化学发光法的原理技术要点和评价应用省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

化学发光免疫技术化学发光免疫技术第一节第一节 发光与化学发光剂发光与化学发光剂第二节第二节 发光酶免疫测定（发光酶免疫测定（C CLEIALEIA）（chemiluminescence enzyme chemiluminescence enzyme immunoasssayimmunoasssay）第三节第三节 化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术(CLIA)(CLIA)（chemiluminescence immunoassaychemiluminescence immunoassay）第四章第四章 电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术(ECLI)ECLI)(electrochemiluminescence immunoassay)(electrochemiluminescence immunoassay)第1页 化学发光免疫技术：化学发光免疫技术：集灵敏化学集灵敏化学 发光分析和特异抗原抗体免疫测发光分析和特异抗原抗体免疫测 定于一体检测技术。定于一体检测技术。概概 念念 特点：特点：特异性高、敏感性高、分离简便、特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。可自动化。第2页化学发光免疫技术类型化学发光免疫技术类型 按发光剂不一样分为按发光剂不一样分为 1.1.发光酶免疫测定（发光酶免疫测定（C CLEIALEIA）chemiluminescence enzymeimmunoasssay chemiluminescence enzymeimmunoasssay 2.2.化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术(CLIA)(CLIA)chemiluminescence immunoassay chemiluminescence immunoassay 3.3.电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术(ECLI)ECLI)electrochemiluminescence immunoassay electrochemiluminescence immunoassay 按分离方法不一样分按分离方法不一样分 1.1.微粒子化学发光免疫测定微粒子化学发光免疫测定 2.2.磁颗粒化学发光免疫测定磁颗粒化学发光免疫测定第3页第一节第一节 发光与化学发光剂发光与化学发光剂一、发光一、发光 一个物质由电子激发态回复到基态时，一个物质由电子激发态回复到基态时，释放出能量表现为光发射。释放出能量表现为光发射。1.1.光照发光光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激发光剂经短波长入射光照射后进入激 发态，当回复至基态时发出较长波长可见光。发态，当回复至基态时发出较长波长可见光。2.2.生物发光生物发光:反应底物在荧光素酶催化下利用反应底物在荧光素酶催化下利用 ATP ATP产能，生成激发态氧化荧光素，后者在回产能，生成激发态氧化荧光素，后者在回 复到基态时多出能量以光子形式放出。复到基态时多出能量以光子形式放出。3.3.化学发光化学发光:在常温下由化学反应产生光发射。在常温下由化学反应产生光发射。化学发光是一个多步骤过程。化学发光是一个多步骤过程。第4页 荧光素酶荧光素酶ATP；O2；Mg2+氧化萤火虫荧光素氧化萤火虫荧光素萤火虫荧光素萤火虫荧光素返回返回返回返回光光 +AMP+O2+CO2+第5页化学发光化学发光 机制：机制：一些化合物能够利用化学反应产生能一些化合物能够利用化学反应产生能 量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子 激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基 态时，以发射光子形式释放能量（即发光）。态时，以发射光子形式释放能量（即发光）。化学发光剂或发光底物：化学发光剂或发光底物：在化学发光反应中参在化学发光反应中参 与能量转移并最终以发射光子形式释放能量与能量转移并最终以发射光子形式释放能量 化合物。化合物。发光剂分为发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂荧光素、生物发光剂、化学发光剂第6页 能参加化学发光反应；能参加化学发光反应；与抗原或抗体偶联后形成稳定结合物试剂；与抗原或抗体偶联后形成稳定结合物试剂；偶联后仍保留高量子效应和反应动力；偶联后仍保留高量子效应和反应动力；应不改变或极少改变被标识物理化特征，应不改变或极少改变被标识物理化特征，尤其是免疫活性。尤其是免疫活性。化学发光剂应符合以下几个条件化学发光剂应符合以下几个条件返回返回返回返回第7页1.1.酶促反应发光底物酶促反应发光底物 是指经酶降解作用而发出光一类发光底物。是指经酶降解作用而发出光一类发光底物。CLEIA CLEIA中惯用酶有中惯用酶有HRPHRP和和APAP HRP HRP发光底物有鲁米诺、对发光底物有鲁米诺、对-羟基苯乙酸羟基苯乙酸 AP AP发光底物有发光底物有AMPPDAMPPD、4-MUP4-MUP（荧光底物）（荧光底物）特点：可作标识物、也可作过氧化物酶底物特点：可作标识物、也可作过氧化物酶底物 1.1 1.1 鲁米诺鲁米诺H2O2/OH HRP+N2+H2O+光光第8页对对-羟基苯乙酸（羟基苯乙酸（HPAHPA）HPA HPA在在H H2 2O O2 2存在下被存在下被HRPHRP氧化成氧化二聚体（荧光氧化成氧化二聚体（荧光 物质），在物质），在350nm350nm激发光作用下，发出激发光作用下，发出450nm450nm波长波长 荧光，可用荧光光度计测量。荧光，可用荧光光度计测量。1.2 HPA 1.2 HPAH2O2HRP+荧荧 光光氧化二聚体氧化二聚体第9页AMPPDAMPPD AMPPD AMPPD在碱性条件下，被在碱性条件下，被APAP酶解生成相当稳定酶解生成相当稳定 AMP-D AMP-D阴离子，其有阴离子，其有2 230min30min分解半衰期，发分解半衰期，发 出波长为出波长为470nm470nm连续性光，在连续性光，在15min15min时其强度时其强度 到达高峰，到达高峰，151560min60min内光强度保持相对稳定。内光强度保持相对稳定。光光AP/OH HPO4 2 1.3 AMPPD 1.3 AMPPD第10页4-MUP4-MUP 4-MUP 4-MUP被被APAP催化生成催化生成4-4-甲基伞形酮，在甲基伞形酮，在360nm360nm 激发光作用下，发出激发光作用下，发出448nm448nm荧光，可用荧荧光，可用荧 光光度计进行测量。光光度计进行测量。荧荧光光AP 1.4 4-MUP 1.4 4-MUP4-MU4-MU360nm360nm激发光激发光H H3 3POPO4 4+第11页2.2.直接化学发光剂直接化学发光剂特点：特点：不需催化剂，只需改变溶液不需催化剂，只需改变溶液pHpH等条件等条件 就能发光物质。反应快速、背景低、就能发光物质。反应快速、背景低、信比高，发光量与信比高，发光量与AEAE浓度呈线性关系。浓度呈线性关系。惯用试剂：惯用试剂：吖啶酯（吖啶酯（acridinium，AEAE）+CO+CO2 2+光光第12页3.3.电化学发光剂电化学发光剂 是指经过在电极表面进行电化学反应而发出是指经过在电极表面进行电化学反应而发出 光物质。光物质。特点：特点：反应在电极进行；反应在电极进行；电子供体为：三丙胺（电子供体为：三丙胺（TPATPA）化学发光剂：三联毗啶钌化学发光剂：三联毗啶钌返回返回返回返回三联毗啶钌三联毗啶钌分子结构图分子结构图第13页第二节第二节 发光酶免疫测定发光酶免疫测定（CLEIA）一、原理一、原理 属于酶免疫测定一个。只是最终一属于酶免疫测定一个。只是最终一 步酶反应所用底物为发光剂，经过发光反应步酶反应所用底物为发光剂，经过发光反应 发出光在特定仪器上进行测定。发出光在特定仪器上进行测定。二、技术类型二、技术类型 依据酶促反应底物不一样可分为：依据酶促反应底物不一样可分为：1.1.荧光酶免疫测定技术荧光酶免疫测定技术 2.2.化学发光酶免疫测定技术化学发光酶免疫测定技术 依据免疫学反应模式分依据免疫学反应模式分 1.1.双抗体夹心法和双抗原夹心法双抗体夹心法和双抗原夹心法 3.3.固相抗原竞争法：固相抗原竞争法：第14页荧光酶免疫测定技术反应原理图荧光酶免疫测定技术反应原理图 洗涤洗涤弃上清弃上清 是利用理想酶荧光底物，生成产物稳定并有是利用理想酶荧光底物，生成产物稳定并有 强荧光强度，经过测定荧光强度进行定量。强荧光强度，经过测定荧光强度进行定量。第15页化学发光酶免疫测定技术反应原理图化学发光酶免疫测定技术反应原理图 洗涤洗涤弃上清弃上清 是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，经过光强度测定而直接进行定量。经过光强度测定而直接进行定量。第16页电化学发光原理图电化学发光原理图 这一过程可在电极表面周而复始地进行这一过程可在电极表面周而复始地进行 产生许多光子，使光信号增强产生许多光子，使光信号增强 返回返回返回返回激发态激发态不稳定不稳定基态基态电极电极第17页1.1.抗原抗体结合反应抗原抗体结合反应 将已包被了抗体乳胶微将已包被了抗体乳胶微 粒和待测标本加入反应杯中，经温育一定时间粒和待测标本加入反应杯中，经温育一定时间 后后,再加入再加入APAP标识抗体，温育标识抗体，温育,形成固相包被抗形成固相包被抗 体体-抗原抗原-酶标抗体复合物酶标抗体复合物 技术关键点技术关键点 2.2.分离技术分离技术 将复合物转移到玻璃纤维上，用缓将复合物转移到玻璃纤维上，用缓 冲液洗涤，没结合抗原被洗脱，酶标抗体冲液洗涤，没结合抗原被洗脱，酶标抗体-抗抗 原原-胶乳微粒抗体复合物则被保留在纤维膜上。胶乳微粒抗体复合物则被保留在纤维膜上。3.3.酶促发光反应酶促发光反应 加入加入4-MUP4-MUP，酶标抗体上，酶标抗体上APAP将将 4-MUP 4-MUP分解，形成分解，形成4-MU4-MU，它在，它在360nm360nm激发光照激发光照 射下，发出射下，发出448nm448nm荧光，经荧光仪统计，放大，荧光，经荧光仪统计，放大，依据标准曲线由电脑计算出所测物质含量依据标准曲线由电脑计算出所测物质含量第18页1.1.磁颗粒分离法：磁颗粒分离法：用抗原或抗体包被磁颗粒用抗原或抗体包被磁颗粒,与标与标 本中对应抗原或抗体和酶标抗体或抗原经过本中对应抗原或抗体和酶标抗体或抗原经过 一定模式免疫学反应后一定模式免疫学反应后,最终经过磁场将结合最终经过磁场将结合 酶标识物酶标识物ICIC和游离酶标识物进行分离技术。和游离酶标识物进行分离技术。分离技术分离技术2.2.微粒子捕捉法：微粒子捕捉法：所用颗粒是无磁性微粒子作为所用颗粒是无磁性微粒子作为 抗体或抗原包被载体抗体或抗原包被载体,然后用纤维膜柱子进然后用纤维膜柱子进 行酶标识物结合状态和游离状态分离。行酶标识物结合状态和游离状态分离。3.3.包被珠分离法：包被珠分离法：用聚苯乙稀等材料制成小珠用聚苯乙稀等材料制成小珠,在在 小珠上包被抗原或抗体小珠上包被抗原或抗体,经抗原抗体反应后经抗原抗体反应后,将将 结合状态和游离状态酶标识物进行分离结合状态和游离状态酶标识物进行分离.第19页第三节第三节 化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术（CLIA）一、原理一、原理 用化学发光剂直接标识抗原或抗体用化学发光剂直接标识抗原或抗体,与与 待测标本中对应待测标本中对应AbAb或或AgAg、磁颗粒性、磁颗粒性AgAg或或AbAb反反 应，经过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离应，经过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离 状态化学发光剂标识物分离开来，然后加入状态化学发光剂标识物分离开来，然后加入 发光促进剂进行发光反应，经过对发光强度发光促进剂进行发光反应，经过对发光强度 检测进行定量或定性检测检测进行定量或定性检测 。二、技术类型二、技术类型 1.1.分离方法分离方法 惯用磁颗粒分离技术惯用磁颗粒分离技术 2.2.免疫学反应模式免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术同酶发光免疫测定技术 3.3.不一样只是对应标识物是吖啶酯而不是酶不一样只是对应标识物是吖啶酯而不是酶 第20页1.1.抗原抗体结合反应抗原抗体结合反应 将包被将包被McAbMcAb磁颗粒和待磁颗粒和待 测标本加入到反应管中，标本中待测测标本加入到反应管中，标本中待测AgAg与磁珠与磁珠 上上AbAb结合，再加上结合，再加上AEAE标识标识AbAb，经过温育，形成，经过温育，形成 磁珠磁珠AbAb-AgAg-AE-AE标识标识AbAb复合物。复合物。技术关键点技术关键点 2.2.分离技术分离技术 在电磁场中进行在电磁场中进行2-32-3次洗涤后，很快次洗涤后，很快 地将未结合多出地将未结合多出AgAg和标识和标识AbAb洗去。洗去。3.3.化学发光反应化学发光反应 经洗涤磁经洗涤磁珠珠中，加入中，加入H H2 2O O2 2和和 pH pH纠正液纠正液NaOHNaOH，这时，这时AEAE不需要催化剂即分解并不需要催化剂即分解并 发光，由集光器接收，经光电倍增管放大，记发光，由集光器接收，经光电倍增管放大，记 录录1 1S S内所产生光子能，其积分与被测物含量内所产生光子能，其积分与被测物含量 成正比，按标准曲线，仪器可计算出被测物含量。成正比，按标准曲线，仪器可计算出被测物含量。第21页 1.AE 1.AE其低背景噪音、化学反应简单、快速而无催其低背景噪音、化学反应简单、快速而无催 化剂。化剂。方法评价方法评价 2.AE2.AE与大分子结合并无降低所产生光量，与大分子结合并无降低所产生光量，从而增加灵敏度，灵敏度可达从而增加灵敏度，灵敏度可达10-15g/ml10-15g/ml。3.AE3.AE标识试剂使用期长，可达一年。标识试剂使用期长，可达一年。4.4.固相分离剂为极为幼细磁粉，除增大包被固相分离剂为极为幼细磁粉，除增大包被 面积，加紧反应外，亦同时使清洗及分离更面积，加紧反应外，亦同时使清洗及分离更 简易、快捷。简易、快捷。第22页第四节第四节 电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术（ECLI）一、原理一、原理 是一个在电极表面由电化学引发特是一个在电极表面由电化学引发特 异性化学发光反应，实际上包含了电化学和化异性化学发光反应，实际上包含了电化学和化 学发光二个过程。学发光二个过程。ECLECL是电开启发光反应，而是电开启发光反应，而CLCL 是经过化合物混合开启发光反应。用化学发光是经过化合物混合开启发光反应。用化学发光 剂三联吡啶钌剂三联吡啶钌Ru(bpy)3Ru(bpy)32+2+标识标识AbAb，经过，经过Ag-AbAg-Ab 反应和磁珠分离技术，依据三联吡啶钌在电极反应和磁珠分离技术，依据三联吡啶钌在电极 上发出光强度对待测上发出光强度对待测AgAg或或AbAb进行定量进行定量/定性。定性。二、技术类型二、技术类型 1.1.分离方法分离方法 惯用磁颗粒分离技术惯用磁颗粒分离技术 2.2.免疫学反应模式免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术同酶发光免疫测定技术 3.3.对应标识物是三联吡啶钌而不是酶对应标识物是三联吡啶钌而不是酶 第23页 1.1.三联吡啶钌标识抗体和生物素标识抗体与待测标本三联吡啶钌标识抗体和生物素标识抗体与待测标本 同时加入一个反应杯中孵育反应同时加入一个反应杯中孵育反应 技术关键点技术关键点 2.2.将链霉亲和素（将链霉亲和素（SASA）包被磁珠加入反应杯中，再次）包被磁珠加入反应杯中，再次 孵育，使生物素（孵育，使生物素（B B）经过与亲和素（）经过与亲和素（A A）结合，）结合，将磁珠、将磁珠、AbAb连接为一体，形成双连接为一体，形成双AbAb夹心法。夹心法。3.3.蠕动泵将形成蠕动泵将形成 Ru(bpy)Ru(bpy)3 3 2+2+-Ab-Ag-Ab-B-SA-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠磁珠 复合体吸入流动测量室，磁珠被工作电极下面磁铁复合体吸入流动测量室，磁珠被工作电极下面磁铁 吸附于电极表面。同时，游离吸附于电极表面。同时，游离AbAb也被吸出测量室。也被吸出测量室。4.4.蠕动泵加入蠕动泵加入TPATPA，电极加电压，开启，电极加电压，开启ECLECL反应过程。反应过程。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，其与光电倍增管检测光强度，其与Ru(bpy)3Ru(bpy)32+2+浓度呈浓度呈 线性关系线性关系,故可测出待测故可测出待测AgAg含量。含量。第24页原理图原理图返回返回返回返回抗体包被抗体包被 样本样本 Ru(byp)2+TPA缓冲缓冲磁珠磁珠 抗原抗原 标识抗体标识抗体 液洗涤液洗涤 3第25页方法评价方法评价标识物再循环利用，使发光时间更长、强标识物再循环利用，使发光时间更长、强 度更高、易于测定；度更高、易于测定；敏感度高，可达敏感度高，可达pgpgmlml或或pmolpmol水平；水平；线性范围宽线性范围宽10104 4；反应时间短，反应时间短，20min20min以内可完成测定；以内可完成测定；试剂稳定性好，试剂稳定性好，2 255可保持一年以上。可保持一年以上。第26页五、临床应用五、临床应用1.1.甲状腺激素甲状腺激素 2.2.生殖激素生殖激素3.3.肾上腺肾上腺/垂体激素垂体激素 4.4.贫血因子贫血因子5.5.肿瘤标识物肿瘤标识物 6.6.感染性疾病感染性疾病7.7.糖尿病糖尿病 8.8.心血管系统心血管系统9.9.病毒标识物病毒标识物 10.10.骨代谢骨代谢11.11.过敏性疾病过敏性疾病 12.12.治疗药品监测治疗药品监测 返回返回返回返回第27页