NDM基因的检测与确认.pptx

ICDC,China CDCNDM-1NDM-1简介简介v一个新发现的耐药基因，全长一个新发现的耐药基因，全长826bpv编码编码1型新德里金属型新德里金属-内酰胺酶内酰胺酶 造细菌成对碳青酶烯类药物耐药造细菌成对碳青酶烯类药物耐药v位于质粒上位于质粒上 最初发现在肺炎克雷伯杆质粒最初发现在肺炎克雷伯杆质粒pKpANDM-1上上 Genbank FN396876（2009.11.24）v具有可移动性具有可移动性 可在不同种属细菌间转移可在不同种属细菌间转移 革兰阴性：肠杆菌科、不动杆菌、假单胞菌革兰阴性：肠杆菌科、不动杆菌、假单胞菌 革兰阳性：？革兰阳性：？E.coli Genbank AB571289（2010.07.10）ICDC,China CDCNDM-1NDM-1的基因检测的基因检测1.PCR检测检测2.序列测定序列测定最终确认最终确认v检测对象：检测对象：已经过表型筛检的菌株进行已经过表型筛检的菌株进行NDM-1基因确认基因确认对大批菌株直接进行筛检对大批菌株直接进行筛检对标本的检测对标本的检测v高通量、快速、准确高通量、快速、准确ICDC,China CDCPCRPCR检测方法检测方法模板制备模板制备v模板制备：菌株、标本模板制备：菌株、标本1.菌株菌株（1）G-细菌：细菌：a.水煮模板：新鲜培养物悬浊于水煮模板：新鲜培养物悬浊于100-200l纯水纯水 沸水浴沸水浴10min以上以上 8000rpm以上离心以上离心5min 吸取上清，吸取上清，-20 保存保存 b.试剂盒提取基因组试剂盒提取基因组DNA（说明书）（说明书）ICDC,China CDCPCRPCR检测方法检测方法模板制备模板制备1.菌株菌株（2）G+细菌：细菌：a.试剂盒提取基因组试剂盒提取基因组DNA（说明书）（说明书）溶菌酶充分作用溶菌酶充分作用 b.水煮模板：新鲜培养物悬浊于水煮模板：新鲜培养物悬浊于100-200 l纯水纯水 低温反复冻融（低温反复冻融（-40 以下或液氮）以下或液氮）沸水浴沸水浴10min以上以上 8000rpm以上离心以上离心5min 吸取上清，吸取上清，-20 保存保存2.标本：根据标本类型不同选择相应的试剂盒标本：根据标本类型不同选择相应的试剂盒ICDC,China CDCPCRPCR检测检测引物选择引物选择1.引物选择：引物选择：v扩增片段位于扩增片段位于CDS正向的正向的191-482位置（反向位置（反向345-636位置）位置）483-769位置（反向位置（反向58-344位置）位置）v引物特异性较好，理论上无非特异扩增片段引物特异性较好，理论上无非特异扩增片段引物引物引物序列（引物序列（5 3）产物大小（产物大小（bp）退火温度退火温度()引物引物117U-191CAGCACACTTCCTATCTC2925517L-465CCGCAACCATCCCCTCTT引物引物2F-58GGCGGAATGGCTCATCACGA28660R-344CGCAACACAGCCTGACTTTCICDC,China CDCPCRPCR检测检测PCRPCR体系体系v引物合成稀释引物合成稀释冻干粉末，开启前冻干粉末，开启前10000rpm离心离心5min小心开盖，防止粉末喷出小心开盖，防止粉末喷出1.0OD+268 l纯水，充分震荡混匀纯水，充分震荡混匀，浓，浓度度20 M（20 mol/L）v20 l体系（右图）体系（右图）若使用含有若使用含有Mg2+的的10buffer的加入的加入量同上表，量同上表，MgCl2体积用水补齐体积用水补齐 PCR Premix预混液（根据说明书）预混液（根据说明书）成分成分体积（体积（l l）10buffer10buffer2 2dNTP dNTP（10mM each10mM each）1.61.6MgClMgCl2 2 （2.5mM2.5mM）1.21.2Primer-FPrimer-F（2020 MM）1 1Primei-RPrimei-R（2020 MM）1 1TaqTaq（5U/l5U/l）0.20.2纯水纯水1212DNADNA1ng1ng总体积总体积2020ICDC,China CDCPCRPCR检测检测PCRPCR体系体系v没有阳性对照，如何确保体系正常运转没有阳性对照，如何确保体系正常运转v同批同批 配置体系时：增加配置体系时：增加1管不使用管不使用NDM-1引物引物 加入常用引物及模板，扩增其他已知片段加入常用引物及模板，扩增其他已知片段v人工合成长片段人工合成长片段DNA作为阳性对照？作为阳性对照？不建议合成不建议合成：首次发现时如何排除：首次发现时如何排除“污染污染”质疑质疑 如果一定要合成：在中间区域加入如果一定要合成：在中间区域加入若干数量的突变位点若干数量的突变位点 作为区别合成片段与实际阳性片段的标志作为区别合成片段与实际阳性片段的标志ICDC,China CDCPCRPCR检测检测PCRPCR反应条件与电泳反应条件与电泳v反应条件反应条件：（约耗时：（约耗时1小时小时25分钟）分钟）94 5min94 15secTm 30sec 25个循环个循环72 30sec72 5minv电泳：电泳：1.5%琼脂糖电泳琼脂糖电泳 marker：DL2000ICDC,China CDC基因序列测定基因序列测定最终确认最终确认vPCR阳性结果：携带阳性结果：携带NDM-1基因基因 非特异扩增非特异扩增v最终确认：序列测定最终确认：序列测定v测序公司，当天得到结果测序公司，当天得到结果v测序样品：测序样品：100 l以上以上PCR产物产物v引物及其浓度：上下游引物各引物及其浓度：上下游引物各10 l（20uM）v测序要求：双向、测通，提供拼接好的序列测序要求：双向、测通，提供拼接好的序列 ICDC,China CDC基因序列测定基因序列测定测序结果判读测序结果判读v测序彩图：峰体清晰、无套峰测序彩图：峰体清晰、无套峰ICDC,China CDC基因序列测定基因序列测定测序结果判读测序结果判读v双向测序结果拼接双向测序结果拼接v起始段结果（起始段结果（10-30bp）、反应结果段结果（）、反应结果段结果（500bp）不可用）不可用ICDC,China CDC基因序列测定基因序列测定序列比对序列比对v下载参考序列：下载参考序列：Genbank：FN396876.1 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/255031061 AB571289、HQ171206、HM853678v将测度序列与参考序列比对：将测度序列与参考序列比对：常用软件：常用软件：Clustal、DNAstar、Megav最终确认是否为最终确认是否为NDM-1基因序列基因序列v判定该细菌携带判定该细菌携带NDM-1基因基因ICDC,China CDCNDM-1NDM-1基因携带与耐药基因携带与耐药v抗生素敏感性抗生素敏感性细菌表型特征细菌表型特征 耐药基因正确表达，表现出细菌的抗生素敏感性耐药基因正确表达，表现出细菌的抗生素敏感性 一种细菌可具有多种耐药机制一种细菌可具有多种耐药机制 NDM-1只是其中一种只是其中一种 该细菌表现出的抗生素敏感性是各种耐药机制综合表现的结果该细菌表现出的抗生素敏感性是各种耐药机制综合表现的结果vNDM-1基因的检测与确认基因的检测与确认基于基因水平的判断基于基因水平的判断 菌株菌株A携带携带NDM-1基因基因v菌株菌株A的耐药谱，的耐药谱，NDM-1基因对于这株菌的作用基因对于这株菌的作用 具体问题具体分析具体问题具体分析ICDC,China CDC谢谢大家！谢谢大家！