重组技术与基因操作.pptx

基因工程研究的理论依据基因工程研究的理论依据n n不同基因具有相同的物质基础不同基因具有相同的物质基础n n基因是可以切割的基因是可以切割的n n基因是可以转移的基因是可以转移的n n多肽与基因之间存在对应关系多肽与基因之间存在对应关系n n遗传密码是通用的遗传密码是通用的n n基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代DNADNA重组技术要有四重组技术要有四个必要条件：个必要条件：工具酶、工具酶、基因、基因、载体、载体、受体细胞受体细胞n nDNA限制性内切酶可分为三类：限制性内切酶可分为三类：、n n、酶在基因工程中基本不用酶在基因工程中基本不用,why?,why?第一节限制性内切酶限限制制性性内内切切酶酶是是从从细细菌菌中中分分离离提提纯纯的的核核酸酸内内切切酶酶，可可以以识别并切开核酸序列特定位点识别并切开核酸序列特定位点分子手术刀分子手术刀ArberArber、SmithSmith和和NathansNathans因因为为在在发发现现限限制制性性内内切切酶酶方方面面开开创性工作而共同获得了创性工作而共同获得了19781978年的诺贝尔奖。年的诺贝尔奖。n n、限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖于作用及依赖于作用及依赖于作用及依赖于ATPATPATPATP的限制性内切酶活性。的限制性内切酶活性。的限制性内切酶活性。的限制性内切酶活性。n n类酶结合于特定的识别位点，但却没有特定的切类酶结合于特定的识别位点，但却没有特定的切类酶结合于特定的识别位点，但却没有特定的切类酶结合于特定的识别位点，但却没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的、特异性切割末端。稳定的、特异性切割末端。稳定的、特异性切割末端。稳定的、特异性切割末端。n n类酶在识别位点上切割类酶在识别位点上切割类酶在识别位点上切割类酶在识别位点上切割DNADNADNADNA，然后从底物上解离，然后从底物上解离，然后从底物上解离，然后从底物上解离下来。下来。下来。下来。核酸内切限制酶的类型及其主要特性核酸内切限制酶的类型及其主要特性特性特性特性特性I I型型型型IIII型型型型IIIIII型型型型限制和修饰活性限制和修饰活性限制和修饰活性限制和修饰活性单一多功能的酶单一多功能的酶单一多功能的酶单一多功能的酶分开的核酸内切酶分开的核酸内切酶分开的核酸内切酶分开的核酸内切酶和甲基化酶和甲基化酶和甲基化酶和甲基化酶 具有一种共同亚基具有一种共同亚基具有一种共同亚基具有一种共同亚基的双功能的酶的双功能的酶的双功能的酶的双功能的酶核酸内切限制酶的核酸内切限制酶的核酸内切限制酶的核酸内切限制酶的蛋白质结构蛋白质结构蛋白质结构蛋白质结构3 3种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基单一的成份单一的成份单一的成份单一的成份 2 2种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基 切割位点切割位点切割位点切割位点在距寄主特异性位在距寄主特异性位在距寄主特异性位在距寄主特异性位点至少点至少点至少点至少1000bp1000bp的地的地的地的地方可能随机地切割方可能随机地切割方可能随机地切割方可能随机地切割位于寄主特异性位位于寄主特异性位位于寄主特异性位位于寄主特异性位点或其附近点或其附近点或其附近点或其附近 距寄主特异性位点距寄主特异性位点距寄主特异性位点距寄主特异性位点3 3，端端端端2426bp2426bp处处处处甲基化作用的位点甲基化作用的位点甲基化作用的位点甲基化作用的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点识别未甲基化的序识别未甲基化的序识别未甲基化的序识别未甲基化的序列进行核酸内切酶列进行核酸内切酶列进行核酸内切酶列进行核酸内切酶切割切割切割切割 能能能能 能能能能能能能能序列特异的切割序列特异的切割序列特异的切割序列特异的切割不是不是不是不是是是是是是是是是DNADNADNADNA克隆中的用处克隆中的用处克隆中的用处克隆中的用处无用无用无用无用十分有用十分有用十分有用十分有用用处不大用处不大用处不大用处不大一、II类限制性内切酶的特点n n识别特定的核苷酸序列识别特定的核苷酸序列识别特定的核苷酸序列识别特定的核苷酸序列，其长度一般为，其长度一般为，其长度一般为，其长度一般为4 4 4 4、5 5 5 5或或或或6 6 6 6个个个个核苷酸且呈二重对称，但有少数酶识别更长的序核苷酸且呈二重对称，但有少数酶识别更长的序核苷酸且呈二重对称，但有少数酶识别更长的序核苷酸且呈二重对称，但有少数酶识别更长的序列或兼并序列列或兼并序列列或兼并序列列或兼并序列；n n具有特定的酶切位点具有特定的酶切位点具有特定的酶切位点具有特定的酶切位点 ，产生出特定的酶切末端产生出特定的酶切末端产生出特定的酶切末端产生出特定的酶切末端5555 突出粘末端、突出粘末端、突出粘末端、突出粘末端、3 3 3 3 突出粘末端、平末端；突出粘末端、平末端；突出粘末端、平末端；突出粘末端、平末端；n n类限制修饰系统是由两种酶分子组成的二元类限制修饰系统是由两种酶分子组成的二元类限制修饰系统是由两种酶分子组成的二元类限制修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统；系统；系统；系统；限制性内切酶、独立的甲基化酶。限制性内切酶、独立的甲基化酶。限制性内切酶、独立的甲基化酶。限制性内切酶、独立的甲基化酶。被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，两条单链的切口，带有几个伸出的核苷带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互酸，它们之间正好互补配对，这样的切口补配对，这样的切口叫做叫做 粘性末端。粘性末端。EcoEcoRIRI特特异异识识别别GAATTCGAATTC及及其其互互补补碱碱基组成的双链片段基组成的双链片段SmaSma特异识别特异识别CCCGGG,CCCGGG,形成平形成平末端末端5CCCGGG3GGGCCC5CCCGGGGGG3CCC二、使用限制性内切酶时应注意的问题1 1、仔细查阅酶的识别序列和切割位点。、仔细查阅酶的识别序列和切割位点。、仔细查阅酶的识别序列和切割位点。、仔细查阅酶的识别序列和切割位点。n n同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的限同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的限同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的限同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的限制性内切酶。制性内切酶。制性内切酶。制性内切酶。n n同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序列，同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序列，同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序列，同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序列，但切割后但切割后但切割后但切割后DNADNADNADNA分子所产生的粘性末端却相同，这类酶为具不分子所产生的粘性末端却相同，这类酶为具不分子所产生的粘性末端却相同，这类酶为具不分子所产生的粘性末端却相同，这类酶为具不同酶切位点的同酶切位点的同酶切位点的同酶切位点的DNADNADNADNA片段重组提供了方便片段重组提供了方便片段重组提供了方便片段重组提供了方便，但要注意，往往相但要注意，往往相但要注意，往往相但要注意，往往相容的粘性末端再用容的粘性末端再用容的粘性末端再用容的粘性末端再用DNADNADNADNA连接酶连接后，都不能再被其切割了。连接酶连接后，都不能再被其切割了。连接酶连接后，都不能再被其切割了。连接酶连接后，都不能再被其切割了。2、注意酶反应条件，相同反应条件的酶可以同时酶注意酶反应条件，相同反应条件的酶可以同时酶注意酶反应条件，相同反应条件的酶可以同时酶注意酶反应条件，相同反应条件的酶可以同时酶解解解解DNADNA样品。样品。样品。样品。3 3、注意说明书中所列出的、注意说明书中所列出的、注意说明书中所列出的、注意说明书中所列出的commentscomments的内容，会提的内容，会提的内容，会提的内容，会提供有关限制性内切酶识别序列中位点特异性甲基供有关限制性内切酶识别序列中位点特异性甲基供有关限制性内切酶识别序列中位点特异性甲基供有关限制性内切酶识别序列中位点特异性甲基化的信息以及引起酶产生化的信息以及引起酶产生化的信息以及引起酶产生化的信息以及引起酶产生star activitystar activity的原因。的原因。的原因。的原因。staractivity：指当酶的反应条件改变时，其在识别：指当酶的反应条件改变时，其在识别序列中的酶切位点发生改变。序列中的酶切位点发生改变。产生的原因：反应体系中甘油的浓度产生的原因：反应体系中甘油的浓度12；酶：；酶：DNA比率比率25u/g；缺少；缺少Nacl和存在和存在Mn2。4 4、注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。、注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。、注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。、注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。n n一般以在一般以在一般以在一般以在20l20l20l20l反应体积中，反应体积中，反应体积中，反应体积中，37373737，每小时水解，每小时水解，每小时水解，每小时水解1 1 1 1微克微克微克微克DNADNADNADNA的的的的酶量定为一个酶单位。酶量定为一个酶单位。酶量定为一个酶单位。酶量定为一个酶单位。5 5、注意酶在保温过程中的活性变化。、注意酶在保温过程中的活性变化。、注意酶在保温过程中的活性变化。、注意酶在保温过程中的活性变化。n nACCACCACCACC在在在在5 5 5 5 小时内具有全部活力小时内具有全部活力小时内具有全部活力小时内具有全部活力n nBamHBamHBamHBamH在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具有部在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具有部在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具有部在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具有部分活力，而在分活力，而在分活力，而在分活力，而在2 2 2 2小时以后就无活力了。小时以后就无活力了。小时以后就无活力了。小时以后就无活力了。n nCfoCfoCfoCfo仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后就没仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后就没仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后就没仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后就没有活力了。有活力了。有活力了。有活力了。三、连接酶三、连接酶三、连接酶三、连接酶n n定义：用于将两端乃至数段定义：用于将两端乃至数段定义：用于将两端乃至数段定义：用于将两端乃至数段DNADNA片段拼接起来的酶。片段拼接起来的酶。片段拼接起来的酶。片段拼接起来的酶。n n用途：用途：用途：用途：（1 1）、连接带匹配粘末端的）、连接带匹配粘末端的）、连接带匹配粘末端的）、连接带匹配粘末端的DNADNA分子；分子；分子；分子；（2 2）、使平末端的双链）、使平末端的双链）、使平末端的双链）、使平末端的双链DNADNA分子相互连接或与合成的分子相互连接或与合成的分子相互连接或与合成的分子相互连接或与合成的寡核苷酸接头相连接。寡核苷酸接头相连接。寡核苷酸接头相连接。寡核苷酸接头相连接。这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离子这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离子这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离子这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离子（150-200mmol/LNacl150-200mmol/LNacl150-200mmol/LNacl150-200mmol/LNacl）或低浓度的聚乙二醇（）或低浓度的聚乙二醇（）或低浓度的聚乙二醇（）或低浓度的聚乙二醇（PEGPEGPEGPEG）可提高连接效率。可提高连接效率。可提高连接效率。可提高连接效率。DNA连接酶连接的部位连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。不是氢键（梯子的踏板）。四、修饰酶四、修饰酶1 1、DNADNA聚合酶：聚合酶：聚合酶：聚合酶：n n大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I，大肠杆菌，大肠杆菌，大肠杆菌，大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I大片段大片段大片段大片段（klenow fragmentklenow fragment）、）、）、）、T4T4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶、聚合酶、聚合酶、聚合酶、T7T7噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶、耐高温聚合酶、耐高温聚合酶、耐高温聚合酶、耐高温DNADNA聚合酶（如聚合酶（如聚合酶（如聚合酶（如TaqDNATaqDNA聚合酶）、反聚合酶）、反聚合酶）、反聚合酶）、反转录酶、末端脱氧核苷酸转移酶等转录酶、末端脱氧核苷酸转移酶等转录酶、末端脱氧核苷酸转移酶等转录酶、末端脱氧核苷酸转移酶等2 2、依赖于、依赖于、依赖于、依赖于DNADNA的的的的RNARNA聚合酶：聚合酶：聚合酶：聚合酶：n nSP6SP6噬菌体及噬菌体及噬菌体及噬菌体及T7T7和和和和T3T3噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶n n用途用途用途用途:在在在在in vitroin vitro条件，合成单链条件，合成单链条件，合成单链条件，合成单链RNARNA作为杂交探针。作为杂交探针。作为杂交探针。作为杂交探针。3 3、T4T4噬菌体多核苷酸激酶：噬菌体多核苷酸激酶：噬菌体多核苷酸激酶：噬菌体多核苷酸激酶：n n催化催化催化催化ATPATP的的的的 磷酸基转移至磷酸基转移至磷酸基转移至磷酸基转移至DNADNA或或或或RNARNA片段的片段的片段的片段的5 5 末末末末端。端。端。端。n n用途：标记用途：标记用途：标记用途：标记DNADNA片段的片段的片段的片段的5 5 端端端端，制备杂交探针；基因化，制备杂交探针；基因化，制备杂交探针；基因化，制备杂交探针；基因化学合成中，寡核苷酸片段学合成中，寡核苷酸片段学合成中，寡核苷酸片段学合成中，寡核苷酸片段5 5 磷酸化；用于测序引物磷酸化；用于测序引物磷酸化；用于测序引物磷酸化；用于测序引物的的的的5 5 标记。标记。标记。标记。5HOOH3HOOH355突出末端突出末端5隐蔽末端隐蔽末端532POH3HO32P3532PATP4 4、碱性磷酸酶：、碱性磷酸酶：、碱性磷酸酶：、碱性磷酸酶：n n用途：用途：用途：用途：n n去除去除去除去除DNADNA片段片段片段片段5 5 末端的磷酸，以防止在重组中自身末端的磷酸，以防止在重组中自身末端的磷酸，以防止在重组中自身末端的磷酸，以防止在重组中自身环化，从而提高重组效率；环化，从而提高重组效率；环化，从而提高重组效率；环化，从而提高重组效率；n n在用在用在用在用 32p32pATPATP标记标记标记标记DNADNA或或或或RNARNA的的的的5 5 末端前，末端前，末端前，末端前，去除去除去除去除DNADNA或或或或RNARNA片段的非标记的片段的非标记的片段的非标记的片段的非标记的5 5 磷酸。磷酸。磷酸。磷酸。5POH3HOP355突出末端突出末端5隐蔽末端隐蔽末端OHHO5HOOH335第二节克隆载体基因工程载体应具备的条件：基因工程载体应具备的条件：基因工程载体应具备的条件：基因工程载体应具备的条件：n n能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制；能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制；能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制；能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制；n n具有合适的限制性内切酶位点：具有合适的限制性内切酶位点：具有合适的限制性内切酶位点：具有合适的限制性内切酶位点：在载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不同限在载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不同限在载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不同限在载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不同限制性内切酶切割后的外源制性内切酶切割后的外源制性内切酶切割后的外源制性内切酶切割后的外源DNADNADNADNA片段方便的插入载体片段方便的插入载体片段方便的插入载体片段方便的插入载体；n n在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增；在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增；在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增；在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增；n n载体的分子量要小，这样可以容纳较大的外源载体的分子量要小，这样可以容纳较大的外源载体的分子量要小，这样可以容纳较大的外源载体的分子量要小，这样可以容纳较大的外源DNADNA插入片段：插入片段：插入片段：插入片段：n n在细胞内稳定性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失；在细胞内稳定性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失；在细胞内稳定性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失；在细胞内稳定性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失；n n应该有一个或多个选择标记。应该有一个或多个选择标记。应该有一个或多个选择标记。应该有一个或多个选择标记。大肠杆菌表达载体应具备：大肠杆菌表达载体应具备：大肠杆菌表达载体应具备：大肠杆菌表达载体应具备：n n强的启动子强的启动子强的启动子强的启动子，一个强的可诱导的启动子可使外源基，一个强的可诱导的启动子可使外源基，一个强的可诱导的启动子可使外源基，一个强的可诱导的启动子可使外源基因有效的转录；因有效的转录；因有效的转录；因有效的转录；n n在启动子下游区和在启动子下游区和在启动子下游区和在启动子下游区和ATGATG（起始密码子）上游区有一（起始密码子）上游区有一（起始密码子）上游区有一（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（个好的核糖体结合位点序列（个好的核糖体结合位点序列（个好的核糖体结合位点序列（SDSD）；）；）；）；n n在外源基因插入序列的下游区要有一个在外源基因插入序列的下游区要有一个在外源基因插入序列的下游区要有一个在外源基因插入序列的下游区要有一个强的转录终强的转录终强的转录终强的转录终止序列止序列止序列止序列，保证外源基因的有效转录和质粒的稳定性。，保证外源基因的有效转录和质粒的稳定性。，保证外源基因的有效转录和质粒的稳定性。，保证外源基因的有效转录和质粒的稳定性。一、质粒一、质粒(plasmid)(plasmid)n n定义：质粒是能自主复制的双链环状定义：质粒是能自主复制的双链环状定义：质粒是能自主复制的双链环状定义：质粒是能自主复制的双链环状DNADNADNADNA分子，分子，分子，分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。AOCSCLn nF F F F质粒：质粒：质粒：质粒：有些携带有帮助其自身从一个细胞转入另有些携带有帮助其自身从一个细胞转入另有些携带有帮助其自身从一个细胞转入另有些携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息的质粒。一个细胞的信息的质粒。一个细胞的信息的质粒。一个细胞的信息的质粒。n nR R R R质粒质粒质粒质粒：表达对一种抗生素的抗性的质粒。：表达对一种抗生素的抗性的质粒。：表达对一种抗生素的抗性的质粒。：表达对一种抗生素的抗性的质粒。n n降解质粒降解质粒降解质粒降解质粒：携带参与或控制一些不同寻常的代谢途：携带参与或控制一些不同寻常的代谢途：携带参与或控制一些不同寻常的代谢途：携带参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因的质粒。径的基因的质粒。径的基因的质粒。径的基因的质粒。n n穿梭载体穿梭载体穿梭载体穿梭载体：在大肠杆菌的载体上放上第二个复制起：在大肠杆菌的载体上放上第二个复制起：在大肠杆菌的载体上放上第二个复制起：在大肠杆菌的载体上放上第二个复制起始位点，使它在另一个宿主细胞中也能进行复制始位点，使它在另一个宿主细胞中也能进行复制始位点，使它在另一个宿主细胞中也能进行复制始位点，使它在另一个宿主细胞中也能进行复制。1 1、质粒载体、质粒载体、质粒载体、质粒载体pBR322pBR322n n特点特点特点特点1 1 1 1）大小为）大小为）大小为）大小为4363bp4363bp4363bp4363bp；2 2 2 2）含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）；）含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）；）含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）；）含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）；3 3 3 3）有单一的）有单一的）有单一的）有单一的BamHBamHBamHBamH、HindHindHindHind和和和和SalSalSalSal的识别位点（在四环的识别位点（在四环的识别位点（在四环的识别位点（在四环素抗性基因内）、素抗性基因内）、素抗性基因内）、素抗性基因内）、PstPstPstPst识别位点（在氨苄青霉素抗识别位点（在氨苄青霉素抗识别位点（在氨苄青霉素抗识别位点（在氨苄青霉素抗性基因内）；性基因内）；性基因内）；性基因内）；外源片段在外源片段在外源片段在外源片段在BamHBamHBamHBamH、HindHindHindHind、PstPstPstPst位点插入时，可引起位点插入时，可引起位点插入时，可引起位点插入时，可引起抗生素失活来筛选重组体抗生素失活来筛选重组体抗生素失活来筛选重组体抗生素失活来筛选重组体。4 4 4 4）带有一个复制起始点，可以保证这个质粒只在大肠杆）带有一个复制起始点，可以保证这个质粒只在大肠杆）带有一个复制起始点，可以保证这个质粒只在大肠杆）带有一个复制起始点，可以保证这个质粒只在大肠杆菌里行使复制功能，在大肠杆菌里菌里行使复制功能，在大肠杆菌里菌里行使复制功能，在大肠杆菌里菌里行使复制功能，在大肠杆菌里pBR322pBR322pBR322pBR322以高拷贝数以高拷贝数以高拷贝数以高拷贝数存在。存在。存在。存在。2 2 2 2、质粒载体、质粒载体、质粒载体、质粒载体pUC19pUC19pUC19pUC191 1 1 1）特征）特征）特征）特征n n大小为大小为大小为大小为2686bp2686bp2686bp2686bp；n n带有带有带有带有pBR322pBR322pBR322pBR322的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因；基因；基因；基因；n n一个大肠杆菌乳糖操纵子一个大肠杆菌乳糖操纵子一个大肠杆菌乳糖操纵子一个大肠杆菌乳糖操纵子半乳糖苷酶基因的调半乳糖苷酶基因的调半乳糖苷酶基因的调半乳糖苷酶基因的调节片段（节片段（节片段（节片段（lacZlacZlacZlacZ）,一个调节一个调节一个调节一个调节lacZlacZlacZlacZ 基因表达的阻基因表达的阻基因表达的阻基因表达的阻遏蛋白的基因遏蛋白的基因遏蛋白的基因遏蛋白的基因lacIlacIlacIlacI；n n含有多个单克隆位点。含有多个单克隆位点。含有多个单克隆位点。含有多个单克隆位点。2 2 2 2）pUC19pUC19pUC19pUC19的筛选：的筛选：的筛选：的筛选：n n培养基中含有异丙基硫代半乳糖苷（培养基中含有异丙基硫代半乳糖苷（培养基中含有异丙基硫代半乳糖苷（培养基中含有异丙基硫代半乳糖苷（IPTGIPTGIPTGIPTG，laclaclaclac操纵操纵操纵操纵子的一个诱导物）时，子的一个诱导物）时，子的一个诱导物）时，子的一个诱导物）时，lacIlacIlacIlacI的产物就不能与的产物就不能与的产物就不能与的产物就不能与lacZlacZlacZlacZ 的启动子区域结合，质粒的启动子区域结合，质粒的启动子区域结合，质粒的启动子区域结合，质粒pUC19pUC19pUC19pUC19的的的的lacZlacZlacZlacZ 就可以转录，就可以转录，就可以转录，就可以转录，进而翻译，进而翻译，进而翻译，进而翻译，lacZlacZlacZlacZ蛋白会与染色体蛋白会与染色体蛋白会与染色体蛋白会与染色体DNADNADNADNA编码的一个蛋白编码的一个蛋白编码的一个蛋白编码的一个蛋白形成具有活性的杂合形成具有活性的杂合形成具有活性的杂合形成具有活性的杂合半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。n n在底物在底物在底物在底物5 5 5 5溴溴溴溴4 4 4 4氯氯氯氯3 3 3 3吲哚吲哚吲哚吲哚半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（X-X-X-X-galgalgalgal）存在下，）存在下，）存在下，）存在下，X-galX-galX-galX-gal会被杂合会被杂合会被杂合会被杂合半乳糖苷酶水解半乳糖苷酶水解半乳糖苷酶水解半乳糖苷酶水解成蓝色的产物，没有插入外源成蓝色的产物，没有插入外源成蓝色的产物，没有插入外源成蓝色的产物，没有插入外源DNADNADNADNA序列的序列的序列的序列的pUC19pUC19pUC19pUC19质粒质粒质粒质粒克隆就呈蓝色。克隆就呈蓝色。克隆就呈蓝色。克隆就呈蓝色。n n由于由于由于由于pUC19pUC19pUC19pUC19的单克隆位点的序列是整合在的单克隆位点的序列是整合在的单克隆位点的序列是整合在的单克隆位点的序列是整合在lacZlacZlacZlacZ 之中之中之中之中的，若的，若的，若的，若pUC19pUC19pUC19pUC19质粒中插入有目的质粒中插入有目的质粒中插入有目的质粒中插入有目的DNADNADNADNA片段，就会破环片段，就会破环片段，就会破环片段，就会破环lacZlacZlacZlacZ 的结构，导致细胞无法产生功能性的的结构，导致细胞无法产生功能性的的结构，导致细胞无法产生功能性的的结构，导致细胞无法产生功能性的lacZlacZlacZlacZ蛋蛋蛋蛋白，也就无法形成杂合的白，也就无法形成杂合的白，也就无法形成杂合的白，也就无法形成杂合的半乳糖苷酶，因而菌半乳糖苷酶，因而菌半乳糖苷酶，因而菌半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。落是白色的。落是白色的。落是白色的。穿梭质粒穿梭质粒:人工人工构建的具有两种构建的具有两种不同复制起点和不同复制起点和选择记号，可在选择记号，可在两种不同的寄主两种不同的寄主细胞中存活和复细胞中存活和复制的质粒载体制的质粒载体。二、二、噬菌体噬菌体噬菌体可以进入裂解循环，噬菌体可以进入裂解循环，噬菌体可以进入裂解循环，噬菌体可以进入裂解循环，20202020分钟后就可使宿主分钟后就可使宿主分钟后就可使宿主分钟后就可使宿主细胞发生裂解，同时释放出大约细胞发生裂解，同时释放出大约细胞发生裂解，同时释放出大约细胞发生裂解，同时释放出大约100100100100个噬菌体颗粒。个噬菌体颗粒。个噬菌体颗粒。个噬菌体颗粒。噬菌体也可以进入溶源循噬菌体也可以进入溶源循环，即注入的环，即注入的DNADNA整合到大整合到大肠杆菌的染色体中，以前噬肠杆菌的染色体中，以前噬菌体的形式潜伏起来，永久菌体的形式潜伏起来，永久保留。保留。噬菌体噬菌体DNADNA大约长大约长50kb50kb，其中大约，其中大约20kb20kb对于整对于整合切割过程极为关键，称为整合切割合切割过程极为关键，称为整合切割（I/EI/E）区域。）区域。对于构建文库，可将这对于构建文库，可将这20kbDNA20kbDNA片段去片段去掉，强迫重组的掉，强迫重组的噬菌体进入裂解循环。噬菌体进入裂解循环。整合切割区域整合切割区域尾部尾部基因基因头部头部基因基因粘性粘性末端末端粘性粘性末端末端负责负责DNA复复制的基因制的基因细胞裂细胞裂解基因解基因噬菌体的噬菌体的DNA示意图示意图左臂左臂右臂右臂噬菌体头的大小足以装下噬菌体头的大小足以装下噬菌体头的大小足以装下噬菌体头的大小足以装下50kb50kb50kb50kb单元的线性单元的线性单元的线性单元的线性DNADNADNADNA，DNA38kb DNA38kb DNA38kb DNA52kb,DNA52kb,DNA52kb,DNA52kb,则无法包装进头部。则无法包装进头部。则无法包装进头部。则无法包装进头部。coscoscoscos位点（位点（位点（位点（cos sitecos sitecos sitecos site）就是保证在超长线性就是保证在超长线性就是保证在超长线性就是保证在超长线性DNADNADNADNA分子分子分子分子上每两个上每两个上每两个上每两个coscoscoscos位点之间为位点之间为位点之间为位点之间为50kb,50kb,50kb,50kb,使使使使DNADNADNADNA分子能正确的装分子能正确的装分子能正确的装分子能正确的装配进噬菌体配进噬菌体配进噬菌体配进噬菌体。在头的入口处有一种酶，它能在头的入口处有一种酶，它能在头的入口处有一种酶，它能在头的入口处有一种酶，它能识别双链线性识别双链线性识别双链线性识别双链线性DNADNADNADNA分子上的分子上的分子上的分子上的coscoscoscos序列，并在序列，并在序列，并在序列，并在coscoscoscos序列处序列处序列处序列处切断切断切断切断DNADNADNADNA分子，使适当大小的分子，使适当大小的分子，使适当大小的分子，使适当大小的DNADNADNADNA进入噬菌体的头部。进入噬菌体的头部。进入噬菌体的头部。进入噬菌体的头部。噬菌体噬菌体DNA分子示意图分子示意图三、柯斯质粒（三、柯斯质粒（三、柯斯质粒（三、柯斯质粒（cosmidcosmidcosmidcosmid）n n可携带可携带可携带可携带40kb40kb40kb40kb大小的大小的大小的大小的DNADNADNADNA片段，并在大肠杆菌中复片段，并在大肠杆菌中复片段，并在大肠杆菌中复片段，并在大肠杆菌中复制保存，制保存，制保存，制保存，综合了质粒载体和噬菌体载体二者的综合了质粒载体和噬菌体载体二者的综合了质粒载体和噬菌体载体二者的综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优势。优势。优势。优势。n n柯斯质粒上带有多个单克隆位点、两个柯斯质粒上带有多个单克隆位点、两个柯斯质粒上带有多个单克隆位点、两个柯斯质粒上带有多个单克隆位点、两个coscoscoscos位点、位点、位点、位点、DNADNADNADNA复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个coscoscoscos位点之间含有一个限制性内切酶位点（位点之间含有一个限制性内切酶位点（位点之间含有一个限制性内切酶位点（位点之间含有一个限制性内切酶位点（RERERERE）。）。）。）。应用柯斯质粒载体进行基因克隆的一般程序应用柯斯质粒载体进行基因克隆的一般程序利用柯斯质粒克隆大片段利用柯斯质粒克隆大片段DNA四、四、四、四、YACYACYACYAC载体载体载体载体1 1 1 1、目前能容纳最大外源、目前能容纳最大外源、目前能容纳最大外源、目前能容纳最大外源DNADNADNADNA片段的载体是片段的载体是片段的载体是片段的载体是YACYACYACYAC（酵母（酵母（酵母（酵母 人工染色体，人工染色体，人工染色体，人工染色体，yeast artificial chromosomeyeast artificial chromosomeyeast artificial chromosomeyeast artificial chromosome）。）。）。）。2 2 2 2、真核生物染色体三个关键部分：、真核生物染色体三个关键部分：、真核生物染色体三个关键部分：、真核生物染色体三个关键部分：n n着丝粒着丝粒着丝粒着丝粒（centromere,centromere,centromere,centromere,CENCENCENCEN）,它主管染色体在细它主管染色体在细它主管染色体在细它主管染色体在细胞分裂过程中正确的分配到各子细胞中；胞分裂过程中正确的分配到各子细胞中；胞分裂过程中正确的分配到各子细胞中；胞分裂过程中正确的分配到各子细胞中；n n端粒端粒端粒端粒（telomere,telomere,telomere,telomere,TELTELTELTEL）,位于染色体的末端，对位于染色体的末端，对位于染色体的末端，对位于染色体的末端，对染色体末端的复制以及防止染色体被核酸外切酶染色体末端的复制以及防止染色体被核酸外切酶染色体末端的复制以及防止染色体被核酸外切酶染色体末端的复制以及防止染色体被核酸外切酶切断具有重要的意义；切断具有重要的意义；切断具有重要的意义；切断具有重要的意义；n n自主复制序列自主复制序列自主复制序列自主复制序列（autonomously replicating autonomously replicating autonomously replicating autonomously replicating sequence,sequence,sequence,sequence,ARSARSARSARS）,即在染色体上的多处即在染色体上的多处即在染色体上的多处即在染色体上的多处DNADNADNADNA复制起复制起复制起复制起始位点。始位点。始位点。始位点。3 3 3 3、作为真核基因表达载体应具备如下条件：、作为真核基因表达载体应具备如下条件：、作为真核基因表达载体应具备如下条件：、作为真核基因表达载体应具备如下条件：含有原核基因的含有原核基因的含有原核基因的含有原核基因的复制起始序列复制起始序列复制起始序列复制起始序列（如（如（如（如ColE1ColE1ColE1ColE1起始序列起始序列起始序列起始序列oriorioriori）筛选标记；）筛选标记；）筛选标记；）筛选标记；含有真核基因的含有真核基因的含有真核基因的含有真核基因的复制起始序列复制起始序列复制起始序列复制起始序列（如（如（如（如SV40SV40SV40SV40病毒的复制病毒的复制病毒的复制病毒的复制序列、酵母的序列、酵母的序列、酵母的序列、酵母的2222质粒的复制起始序列质粒的复制起始序列质粒的复制起始序列质粒的复制起始序列ARSARSARSARS、以及真、以及真、以及真、以及真核细胞筛选标记（如氨基糖苷核细胞筛选标记（如氨基糖苷核细胞筛选标记（如氨基糖苷核细胞筛选标记（如氨基糖苷G148G148G148G148抗性基因、在酵抗性基因、在酵抗性基因、在酵抗性基因、在酵母细胞中与自养有关的基因）；母细胞中与自养有关的基因）；母细胞中与自养有关的基因）；母细胞中与自养有关的基因）；含有有效地含有有效地含有有效地含有有效地启动子序列启动子序列启动子序列启动子序列（可包含增强子序列等各种（可包含增强子序列等各种（可包含增强子序列等各种（可包含增强子序列等各种顺式作用元件）；顺式作用元件）；顺式作用元件）；顺式作用元件）；RNARNARNARNA聚合酶所需的聚合酶所需的聚合酶所需的聚合酶所需的转录终止和转录终止和转录终止和转录终止和poly(A)poly(A)poly(A)poly(A)加入的信号序加入的信号序加入的信号序加入的信号序列；列；列；列；合适的供外源基因插入的合适的供外源基因插入的合适的供外源基因插入的合适的供外源基因插入的限制性内切酶位点限制性内切酶位点限制性内切酶位点限制性内切酶位点。4、YAC 的主要功能成份有三：1 1）着丝粒着丝粒着丝粒着丝粒：mitosismitosismitosismitosis姊妹染色单体和减数分裂姊妹染色单体和减数分裂姊妹染色单体和减数分裂姊妹染色单体和减数分裂同源染色体分离之必需。同源染色体分离之必需。同源染色体分离之必需。同源染色体分离之必需。2 2 2 2）端粒：端粒：端粒