶于有中乳化形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的机溶剂的高聚物高聚物加入乳化液中，然后加入一种加入乳化液中，然后加入一种不溶不溶解高聚物解高聚物的的有机溶剂有机溶剂，使高聚物在，使高聚物在油油-水水界面上沉淀界面上沉淀析出，形成膜将酶包埋，最后在乳化剂帮助下由有析出，形成膜将酶包埋，最后在乳化剂帮助下由有机相移入水相机相移入水相二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（二）包埋法（二）包埋法l半透膜包埋法半透膜包埋法界面聚合法界面聚合法 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶。包埋酶。例例:将含将含10%10%血红蛋白的酶液与血红蛋白的酶液与1 1，6 6己二胺的水溶液混合，己二胺的水溶液混合，立即在含立即在含1%1%司盘司盘-85-85的氯仿的氯仿-环己烷中分散乳化，再加环己烷中分散乳化，再加入溶于有机相的入溶于有机相的葵二酰氯葵二酰氯后，便在油后，便在油-水界面上发生聚水界面上发生聚合反应，形成尼龙膜，将酶包埋合反应，形成尼龙膜，将酶包埋二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（三）（三）交联法交联法l基本原理：酶分子和多功能试剂之间形基本原理：酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到的交联网架结构，以戊二成共价键得到的交联网架结构，以戊二醛使用最广泛醛使用最广泛OHCOHC（CHCH2 2）3 3CHOCHO，使载，使载体的氨基和酶蛋白中的氨基交联形成体的氨基和酶蛋白中的氨基交联形成ShiffShiff碱碱（含碳氮双键）将酶固定化。含（含碳氮双键）将酶固定化。含氨基的载体，可用氨基的载体，可用胺乙基纤维素胺乙基纤维素（纤维（纤维素素-OCH2CH2NH2-OCH2CH2NH2），），二乙氨乙基纤维二乙氨乙基纤维素素（DEAE-DEAE-纤维素）。双功能试剂除了纤维素）。双功能试剂除了戊二醛外，还有戊二醛外，还有乙撑二异氰酸酯乙撑二异氰酸酯OCNOCN（CHCH2 2）6 6NCONCO二、酶的固定化技术（三）交联法l交联剂的特点带有二个以上的功能基团反应比较剧烈，条件比较严格l操作方便，活力回收不高固定化分两步进行，第一步形成可溶性分子间交联络合物，第二步是快速反应导致固化二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（三）（三）交联法交联法l交联法有交联法有5 5种形式种形式酶直接交联法酶直接交联法在酶液中加入适量在酶液中加入适量多功能试剂多功能试剂，使其形成，使其形成不溶性不溶性衍生物衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH pH 和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。此法和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。此法操作简单，一种多功能试剂可制备许多酶衍生物，操作简单，一种多功能试剂可制备许多酶衍生物，但缺乏选择性，难于避免分子内交联，活力回收但缺乏选择性，难于避免分子内交联，活力回收往往不高往往不高二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（三）（三）交联法交联法l交联法有交联法有5 5种形式种形式酶辅助蛋白交联酶辅助蛋白交联为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起失为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起失活，可使用活，可使用第二个第二个“载体载体”蛋白质蛋白质（即辅助蛋白质，如（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度增加蛋白质浓度，使酶，使酶与惰性蛋白质与惰性蛋白质共交联共交联。实用中，当酶蛋白、无酶活性蛋。实用中，当酶蛋白、无酶活性蛋白与戊二醛混合（戊二醛最终浓度白与戊二醛混合（戊二醛最终浓度0.7%0.7%）后，混合液粘）后，混合液粘度开始提高时，立即铺膜，或者在酶蛋白戊二醛与辅助度开始提高时，立即铺膜，或者在酶蛋白戊二醛与辅助蛋白混合后，经蛋白混合后，经-30-30低温处理，再预热至低温处理，再预热至44而得而得泡沫泡沫状蛋白质共聚物状蛋白质共聚物。这种固定化酶为。这种固定化酶为多孔性多孔性，活力回收比，活力回收比酶直接交联高，机械性能也有改进酶直接交联高，机械性能也有改进二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（三）（三）交联法交联法l交联法有交联法有5 5种形式种形式吸附交联法：先将酶吸附交联法：先将酶吸附吸附在硅胶、皂土、氧化铝、在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊戊二醛二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为为壳状固定化酶壳状固定化酶。此法用于。此法用于胞外酶胞外酶的固定化较好，尤的固定化较好，尤其是从发酵液和粗酶制剂中直接固定化时，载体的选其是从发酵液和粗酶制剂中直接固定化时，载体的选择性吸附有一定择性吸附有一定纯化作用纯化作用，而酶分子之间的共价交联，而酶分子之间的共价交联又保证酶分子紧紧地结合于载体上，而且酶分子仅存又保证酶分子紧紧地结合于载体上，而且酶分子仅存在于在于载体表面载体表面，使固定化酶与底物接触良好。由于载，使固定化酶与底物接触良好。由于载体本身有较好机械性能，所以产生的固定化酶体本身有较好机械性能，所以产生的固定化酶装柱流装柱流动性能好动性能好，缺点是必须保证酶吸附在载体上，缺点是必须保证酶吸附在载体上二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（三）（三）交联法交联法l交联法有交联法有5 5种形式种形式载体交联法：载体交联法：用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中另一部分功能基团偶连酶蛋白。也载体，而其中另一部分功能基团偶连酶蛋白。也可利用多功能试剂的一部分功能基团与一种聚合可利用多功能试剂的一部分功能基团与一种聚合物的单体反应，反应后再与酶一起共聚物的单体反应，反应后再与酶一起共聚二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（三）（三）交联法交联法l交联法有交联法有5 5种形式种形式交联包埋法：交联包埋法：把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很颗粒很细的集合体细的集合体，然后用，然后用高分子或多糖高分子或多糖一类物质进一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好时制得的固定化酶稳定性好 OHC(CH2)3CHO戊二醛戊二醛H2N-EN-HC=N-E-N=CH（CH2）3-CH=N-E-NCHCH戊二醛交联法戊二醛交联法缺点：缺点：l双功能基团试剂与酶蛋白的交联作用，常引起双功能基团试剂与酶蛋白的交联作用，常引起蛋白质高级结构的改变，使酶失活蛋白质高级结构的改变，使酶失活 为了避免或减少酶在交联过程中失活，可在被为了避免或减少酶在交联过程中失活，可在被交联的酶蛋白溶液中添加一定量的辅助蛋白交联的酶蛋白溶液中添加一定量的辅助蛋白二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（四）（四）化学共价法化学共价法l概念概念所谓共价法就是使酶蛋白的非必需所谓共价法就是使酶蛋白的非必需基团（基团（-NH2,-OH,-COOH,-SH,-NH2,-OH,-COOH,-SH,酚基，酚基，咪唑基，吲哚基）通过咪唑基，吲哚基）通过共价键共价键和和不不溶性载体溶性载体形成不可逆的联接。要使形成不可逆的联接。要使载体与酶形成共价键，必需首先使载体与酶形成共价键，必需首先使载体活化载体活化，接上一活泼基团，再与，接上一活泼基团，再与酶反应酶反应二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（四）（四）化学共价法化学共价法l用于共价法固定的酶蛋白上的功能基团用于共价法固定的酶蛋白上的功能基团 氨基氨基-赖氨酸上的赖氨酸上的-氨基以及多肽链氨基以及多肽链N N末端氨基酸上的末端氨基酸上的-氨基氨基羧基羧基-双羧基氨基酸双羧基氨基酸:门冬氨基酸和谷氨酸上的游离羧门冬氨基酸和谷氨酸上的游离羧基基,以及多肽链末端的以及多肽链末端的-羧基羧基酪氨酸上的苯酚环酪氨酸上的苯酚环半胱氨酸上的巯基半胱氨酸上的巯基羟基羟基-丝氨酸丝氨酸,苏氨酸以及酪氨酸上的羟基苏氨酸以及酪氨酸上的羟基组氨酸上的咪唑基组氨酸上的咪唑基色氨酸上的吲哚基色氨酸上的吲哚基其中以氨基和羧基为最常用其中以氨基和羧基为最常用二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（四）（四）化学共价法化学共价法l共价法的特点共价法的特点 酶和载体的结合比较牢固，酶不易脱落。故使用的酶和载体的结合比较牢固，酶不易脱落。故使用的半衰期较长半衰期较长 制备条件复杂，反应剧烈，易引起酶蛋白高级结构制备条件复杂，反应剧烈，易引起酶蛋白高级结构发生变化发生变化 制备得到的固定化酶，活力回收一般在制备得到的固定化酶，活力回收一般在50%50%左右左右 载体不会引起蛋白质的变性，经得起一定的载体不会引起蛋白质的变性，经得起一定的pHpH，浓度的改变浓度的改变二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（四）（四）化学共价法化学共价法l常用载体常用载体天然高分子：纤维素天然高分子：纤维素,葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（SephadexSephadex）,琼脂糖（琼脂糖（Agarose SepharoseAgarose Sepharose）,卡那胶卡那胶和和淀粉以及淀粉以及它们的衍生物（利用它们的衍生物（利用-OH-OH）人工合成的高聚物：聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，人工合成的高聚物：聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇，氨基酸共聚物等（利用聚乙烯醇，氨基酸共聚物等（利用-NH-NH2 2）无机载体：多孔玻璃，硅胶等（要加上一个基无机载体：多孔玻璃，硅胶等（要加上一个基团）团）二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（四）（四）化学共价法化学共价法l技术要点技术要点将所选用的载体上的有关基团活化，然后和将所选用的载体上的有关基团活化，然后和酶蛋白上有关基团发生偶联反应（直接活化酶蛋白上有关基团发生偶联反应（直接活化或另接一反应基团）或另接一反应基团）在选用的载体上接上一个双功能试剂，然后在选用的载体上接上一个双功能试剂，然后将酶蛋白和双功能试剂偶联（接手臂）将酶蛋白和双功能试剂偶联（接手臂）二、酶的固定化技术二、酶的固定化技术（四）（四）化学共价法化学共价法l分类分类重氮法重氮法叠氮法叠氮法缩合法缩合法烷化反应法烷化反应法硅烷化反应法硅烷化反应法溴化氰法溴化氰法 重氮法重氮法l多糖类芳香族氨基的载体多糖类芳香族氨基的载体，先用，先用NaNONaNO2 2和稀盐酸酸和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8-9)(pH8-9)条件下条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶与酚基、咪唑基生成重氮衍生物，过量重氮盐存在与酚基、咪唑基生成重氮衍生物，过量重氮盐存在下还可与酶蛋白的下还可与酶蛋白的N-N-端氨基或端氨基或LysLys的的 氨基形成双偶氨基形成双偶氮化合物氮化合物方法原理如下：方法原理如下：用双功能试剂用双功能试剂-硫酸硫酸酯乙砜基苯胺酯乙砜基苯胺（SESASESA），），连接于被活化（连接于被活化（-OH-OH）的）的纤维素等载体上制备成纤维素等载体上制备成ABSE-ABSE-纤维素，琼脂糖等纤维素，琼脂糖等 在盐酸和亚硝酸钠处理在盐酸和亚硝酸钠处理下把下把ABSE-ABSE-纤维素变成重纤维素变成重氮盐氮盐 把酶偶联于把酶偶联于ABSE-ABSE-纤维纤维素上素上 重氮法重氮法l氮基酸共聚体氮基酸共聚体。如。如L-LeuL-Leu和对氨基和对氨基-DLDL-苯丙氨酸共聚苯丙氨酸共聚物，共聚物与亚硝酸作用转变为重氮盐，可供酶固物，共聚物与亚硝酸作用转变为重氮盐，可供酶固定用。用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核定用。用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等糖核酸酶等 重氮法重氮法l聚丙烯酰胺衍生物聚丙烯酰胺衍生物。该类衍生物的商品名称为。该类衍生物的商品名称为biobioGelGel或或EnzacryEnzacry。如。如EnzacryIAAEnzacryIAA是含有芳香氨基的聚是含有芳香氨基的聚丙烯酰胺衍生物，经重氮化可固定酶。用此法制备丙烯酰胺衍生物，经重氮化可固定酶。用此法制备的有氨基酰化酶，淀粉酶等固定化酶的有氨基酰化酶，淀粉酶等固定化酶 重氮法重氮法l苯乙酰树脂苯乙酰树脂。这是。这是聚氨基苯乙烯聚氨基苯乙烯(a)(a)和一种和一种异丁烯异丁烯-间间-氨基苯乙烯氨基苯乙烯(b)(b)的共聚物，通过重氮化后可固定酶的共聚物，通过重氮化后可固定酶如胃蛋白酶、核糖核酸酶等如胃蛋白酶、核糖核酸酶等 重氮法重氮法l多孔玻璃的氨基硅烷衍生物多孔玻璃的氨基硅烷衍生物多孔玻璃在丙酮中与多孔玻璃在丙酮中与-氨基丙基三氧乙烷硅回流加氨基丙基三氧乙烷硅回流加热，生成烷基胺玻璃热，生成烷基胺玻璃烷基氨玻璃用烷基氨玻璃用对硝基苯酚氯对硝基苯酚氯处理后，再处理后，再还原还原，转变为芳香基衍生物转变为芳香基衍生物此芳香基衍生物经重氮化后与酶结合，产生固此芳香基衍生物经重氮化后与酶结合，产生固定化酶定化酶 叠氮法叠氮法l带有带有羧基羧基或或羟基羟基、羧甲基羧甲基等的载体，首先在酸性等的载体，首先在酸性条件下用甲醇处理使之条件下用甲醇处理使之酯化酯化，再用水合肼处理形，再用水合肼处理形成成酰肼酰肼，最后在，最后在HNOHNO3 3作用下转变成作用下转变成叠氮衍生物叠氮衍生物。此衍生物在低温下可与酶蛋白的此衍生物在低温下可与酶蛋白的羟基、酚基或巯羟基、酚基或巯基基等反应，但产物可用中性羟胺水解掉，使之仅等反应，但产物可用中性羟胺水解掉，使之仅与与-NH-NH2 2反应反应例：用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶例：用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶l 酯化酯化：CM-CM-纤维素依次用水、乙醇、乙醚洗涤干燥，纤维素依次用水、乙醇、乙醚洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl HCl 气体，进行气体，进行酯化反应；最后用甲醇、乙醚洗涤，空气干燥酯化反应；最后用甲醇、乙醚洗涤，空气干燥l 肼解肼解：把酯化后的把酯化后的CM-CM-纤维素悬于甲醇中，再加入纤维素悬于甲醇中，再加入80%80%水合肼回流反应水合肼回流反应1 1 小时，过滤，甲醇洗涤干燥小时，过滤，甲醇洗涤干燥l 叠氮化叠氮化：肼解后的肼解后的CM-CM-纤维素（纤维素（1g1g）加入）加入150ml 2%150ml 2%HCl HCl 在冰浴中混合，搅拌滴加在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3%NaNO9ml 3%NaNO2 2 反应反应20min20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，过滤用冷蒸馏水洗涤l(4)(4)偶联偶联：经叠氮化后的载体加入：经叠氮化后的载体加入0.05 M pH 8.0 0.05 M pH 8.0 磷酸缓磷酸缓冲液（内含冲液（内含250-500mg 250-500mg 酶），酶），55搅拌搅拌2-3 2-3 小时，用小时，用HClHCl凋凋pH 4pH 4，冷，冷0.001mol/L HCl0.001mol/L HCl洗三次，冷水洗一次，冻干，洗三次，冷水洗一次，冻干，即为固定化酶即为固定化酶 缩合法l对含-NH2,-COOH 载体的另一种方法，主要利用具有羧基或氨基的载体，加入到酶液中，在缩合剂碳化二亚胺（双环己基碳酰胺）作用下，使载体的羧基或氨基和酶蛋白上的NH2 或 COOH 形成肽链而被固定l含羧基的载体有羧甲基纤维素，羧甲基交联葡聚糖等l含氨基的载体有氨乙基纤维素，多孔玻璃氨基硅烷衍生物 烷基化反应法烷基化反应法将含有卤素官能团试剂与非水溶性的将含有卤素官能团试剂与非水溶性的纤维素纤维素载体进载体进行烷化反应，然后和酶进行偶联制得固定化酶。一行烷化反应，然后和酶进行偶联制得固定化酶。一般常用三氯三嗪基试剂活化纤维素，然后偶联酶般常用三氯三嗪基试剂活化纤维素，然后偶联酶（交联葡聚糖，琼脂糖，多孔玻璃等）（交联葡聚糖，琼脂糖，多孔玻璃等）硅烷化法l常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷l载体可以再生，寿命长等l多孔玻璃特点：机械强度好，表面积大耐有机溶剂和微生物破坏l这些多孔玻璃的孔径在2501000 埃之间，含SiO2 96%，由于粒度很细，每1 克所拥有的表面积达100 平方米（氧化钠，氧化硼，氧化硅经热处理原子重组而成，是优良载体，但必须加以改造）l见重氮法玻璃处理溴化氰溴化氰亚胺碳酸基反应亚胺碳酸基反应 l含有羟基的载体含有羟基的载体(如纤维素、葡聚糖、琼脂等如纤维素、葡聚糖、琼脂等)在碱性条件下，载体的羟基与在碱性条件下，载体的羟基与CNBrCNBr反应，生反应，生成活泼的成活泼的亚胺碳酸基亚胺碳酸基，在弱碱条件下，该化，在弱碱条件下，该化合物对蛋白质上的合物对蛋白质上的NHNH2 2 反应十分敏感，生成反应十分敏感，生成N-N-取代异脲取代异脲，N-N-取代亚氨碳酸酯取代亚氨碳酸酯和和N-N-取代氨取代氨基甲酸酯基甲酸酯。其中。其中主要产物为主要产物为N-N-取代异脲取代异脲例：胰蛋白酶的固定例：胰蛋白酶的固定-均在均在44时进行时进行 活化活化：称取琼脂糖凝胶：称取琼脂糖凝胶100mg100mg（Sepharose 4BSepharose 4B），用），用0.5M NaCl 0.5M NaCl 和和H H2 2O O 洗涤，除去保护剂和防腐剂，然后按洗涤，除去保护剂和防腐剂，然后按1ml 1ml 沉淀凝胶加入沉淀凝胶加入5050300mgCNBr300mgCNBr。立即用。立即用2N NaOH 2N NaOH 调调pH pH 值值10101111，维持，维持pH pH 值值1111，pH pH 值不再下降，直到反值不再下降，直到反应终止。反应在应终止。反应在2525通风橱内进行，反应仅需通风橱内进行，反应仅需10 10 分钟。分钟。反应完毕后，用冰水和冷反应完毕后，用冰水和冷0.1MpH9.5 NaHCO0.1MpH9.5 NaHCO3 3 洗涤（注洗涤（注意：切忌用带有意：切忌用带有-NH-NH2 2 基的缓冲液来洗涤，因为亚氨碳基的缓冲液来洗涤，因为亚氨碳酸盐对酸盐对NHNH2 2-敏感，在酶偶联时，活性部位被敏感，在酶偶联时，活性部位被NHNH2 2 占领，占领，酶偶联不上），去除多余酶偶联不上），去除多余CNBr CNBr 和杂蛋白和杂蛋白 偶联：用偶联缓冲液（偶联：用偶联缓冲液（0.025M pH 10.2 0.025M pH 10.2 硼酸硼酸缓冲液含缓冲液含0.02M CaCl0.02M CaCl2 2 或或NaHCONaHCO3 3 平衡洗涤，抽平衡洗涤，抽干，加入干，加入5ml 5ml 缓冲液（内含缓冲液（内含16mg 16mg 酶）温度降至酶）温度降至44，搅拌反应，搅拌反应4 4 小时，最后分别用小时，最后分别用0.1M pH8.5 0.1M pH8.5 硼酸缓冲液含硼酸缓冲液含1M NaCl 1M NaCl 洗涤即成，再用洗涤即成，再用pH 4.0 pH 4.0 醋酸缓冲液去除各种杂质醋酸缓冲液去除各种杂质第三节第三节 细胞的固定化方法细胞的固定化方法一、一、吸附法吸附法同酶的方法，（同酶的方法，（1 1）酵母细胞酵母细胞带负电荷，在带负电荷，在pH3-5pH3-5的条件的条件下能吸附在多孔陶瓷或多孔塑料等载体表面，制成固定下能吸附在多孔陶瓷或多孔塑料等载体表面，制成固定化细胞（化细胞（2 2）霉菌霉菌的菌丝可吸附在多孔塑料、金属丝网的菌丝可吸附在多孔塑料、金属丝网等载体上来固定化（等载体上来固定化（3 3）植物细胞植物细胞可吸附在中空纤维外可吸附在中空纤维外壁上固定化（壁上固定化（4 4）动物细胞动物细胞大多具有附壁生长特性，须大多具有附壁生长特性，须依附在固体表面才能生长，可吸附在容器壁，微载体依附在固体表面才能生长，可吸附在容器壁，微载体（颗粒细小的载体，直径（颗粒细小的载体，直径100-200um100-200um）和中空纤维外壁）和中空纤维外壁等载体上来固定（培养液在中空纤维内流动）等载体上来固定（培养液在中空纤维内流动）二、包埋法二、包埋法l同酶包埋法同酶包埋法l例：海藻酸钙例：海藻酸钙-聚赖氨酸（聚赖氨酸（ALG-PLLALG-PLL）包埋技术）包埋技术 动物细胞先用海藻酸钙凝胶包埋动物细胞先用海藻酸钙凝胶包埋聚赖氨酸处聚赖氨酸处理，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜理，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜柠檬柠檬酸钠溶液处理，使海藻酸钙凝胶溶解酸钠溶液处理，使海藻酸钙凝胶溶解聚赖氨聚赖氨酸膜包被的近乎透明的微囊型固定化动物细胞酸膜包被的近乎透明的微囊型固定化动物细胞第三节第三节 细胞的固定化方法细胞的固定化方法三、三、原生质体固定化原生质体固定化l可解决胞内酶的生产可解决胞内酶的生产l利于氧的传递，营养成分的吸收利于氧的传递，营养成分的吸收l一般采用凝胶包埋法一般采用凝胶包埋法l包括原生质体的制备和固定两个步骤包括原生质体的制备和固定两个步骤第三节第三节 细胞的固定化方法细胞的固定化方法三、原生质体固定化l原生质体的制备要求：保持膜的完整性，不能使细胞内部的结构遭到破坏制备：对数期细胞的收集高渗溶液中加酶破壁分离除去细胞碎片、完整的细胞及酶（密度梯度离心）原生质体第三节第三节 细胞的固定化方法细胞的固定化方法三、三、原生质体固定化原生质体固定化l原生质体的固定原生质体的固定原生质体原生质体等渗缓冲液中配成一定浓度的原生质等渗缓冲液中配成一定浓度的原生质体悬浮液体悬浮液凝胶包埋凝胶包埋l角叉菜胶固定化角叉菜胶固定化 含渗透压稳定剂的缓冲液与角叉菜加热溶解配含渗透压稳定剂的缓冲液与角叉菜加热溶解配成成3%-8%3%-8%的凝胶的凝胶灭菌灭菌冷却到冷却到5050左右与等左右与等体积的原生质体悬浮液混合均匀体积的原生质体悬浮液混合均匀滴入到一定滴入到一定浓度的预冷的氯化钾溶液中浓度的预冷的氯化钾溶液中球状的固定化原球状的固定化原生质体生质体三、三、原生质体固定化原生质体固定化l原生质体的固定原生质体的固定光交联树脂固定化法光交联树脂固定化法用含有渗透压稳定剂的缓冲液配制用含有渗透压稳定剂的缓冲液配制30%-60%30%-60%浓度浓度的光交联树脂预聚体，加热溶解后，在的光交联树脂预聚体，加热溶解后，在5050左右，左右，加入加入1%1%光敏剂，与等体积的原生质体悬浮液混光敏剂，与等体积的原生质体悬浮液混合均匀，摊成薄层，经紫外光照射合均匀，摊成薄层，经紫外光照射2-3mm2-3mm，聚合，聚合后切成一定形状的小块，制成片状的固定化原生后切成一定形状的小块，制成片状的固定化原生质体。质体。第四节 固定化酶的评价l 游离的酶游离的酶(细胞细胞)被固定化以后被固定化以后,酶的催化性酶的催化性质也会发生变化，为考察它的性质可以通过质也会发生变化，为考察它的性质可以通过测定固定化酶的各种参数测定固定化酶的各种参数,来判断固定化方法来判断固定化方法的优劣及其固定化酶的实用性的优劣及其固定化酶的实用性一、相对酶活力一、相对酶活力 l具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值称为相对酶活力的比值称为相对酶活力,它与载体的体结构、它与载体的体结构、颗粒大小、底物分子量大小及酶的结合效率颗粒大小、底物分子量大小及酶的结合效率有关有关l相对酶活力低于相对酶活力低于75%75%的固定化酶的固定化酶,一般没有实一般没有实际应用价值际应用价值第四节 固定化酶的评价二、酶的活力二、酶的活力l固定化的单位定义为：转化底物的量固定化的单位定义为：转化底物的量/固定固定化酶的单位重量（单位面积）化酶的单位重量（单位面积）/单位时间单位时间,单单位是：位是：mol/mg(cmmol/mg(cm2 2)/min)/minl将酶进行固定化时将酶进行固定化时,总有一部分酶没有与载总有一部分酶没有与载体结合在一起体结合在一起,测定酶的活力回收率可以确测定酶的活力回收率可以确定固定化的效果定固定化的效果第四节 固定化酶的评价二、酶的活力二、酶的活力l活力回收活力回收=固定化酶总活力固定化酶总活力/被固定化游离酶总被固定化游离酶总活力活力100%100%，或称偶联效率、活力保留百分，或称偶联效率、活力保留百分数数l一般情况下一般情况下,活力回收率应小于活力回收率应小于1,1,若大于若大于1,1,可能可能由于固定化活细胞增殖或某些抑制因素排除的由于固定化活细胞增殖或某些抑制因素排除的结果结果 第四节 固定化酶的评价三、固定化酶的半衰期三、固定化酶的半衰期 l即固定化酶的活力下降为初始活力一半所即固定化酶的活力下降为初始活力一半所经历的时间经历的时间l它是衡量固定化酶操作稳定性的关键，其它是衡量固定化酶操作稳定性的关键，其测定方法与化工催化剂半衰期的测定方法测定方法与化工催化剂半衰期的测定方法相似相似,也可以通过长期实际操作也可以通过长期实际操作,也可以通过也可以通过较短时间的操作来推算较短时间的操作来推算 第四节 固定化酶的评价第五节第五节 固定化酶的性质固定化酶的性质l在水溶液中游离酶分子在水溶液中游离酶分子与底物同处于液相，十与底物同处于液相，十分邻近，而酶被