细胞融合定稿.pptx

鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合n细胞融合细胞融合又称体细胞杂交，是指用人工方又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。的杂种细胞。细胞融合的应用领域细胞融合的应用领域 细胞融合（细胞融合（cell fusion)cell fusion)是细胞工程是细胞工程技术的重要手段之一，是研究细胞遗传、技术的重要手段之一，是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。手段。显微镜下细胞融合过程显微镜下细胞融合过程融合过程中两个细胞膜从彼此接触融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解到破裂形成细胞桥的变化过程图解融合的助融剂融合的助融剂n依据融合过程采用的助融剂不同，细胞依据融合过程采用的助融剂不同，细胞融合可分为：融合可分为：n病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒（HVJHVJ）；）；n化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（醇（PEGPEG）；）；n电场诱导的细胞融合；电场诱导的细胞融合；n激光诱导的细胞融合激光诱导的细胞融合用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 实验目的实验目的n了解聚乙二醇（了解聚乙二醇（PEGPEG）诱导体外细胞）诱导体外细胞融合的基本原理。融合的基本原理。n通过通过PEGPEG诱导鸡血细胞之间的融合实诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。验，初步掌握细胞融合的基本方法。实验原理实验原理nPEGPEG是乙二醇的多聚化合物，可改变是乙二醇的多聚化合物，可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，诱点处脂类分子发生疏散和重组，诱导产生细胞融合。导产生细胞融合。n商品商品PEGPEG存在一系列不同分子质量的存在一系列不同分子质量的多聚体，一般应用多聚体，一般应用PEG40006000PEG40006000的的溶液，能够产生高频率的细胞融合。溶液，能够产生高频率的细胞融合。PEGPEG诱导融合的特点诱导融合的特点优点：优点：是融合成本低，勿需特殊设是融合成本低，勿需特殊设 备；融合子产生的异核率较备；融合子产生的异核率较 高；融合过程不受物种限制。高；融合过程不受物种限制。缺点：缺点：是融合过程繁琐，是融合过程繁琐，PEGPEG可能可能对对 细胞有毒害。细胞有毒害。聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）法细胞融合过程）法细胞融合过程实验仪器、用具实验仪器、用具n注射器注射器n滴管滴管n烧杯烧杯n容量瓶容量瓶n载玻片载玻片n离心机离心机n水浴锅水浴锅n显微镜显微镜n酒精灯酒精灯n盖玻片盖玻片试剂试剂nHanksHanks原液（原液（1010）nNaCl2 80.0gNaCl2 80.0gnNa2HPO4Na2HPO412H2O 1.2g 12H2O 1.2g nKCl 4.0gKCl 4.0gnKH2PO4 0.6gKH2PO4 0.6gnMgSO4MgSO47H2O 2.0g 7H2O 2.0g n葡萄糖葡萄糖 10.0g10.0gnCaCl2 1.4gCaCl2 1.4g试剂试剂nHanksHanks原液（原液（1010）n称取称取1.4gCaCl21.4gCaCl2，溶于，溶于30-50ml30-50ml蒸馏水中蒸馏水中n取取1000mL1000mL的烧杯及容量瓶各的烧杯及容量瓶各1 1个，先放重个，先放重蒸水蒸水800mL800mL于烧杯中，然后按上页表顺序于烧杯中，然后按上页表顺序逐一溶解药品。直到葡萄糖完全溶解后，逐一溶解药品。直到葡萄糖完全溶解后，再将已溶解的再将已溶解的CaCl2CaCl2溶液加入，最后加水溶液加入，最后加水定容至定容至1000mL1000mL试剂试剂nHanksHanks液液nHanksHanks原液原液 100mL100mLn重蒸水重蒸水 896mL896mLn0.5%0.5%酚红酚红 4mL4mLn配好的配好的HanksHanks液，分装包扎好贴上标签，液，分装包扎好贴上标签，经过灭菌后，经过灭菌后，44保存。保存。试剂试剂n生理盐水生理盐水n50%50%（m/Vm/V）PEGPEG溶液溶液n称取称取0.50.5克克PEG(MW=4,000)PEG(MW=4,000)放入试管内，放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入在酒精灯上融化之，迅速加入1ml1ml预热预热的的HanksHanks液混匀制成液混匀制成5050的的PEGPEG溶液。溶液。放入放入3737水浴中待用。水浴中待用。方法与步骤方法与步骤n1.1.鸡血细胞储备液的制备（已完成）鸡血细胞储备液的制备（已完成）n取鸡血，加入肝素（取鸡血，加入肝素（100U/5mL100U/5mL全血）制成抗全血）制成抗凝全血。再加入凝全血。再加入4 4倍体积生理盐水，制成红倍体积生理盐水，制成红细胞储备液细胞储备液n2.2.鸡血细胞的处理鸡血细胞的处理n用用5mL5mL离心管取鸡血细胞储备液离心管取鸡血细胞储备液1mL1mL，加入，加入4mL4mL生理盐水，混匀后，生理盐水，混匀后，800rpm800rpm离心离心5min5min，弃上清，用弃上清，用5mL5mL生理盐水重悬浮沉淀，重复生理盐水重悬浮沉淀，重复离心操作离心操作1 1次。次。方法与步骤方法与步骤n3.3.鸡血细胞悬液的制备鸡血细胞悬液的制备n在离心后的鸡血细胞沉淀中加入在离心后的鸡血细胞沉淀中加入2ml2ml Hanks Hanks缓缓冲液，将细胞悬浮，冲液，将细胞悬浮，于于3737保温。保温。n4.PEG4.PEG诱导细胞融合诱导细胞融合n吸取吸取1mL1mL鸡血悬液放在鸡血悬液放在1010mLmL离心管中，逐滴加离心管中，逐滴加入入3737的的50%PEG50%PEG约约0.5mL0.5mL,边加边轻轻摇动，边加边轻轻摇动，1min1min加完，混匀后于加完，混匀后于3737水浴静置水浴静置3min3min。方法与步骤方法与步骤n5.5.终止终止PEGPEG作用作用n缓慢加入缓慢加入5mL5mL Hanks Hanks缓冲液，轻轻吹打混匀，于缓冲液，轻轻吹打混匀，于3737水浴中静置水浴中静置5min5min。n6.6.制备细胞悬液制备细胞悬液n用吸管轻轻吹打细胞团数次使其分散，离心使细用吸管轻轻吹打细胞团数次使其分散，离心使细胞沉淀，用胞沉淀，用1-2mL1-2mLHanksHanks缓冲液重悬浮。缓冲液重悬浮。n7.7.镜检镜检n吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴，盖上盖吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴，盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞融合情况。玻片，在显微镜下观察细胞融合情况。注意事项注意事项n温度、融合时间、温度、融合时间、PEG的浓度与作用的浓度与作用时间、细胞密度、机械力等因素均影时间、细胞密度、机械力等因素均影响融合率，实验操作时应予以注意，响融合率，实验操作时应予以注意，并在需要的时候及时镜检。并在需要的时候及时镜检。实验结果实验结果计算细胞融合率计算细胞融合率n细胞融合率是指在显微镜的视野内，已细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合细胞的细胞核总数与该视野内发生融合细胞的细胞核总数与该视野内所有细胞的细胞核总数之比，通常以百所有细胞的细胞核总数之比，通常以百分数表示。分数表示。n测定时要进行多个视野计数，并进行统测定时要进行多个视野计数，并进行统计分析。计分析。作业作业1.画出观察到的融合细胞。画出观察到的融合细胞。2.并计算融合率。并计算融合率。