HMS-01的遗传毒性评价.pdf

论著 HMS-01 的遗传毒性评价陈弋1，孙青2，黎翔1，孙旸1，刘霞1（1.海军军医大学药学系临床药学教研室,上海 200433；2.先导物成药性研究全国重点实验室，上海 201203）摘要目的检测 HMS-01 的遗传毒性，并对其进行临床前安全评价研究，为后续该药物进入临床试验提供支持。方法采用鼠伤寒沙门氏菌进行细菌回复突变试验（Ames 试验）评价 HMS-01 的遗传毒性。结果HMS-01 在 20.6、61.7、185.2、555.6、1 666.7、5 000 g/皿的 6 个剂量下，无论有无代谢活化条件，对鼠伤寒沙门氏菌均无致突变性。结论在本实验剂量范围内，HMS-01 未见致突变性。关键词 HMS-01；细菌回复突变试验 Ames；致突变性；遗传毒性文章编号 2097-2024（2024）04-0147-04DOI 10.12206/j.issn.2097-2024.202308061GenotoxicityevaluationofHMS-01CHEN Yi1,SUN Qingyan2,LI Xiang1,SUN Yang1,LIU Xia1（1.Department of Clinical Pharmacy,School of Pharmacy,NavalMedical University,Shanghai 200433,China;2.National Key Laboratory of Lead Druggability Research，Shanghai 201203，China）AbstractObjective To provide a toxicological basis for HMS-01 in future clinical trials,through genotoxicity testingof safety evaluation.Methods The genotoxicity of HMS-01 was evaluated by Bacterial Reverse Mutation Assay（Ames test）with Salmonella typhimurium.Results HMS-01 was non-mutagenic against Salmonella typhimurium at six doses of 20.6,61.7,185.2,555.6,1 666.7,and 5 000 g/dish with（or without）a metabolic activation system.Conclusion HMS-01 was not found tobe mutagenic in the dose range of this experiment.Keywords HMS-01；bacterial reverse mutation assay；mutagenicity；genetic toxicity 0前言肥胖是因体内脂肪过度蓄积导致健康损害的一种机体状态。目前已证实与肥胖相关联的疾病多达 21 种，广泛涉及心血管、消化、呼吸、神经、肌肉骨骼等系统相关疾病甚至传染性疾病1。根据 2023 年 3 月世界肥胖联盟（WOF）公布的2023世界肥胖地图，预计到 2035 年，肥胖或超重（WHO标准 BMI25 kg/m2）率将达到 51%，引起的经济损失超过 4 万亿美元2。中国同样面临肥胖发病率逐年增高的严峻问题，根据最新报道，按照中国人的 BMI 分级（BMI24 kg/m2），我国目前已有34.8%的人超重，14.1%的人肥胖3。而我国上市的关于肥胖的治疗药物却屈指可数，自 2007 年脂肪酶抑制剂奥利司他获批以来，只有胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂利拉鲁肽和贝纳鲁肽于2023 年 7 月获批超重（肥胖）适应证4。但这两类药物仍存在各自的弊端：奥利司他因严重脂肪泻导致部分患者不耐受，且因减肥效果有限而不被推荐用于合并并发症的肥胖治疗5；利拉鲁肽和贝纳鲁肽减肥效果优异6，但需注射给药且价格昂贵，近期还有报道称此类药物胃肠道不良反应远比其公布的要严重7，并有可能增加肠梗阻风险，甚至使少数使用者产生自杀念头8。因此，研发可有效治疗肥胖且不良反应小的药物对治疗肥胖、减少并发症具有重要的意义。研究人员前期发现，脂肪因子血清类粘蛋白（ORM）可作用于下丘脑瘦素受体，抑制摄食并调控能量平衡9，是潜在的减重药物研发靶点（专利号：ZL201510230870.2）。但 ORM 为高度糖基化的大分子蛋白质，制备困难且需注射给药，限制了其药物开发前景。研究人员前期筛选到一个全新小分子化合物 HMS-01，该化合物由大环内酯类抗菌药红霉素改造而来，为一种未上市的在研新药，基金项目国家自然科学基金项目（82073907，82073842）；上海市科委生物医药领域科技支撑项目（20S11902700）；上海市 2021年度“科技创新行动计划”优秀学术/技术带头人计划项目（21XD1404700）作者简介陈弋，硕士研究生，Tel：[phone]，Email：通信作者孙旸，副教授，硕士生导师，研究方向：代谢性疾病药物药理，Email：DawnyS；刘霞，教授，博士生导师，研究方向：心脑血管药理学，Email： 药学实践与服务2024 年 4 月 25 日第 42 卷第 4 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.4，April 25，2024147 可显著升高 ORM 并降低肥胖小鼠体质量，且具有可经消化道用药、无抗菌活性的特征，有望为药物治疗肥胖开辟新赛道。根据创新药物临床前研究的国际国内指导原则10-11，新药上市前需通过药效学和毒理学研究评估药物的有效性和安全性，其中，遗传毒性研究是毒理学研究的重要部分。遗传毒性是指化合物能直接或间接损伤生物体遗传物质，造成基因改变或突变，危及生物体及其后代健康。近年来，因具有致突变性而引起的药品召回事件时有发生9。本研究通过鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames 试验）对该化合物的遗传毒性进行实验探究，以期为创新药物的遗传安全性及其临床前毒理学评估提供支持。1实验材料 1.1 受试样品及对照品受试样品：HMS-0（西安秦申嘉合药物研究有限公司，批号 20190127，纯度 98%）。阴性对照品：二甲基亚砜（DMSO，Sigma-aldrich，CAS:67-68-5）。阳性对照品：吖啶诱变剂 ICR-191（Sigma-aldrich，CAS：17070-45-0）、2-硝基芴（Sigma-aldrich，CAS：607-57-8）、叠氮钠（Sigma-aldrich，CAS：26628-22-8）、甲基磺酸甲酯（Sigma-aldrich，CAS：66-27-3）、2-氨基蒽（Sigma-aldrich，CAS：613-13-8）。1.2 主要试剂及配制方法营养肉汤（赛默飞，CM0067）；磷酸盐缓冲液（生工生物）；顶层琼脂培养基（Solarbio，货号：LA3080）；底层培养基（Solarbio，货号：3090）；S9混合液溶剂（按照 180 ml 试验用量配制）：氯化钾（生工生物，CAS：7447-40-7）6.6 mmol、氯化镁（生工生物，CAS：7791-18-6）1.6 mmol、葡糖-6-磷酸（Sigma-aldrich，CAS：3671-99-6）1 mmol、辅酶（Sigma-aldrich，CAS：24292-60-2）0.8 mmol、0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液（20PBS 缓冲液，Solarbio，货号：P1032）120 ml、去离子水定容至 180 ml；S9混合液：代谢活化系统 S9是经苯巴比妥/-萘黄酮诱导的雄性SD 大鼠肝匀浆上清液制备而成，购自 MolecularToxicology，使用前与 S9溶剂按照 19（V/V）的比例配制。1.3 主要仪器设备全自动 Ames 实验仪（北京慧荣和科技有限公司，型号：HRH-AMES116）；全自动菌落分析仪（杭州泽析生物科技有限公司，型号：DTS3）；倒置显微镜 徕卡贸易（上海）有限公司，型号：Leica DMi8M/C/A。1.4 试验菌株此次试验所使用的组氨酸营养缺陷型（his）鼠伤寒沙门氏菌 TA97a、TA98、TA100、TA102 和TA1535，购自 Molecular Toxicology 公司，符合实验要求。2方法根据毒理学研究的国际标准12-13，设计制定Ames 试验以检测受试药物 HMS-01 的遗传毒性。Ames 试验亦称细菌回复突变实验，是利用伤寒沙门氏菌具有回复突变的特性，以鉴定受试物是否具有致突变性的一种试验方法。his鼠伤寒沙门氏菌，因不能自主合成组氨酸而不能在缺乏组氨酸的培养基上生长，但在外界致突变因素的作用下可突变为能自主合成组氨酸的原养型沙门氏菌，从而能在无组氨酸的培养基上正常生长。因此，可通过观测其经受试物作用后，在无组氨酸培养基上的菌落生长情况来判定受试物是否具有致突变毒性。试验结果要求应满足以下条件：阴性对照组的回复突变菌落均数在历史阴性/溶媒对照范围内；阳性对照组的回复突变菌落均数为其对应的阴性对照组的 3 倍以上；污染平皿数不超过平皿总数的 5%。2.1 试验菌鉴定及扩增培养5 种试验菌（TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535）应具备表 1 所示的特性，因此于实验前进行如下生物学特性鉴定：his鉴定、脂多糖屏障缺陷（rfa 突变）鉴定、氨苄青霉素抗性（菌株 R 因子缺失）鉴定、紫外线敏感性（uvrB 突变）鉴定、四环素（pAQ1）抗性的鉴定、自发回变菌落数（his+）测定、对阳性诱变剂的回变敏感性测定，以确定试验菌株符合试验标准。表1各试验菌株生物学特性 菌株名称组氨酸缺陷脂多糖屏障缺损R因子缺失uvrB突变抗四环素自发回落数TA97a+90180TA98+3050TA100+120200TA102+240320TA1535+1035 取鉴定合格试验菌分别接种于装有 7 ml 营养肉汤培养基的试管中，于（352）、（12025）r/min条件下在空气恒温震荡器中扩增培养 1618 h，使用酶标仪检测菌液光密度并估算活菌浓度，待浓度达 1109 个/ml 以上时可用于试验。药学实践与服务2024 年 4 月 25 日第 42 卷第 4 期 148Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.4，April 25，2024 2.2 试验分组设置 6 个 HMS-01 实验组，最高剂量为 HMS-015 000 g/皿，其下等比稀释设置 5 个剂量组分别为1 666.7、555.6、185.2、61.7、20.6 g/皿。除此之外，另设置空白对照组及各菌对应的阳性对照组，分组情况见表 2。表2各试验菌对应的阳性诱变剂及剂量 代谢活化菌株名称阳性诱变剂剂量（g/皿）S9TA97aICR-1911TA982-硝基芴1TA100叠氮钠2TA102甲基磺酸甲酯1.3TA1535叠氮钠2+S9TA97a2-氨基蒽3TA982-氨基蒽3TA1002-氨基蒽3TA1022-氨基蒽30TA15352-氨基蒽3 2.3 平板渗入法用全自动 Ames 实验仪进行试验，即 2 ml 融溶状态下的顶层琼脂培养基与下列物质混合：0.5 mlS9混合液或 0.5 ml 磷酸盐缓冲液、0.1 ml 对应受试药品、0.1 ml 扩增菌液，迅速混匀，室温静置，待平皿凝固后倒置于（371）培养箱内培养 4872 h。各组共设置 3 个平行皿，重复试验 1 次。2.4 试验结果观察及判定 xsn培养结束后肉眼或显微镜下观察各皿的受试药品是否有析出以及背景菌斑的生长情况，并计数各平行皿的回变菌落数。每个组分别求均值，并将结果以（）的方式列出，各组平行数表示为。根据中国食品药品检定研究院发布的细菌回复突变试验技术指导原则（征求意见稿）制定的结果判断标准，对于 TA97a、TA98、TA100 及 TA102，其诱导的回复突变菌落均数大于各自阴性对照组的 2 倍，且具有浓度依赖性及可重现性，即可判定为阳性结果；对于 TA1535，其诱导的回复突变菌落均数高出各自阴性对照组的 3 倍，且具有浓度依赖性及可重现性，结果可判定为阳性。受试药品在加 S9或不加 S9混合液的条件下，经上述 5 种试验菌株测定后，只要有 1 种试验菌株为阳性，即可认定该受试药品的细菌回复突变试验为致突变阳性，反之则判断为阴性。3结果 3.1 受试样品析出及背景菌斑生长情况受试药品HMS-01 在有S9处理条件下的TA97a和 TA1535 菌株实验中，1 666.7 和 5 000 g/皿浓度组有观察到镜下非干扰沉淀，其余所有处理条件均未观察到供试品沉淀，结果见表 3。所有试验组均未观察到背景菌斑抑制现象。表3HMS-01 细菌回复突变试验结果(n=3)代谢活化组别TA97aTA98TA100TA102TA1535背景菌斑沉淀背景菌斑沉淀背景菌斑沉淀背景菌斑沉淀背景菌斑沉淀+S9阴性对照组T0P0T0P0T0P0T0P0T0P020.6T0P0T0P0T0P0T0P0T0P061.7T0P0T0P0T0P0T0P0T0P0185.2T0P0T0P0T0P0T0P0T0P0555.6T0P0T0P0T0P0T0P0T0P01 666.7T0P0T0P0T0P0T0P0T0P05 000.0T0P0T0P0T0P0T0P0T0P0阳性对照组T0P0T0P0T0P0T0P0T0P0S9阴性对照组T0P0T0P0T0P0T0P0T0P020.6T0P0T0P0T0P0T0P0T0P061.7T0P0T0P0T0P0T0P0T0P0185.2T0P0T0P0T0P0T0P0T0P0555.6T0P0T0P0T0P0T0P0T0P01 666.7T0P1T0P0T0P0T0P0T0P15 000.0T0P1T0P0T0P0T0P0T0P1阳性对照组T0P0T0P0T0P0T0P0T0P0注：T0.正常；P0.正常；P1.镜下非干扰性沉淀。药学实践与服务2024 年 4 月 25 日第 42 卷第 4 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.4，April 25，2024149 3.2 回复突变菌落数受试药品 HMS-01 在所有处理条件下的回复突变菌落平均数均小于各自阴性对照组的 2 倍，且无浓度依赖性升高，结果见表 4。本次试验条件中，在有（或无）代谢活化条件时，受试品 HMS-01对组氨酸营养缺陷型（his）鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102 和 TA1535 均无潜在致突变性。表4HMS-01 细菌回复突变试验结果(n=3)代谢活化组别回复突变菌落数TA97aTA98TA100TA102TA1535+S9阴性对照组157.715.529.33.1138.34.7326.07.521.34.020.6156.717.834.77.1119.38.0334.316.721.05.261.7159.07.231.78.5140.09.8250.0113.219.33.1185.2147.722.733.34.2151.76.0319.06.218.70.6555.6168.37.634.72.5130.710.0340.06.119.34.01 666.7157.72.134.75.8148.72.9287.084.120.34.65 000143.719.938.36.7122.38.1304.022.917.01.7阳性对照组704.030.2122.710.1646.746.01 758.786.3574.79.2S9阴性对照组171.75.136.73.2151.38.7340.33.823.71.520.6168.011.840.01.7125.79.1338.77.425.33.161.7169.717.542.313.7131.315.6350.015.921.33.1185.2152.013.134.35.5148.08.7366.05.024.73.2555.6167.71.542.02.0161.38.6351.024.222.76.51 666.7163.03.645.33.2156.03.6376.725.722.33.15 000164.722.940.33.1153.36.7365.026.017.33.8阳性对照组1 384.04.01 264.017.4504.038.61 365.348.4188.032.7 4讨论遗传毒性因其对生物体及其后代影响巨大，一直是新药临床前毒理学评价的重要组成部分。细菌回复突变试验由美国加利福尼亚大学 BNAmes教授于 1975 年建立并经后来者的不断发展完善，也称为 Ames 试验，现今已成为全球基因毒性测试中的最为公认的方法之一，通常作为体外毒理学测试的第 1 步，被广泛应用于药物致突变性的初筛检验。该试验以 his的沙门氏菌为指示生物，试验中包含了加与不加代谢活化系统，通过该菌特定的生物效应能检测基因突变，对受试物的遗传毒性进行分析。本研究利用细菌回复突变试验对受试药物HMS-01 遗传毒性进行评价，结果显示，HMS-01 在有（或无）代谢活化条件下，均无致突变性，未发现其具有遗传毒性。该结果将为 HMS-01 的后续新药研发提供有力支撑。【参考文献】KIVIMKI M,STRANDBERG T,PENTTI J,et al.Body-massindex and risk of obesity-related complex multimorbidity:an ob-1servational multicohort studyJ.Lancet Diabetes Endocrinol,2022,10（4）：253-263.World Obesity Federation,World Obesity Atlas 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