lncRNA HOTAIR对人牙周膜干细胞增殖和骨向分化的影响.pdf

北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024，Vol.32，No.15牙周炎的特征是牙齿周围的支撑骨和牙周组织丧失。慢性炎症会减少牙周组织再生并抑制牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）成骨分化1,2。PDLSCs 是来源于牙周组织的多能间充质干细胞，具有高增殖、自我更新和多向分化的潜能。PDLSCs被认为是牙周再生的合适细胞来源3。PDLSCs 具有在体外分化成成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和神经元样细胞的能力4,5。长链非编码 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）HOX 转录lncRNA HOTAIR 对人牙周膜干细胞增殖和骨向分化的影响杨荃荃 王娇【摘要】目的 探讨长链非编码 RNA（lncRNA）HOX 转录反义 RNA（HOTAIR）对人牙周膜干细胞增殖和骨向分化的影响。方法 分离培养人牙周膜干细胞（hPDLSCs），并诱导成骨分化（诱导组），随后分为pcDNA 组、pcDNA-lncRNA HOTAIR 组、anti-miR-NC 组、anti-miR-1-3p 组、pcDNA-lncRNA HOTAIR+miR-NC 组和 pcDNA-lncRNA HOTAIR+miR-1-3p 组，正常培养的 hPDLSCs 设为对照组。定量实时 PCR 检测 lncRNA HOTAIR、miR-1-3p、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）、碱性磷酸酶（ALP）的 mRNA 表达，MTT 法检测细胞增殖，Western blotting 检测 OCN、OPN、ALP 蛋白表达，荧光素酶报告基因检测 lncRNA HOTAIR 和 miR-1-3p 的靶向结合。结果 与对照组比较，诱导组 lncRNA HOTAIR 表达量降低，miR-1-3p 表达量增加（P0.05）。与 pcDNA 组、anti-miR-NC 组 比 较，pcDNA-lncRNA HOTAIR 组、anti-miR-1-3p 组 细 胞 活 力、OCN、OPN、ALP 的 mRNA 蛋白表达水平降低（P0.05）。lncRNA HOTAIR 靶向下调 miR-1-3p 表达（P0.05）。与 pcDNA-lncRNA HOTAIR+miR-NC 组比较，pcDNA-lncRNA HOTAIR+miR-1-3p 组 miR-1-3p 表达量、细胞活力及 OCN、OPN、ALP 的 mRNA 水平和蛋白水平均升高（P0.05）。结论 lncRNA HOTAIR 通过降低 miR-1-3p 表达抑制hPDLSCs 的增殖和骨向分化。【关键词】hPDLSCs；lncRNA HOTAIR；miR-1-3p；细胞增殖；骨向分化【中图号】R782【文献标识码】A【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2024.01.002Effects of lncRNA HOTAIR on proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells YANG Quan-quan,WANG Jiao.Department of Stomatology,Nanchong Central Hospital,Nanchong 637000,China【Abstract】Objective To investigate the effects of long non-coding RNA(lncRNA)HOX transcription antisense RNA(HOTAIR)on the proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells.Methods Human periodontal ligament stem cells(hPDLSCs)were isolated and cultured,and osteogenic differentiation was induced(induction group).They were then divided into pcDNA group,pcDNA-lncRNA HOTAIR group,anti-miR-NC group,anti-miR-1-3p group,pcDNA-lncRNA HOTAIR+miR-NC group and pcDNA-lncRNA HOTAIR+miR-1-3p group,normal culture hPDLSCs served as control group.Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)was used to detect the expression of lncRNA HOTAIR,miR-1-3p,and the mRNA expression of osteocalcin(OCN),osteopontin(OPN)and alkaline phosphatase(ALP).MTT method was used to detect cell proliferation.The protein expressions of OCN,OPN and ALP were detected by western blotting,and the targeted binding of lncRNA HOTAIR and miR-1-3p was detected by luciferase reporter gene.Results Compared with the control group,the expression of lncRNA HOTAIR in hPDLSCs in the induction group was decreased,and the expression of miR-1-3p was increased(P0.05).Compared with pcDNA group and anti-miR-NC group,cell viability of hPDLSCs at 24 h,48 h,and 72 h,the mRNA levels and protein expression levels of OCN,OPN,and ALP in pcDNA-lncRNA HOTAIR group and anti-miR-1-3p group were decreased(P0.05).Compared with pcDNA-lncRNA HOTAIR+miR-NC group,the expression of miR-1-3p,cell viability and 72 h,and the mRNA and protein levels of osteogenesis-related genes OCN,OPN,and ALP in hPDLSCs in pcDNA-lncRNA HOTAIR+miR-1-3p group were increased(P0.05).Conclusions LncRNA HOTATR inhibits proliferation and osteogenic differentiation of hPDLSCs by reducing miR-1-3p expression.【Key words】hPDLSCs;lncRNA HOTAIR;miR-1-3p;Cell proliferation;Osteogenic differentiation.基金项目：2020 年市级应用技术研究与开发资金项目(20YFZJ0012)作者单位：637000 南充 南充市中心医院口腔科通信作者：杨荃荃，E-mail：,电话:[phone]北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024，Vol.32，No.16反 义 RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）可抑制脂肪间充质干细胞的成骨分化6。lncRNA HOTAIR 在骨质疏松患者中高表达，干扰其表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化7。lncRNA HOTAIR 可抑制软骨细胞增殖和分化8。过表达miR-1-3p 可促进骨髓间充质干细胞骨生成9,沉默miR-1-3p 的表达可抑制成骨相关基因的表达10。但lncRNA HOTAIR 是否可能通过调控 miR-1-3p 表达影响人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）增殖和骨向分化还不甚清楚。因此本研究旨在探究 lncRNA HOTAIR 对 hPDLSCs增殖和成骨分化的影响及潜在的分子机制。材料和方法1.材料型胶原酶、地塞米松、-磷酸甘油钠、维生素 C、噻唑蓝溴化四唑（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）试剂（美国 sigma）；过表达空载质粒（pcDNA）、lncRNA HOTAIR 过表达质粒（pcDNA-lncRNA HOTAIR）、miRNA 抑制剂阴性对照（anti-miR-NC）、miR-1-3p 抑制剂（anti-miR-1-3p）、miRNA模拟物阴性对照（miR-NC）、miR-1-3p 模拟物（miR-1-3p）、小干扰 RNA 阴性对照（si-NC）、lncRNA HOTAIR 小干扰 RNA（si-lncRNA HOTAIR）（广州RiboBio）；RIPA裂解缓冲液（北京Applygen Technologies）；二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白测定试剂盒（美国Pierce Biotechnology）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）抗体、波形丝蛋白（vimentin）抗体、骨钙素（osteocalcin，OCN）抗体、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）抗体、IgG-HRP-标记的二抗（美国Abcam）；PrimeScript RT试剂盒（日本TaKaRa Bio）。2.hPDLSCs 分离培养与成骨诱导hPDLSCs 从本院采集的正畸拔牙、无牙周炎及其他系统疾病的患者的牙周膜组织中，采用酶解组织块法（型胶原酶 2 mg/ml）11分离获得。取第 3代 hPDLSCs 制备细胞爬片，多聚甲醛固定 0.5 h 后牛血清白蛋白封闭，加入 vimentin 抗体孵育过夜，次日 TRITC 荧光标记二抗孵育 1 h，PBS 冲洗后Hoechst33258 复染核 5 min，封片，荧光显微镜观察。hPDLSCs 于 37、5%CO2培养箱中，在补充10%胎牛血清的 DMEM 培养基中生长。成骨诱导时，参照庞鸣等12的报道，将第 3 代 hPDLSCs 在含 10%胎牛血清及 100 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L-磷酸甘油钠、50 mg/L 维生素 C 的 DMEM 培养基中诱导分化，14 d 后获得成骨分化 hPDLSCs，设为诱导组。另将正常培养的 hPDLSCs 设为对照组。3.实验分组实验共分为：pcDNA组、pcDNA-lncRNA HOTAIR组、anti-miR-NC组、anti-miR-1-3p组、pcDNA-lncRNAHOTAIR+miR-NC组和pcDNA-lncRNA HOTAIR+miR-1-3p 组。将诱导的 hPDLSCs 接种到 6 孔板（5105细胞/孔）并孵育 24 h。使用 Lipofectamine 2000 将 pcDNA、pcDNA-lncRNA HOTAIR、anti-miR-NC、anti-miR-1-3p、pcDNA-lncRNA HOTAIR与 miR-NC、pcDNA-lncRNA HOTAIR 与 miR-1-3p模拟物转染到诱导组 hPDLSCs 中。转染 48 h。4.定量实时PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测 lncRNA HOTAIR、miR-1-3p、OCN、OPN、ALP 的 mRNA 表达使用 TRIzol 试剂分离总 RNA。使用 PrimeScript RT 试剂盒对 RNA 样品进行逆转录。然后使用 ABI Q6 PCR 系统对提取的总 RNA 进行定量。引物设计序列见表 1。5.MTT 法检测细胞增殖将每组 hPDLSCs（1104细胞/孔）接种在96 孔板上，在 37分别处理 24、48、72 h，向细胞中加入 20 l MTT（5 mg/ml）。37孵育 4 h，将每孔中培养基替换为 150 l DMSO，室温下在摇床上摇板 10 min。最后，用酶标仪测量各孔的吸光度表 1 引物设计序列基因名称引物序列（5 3）lncRNA HOTAIR上游：ATAGGCAAATGTCAGAGGGTT下游：ATTCTTAAATTGGGCTGGGTCOCN上游：GGCAGCGAGGTAGTGAAGAG下游：GATGTGGTCAGCCAACTCGTOPN上游：CTGAACGCGCCTTCTGATTG下游：ACATCGGAATGCTCATTGCTCTALP上游：AAGGCTTCTTCTTGCTGGTG下游：GCCTTACCCTCATGATGTCCGAPDH上游：ACCCACTCCTCCACCTTTGA下游：CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGTmiR-1-3p上游：ACACTCCAGGTGGGTGGAATGT下游：CTCAACTGGTGTCGTGGAGU6上游：CTCGCTTCGGCAGCACA下游：AACGCTTCACGAATTTGCGT北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024，Vol.32，No.17OD 值，检测波长设置为 490 nm。6.Western blot 检测 OCN、OPN、ALP 蛋白表达使用 RIPA 裂解缓冲液分离总蛋白，并使用 BCA 蛋白测定试剂盒进行定量，然后使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。用 OCN、OPN、ALP 一抗（1:1000）在 4下标记膜 12 h，用 IgG-HRP-标记的二抗室温标记膜 1 h，并使用化学发光底物显色。GAPDH用作对照。7.荧光素酶报告基因检测通过 StarBase 查找 lncRNA HOTAIR 和 miR-1-3p 的结合区域。通过 PCR 扩增野生型（WT）WT-lncRNA HOTAIR、野 生 型（MUT）MUT-lncRNA HOTAIR 序列并克隆到 psiCHECK-2 报告基因载体中。hPDLSCs 接种于 24 孔板，并与 WT-lncRNA HOTAIR 或 MUT-lncRNA HOTAIR 和 miR-NC 或miR-1-3p 模拟物一起使用 Lipofectamine 2000 共转染 48 h。使用双荧光素酶报告基因测定系统检测荧光素酶活性。另将 pcDNA、pcDNA-lncRNA HOTAIR、si-NC、si-lncRNA HOTAIR 转染到hPDLSCs 中，48 h 检测 miR-1-3p 的表达。8.统计学分析用 SPSS22.0 软件进行分析，实验数据表示为平均值 标准差。通过单因素方差分析进行不同组间差异分析，SNK-q 检验进行组间多重分析，独立样本 t 检验进行两组间差异分析。P0.05 认为差异有统计学意义。结 果1.hPDLSCs 鉴定由图 1 可看出，vimentin 呈阳性表达（红染），即所得细胞为 hPDLSCs。2.lncRNA HOTAIR 和 miR-1-3p 在 hPDLSCs成骨诱导中的表达诱 导 组 hPDLSCs 中 lncRNA HOTAIR 表 达 量比对照组降低，miR-1-3p 表达量比对照组增加（P0.05）（图 2）。3.lncRNA HOTAIR 过表达对 hPDLSCs 增殖和成骨相关基因表达的影响lncRNA HOTAIR 过 表 达 后，pcDNA-lncRNA HOTAIR 组 lncRNA HOTAIR 表达量比 pcDNA 组增加，细胞 24 h、48 h 和 72 h 的活力均比 pcDNA 组降低，且 OCN、OPN、ALP 的 mRNA 和蛋白水平也均比 pcDNA 组降低（P 0.05）（图 3，4）。4.干扰 miR-1-3p 表达对 hPDLSCs 增殖和成骨相关基因表达的影响干扰 miR-1-3p 表达后，anti-miR-1-3p 组 miR-1-3p 表达量比 anti-miR-NC 组减少，细胞 24 h、48 h和 72 h 的活力以及 OCN、OPN、ALP 的 mRNA 和蛋白水平均比 anti-miR-NC 组降低（P0.05）（图 5，6）。5.lncRNA HOTAIR 调控 miR-1-3p 的表达lncRNA HOTAIR 和 miR-1-3p 互补结合位点见图 7。WT-lncRNA HOTAIR 与 miR-1-3p 模拟物共转染降低了 hPDLSCs 报告基因的活性（P0.05）（图 8）。相比于转染 pcDNA，将 pcDNA-lncRNA HOTAIR 转染到 hPDLSCs 后，miR-1-3p 表达量减少（P0.05）；相比于转染 si-NC，将 si-lncRNA HOTAIR 转染到 hPDLSCs 后，miR-1-3p 表达量增加（P0.05）（图 9）。图 1 免疫荧光染色检测 vimentin 表达（400）注：*：与对照组比较，P0.05图 2 lncRNA HOTAIR 和 miR-1-3p 在 hPDLSCs 成骨诱导中的表达北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024，Vol.32，No.186.上调miR-1-3p表达逆转lncRNA HOTAIR 过表达对 hPDLSCs 增殖和成骨相关基因表达的作用上调 miR-1-3p 表达和 lncRNA HOTAIR 过表达时，pcDNA-lncRNA HOTAIR+miR-1-3p 组 miR-1-3p 表达量高于 pcDNA-lncRNA HOTAIR+miR-NC组，细胞 24 h、48 h 和 72 h 的活力以及 OCN、OPN、ALP 的 mRNA 和蛋白水平均高于 pcDNA-lncRNA HOTAIR+miR-NC 组（P0.05）（图 10，11）。讨 论上调 lncRNA ANRIL 的表达通过炎症 PDLSCs 中的 miR-7-5p/胰岛素样生长因子 1 受体（insulin-like growth factor 1，IGF1R）轴 促 进 成 骨13。lncRNA SNHG8 通 过 调 节 hPDLSCs 中 的 果 蝇zeste 基因增强子的人类同源物 2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)抑制成骨分化14。本研究探讨了lncRNA HOTAIR 在成骨诱导的 hPDLSCs 中的表达，发现 lncRNA HOTAIR 在 hPDLSCs 中降低。因此推测 lncRNA HOTAIR 可能与 hPDLSCs 的成骨有关。lncRNA HOTAIR 过表达对 hPDLSCs 的细胞活力具有抑制作用，这与前人实验中 lncRNA HOTAIR 抑制软骨细胞增殖8的结果类似。Assis 等15发现lncRNA HOTAIR 的低表达可能是 hPDLSCs 成骨潜力增加的先决条件。Wang 等16发现沉默 lncRNA HOTAIR 会降低 ALP 和 Runt 相关转录 因 子 2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）水平并促进钙沉积，而 lncRNA HOTAIR 过表达会抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化。此外，lncRNA HOTAIR 敲低导致在矿化培养基中培养的成骨 SaOS-2细胞中 ALP 活性增加17。lncRNA HOTAIR 过表达抑制骨髓间充质干细胞成骨分化及 RUNX2、OCN 和ALP 的表达18。本研究结果显示，当 lncRNA HOTAIR 过表达时，成注：*：与 pcDNA 组比较，P0.05图 4 lncRNA HOTAIR 过表达对 hPDLSCs 增殖和成骨相关基因表达的影响图 5 干扰 miR-1-3p 表达对 hPDLSCs 中OCN、OPN、ALP 蛋白表达的影响图 3 lncRNA HOTAIR 过 表 达 对 hPDLSCs 中 OCN、OPN、ALP 蛋白表达的影响北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024，Vol.32，No.19骨标志基因 OCN、OPN、ALP 的mRNA 蛋白表达水平均降低，与前 述 报 告 类 似6，证 实 lncRNA HOTAIR 可以抑制 hPDLSCs 的成骨分化。研 究 表 明，lncRNA HOTAIR可以作为一种竞争性内源 RNA来 调 节 miRNA 的 表 达。lncRNA HOTAIR 通 过 与 miR-330/618/126等 miRNA 相互作用，在胃癌中发挥致癌作用19。lncRNA HOTAIR作为 miR-129-5p 的海绵体，促进乳腺癌进展20。本研究中，成骨诱导的 hPDLSCs 中 miR-1-3p 表达。miR-1-3p 在1,25-二羟基维生素 D3 诱导的人脂肪来源间充质干细胞成骨分化过程中高表达21，在成骨中发挥调节作用。在一项涉及中国骨质疏松症患者的研究中，miR-1-3p 表达下调，骨形成和骨量减少9。在本研究中，干扰 miR-1-3p 的表达可以使细胞活力以及 OCN、OPN、ALP 的 mRNA 和蛋白水平降低，提示干扰 miR-1-3p 的表达抑制成骨诱导，与以往研究类似9，表明了 miR-1-3p 在调节牙周炎骨再生中的重要作用。本研究假设 lncRNA HOTAIR 可以通过与 hPDLSCs 中的 miR-1-3p 结合发挥作用。lncRNA HOTAIR 与 miR-1-3p 的调控关系通过生物信息学分析和双荧光素酶报告基因测定得到证注：*：与 anti-miR-NC 组比较，P0.05图 6 干扰 miR-1-3p 表达对 hPDLSCs 增殖和成骨相关基因表达的影响图 7 lncRNA HOTAIR 的序列中含有与 miR-1-3p 互补的核苷酸序列注：*：与 miR-NC 组比较，P0.05图 8 荧光素酶相对活性注：*：与 pcDNA 组比较，P0.05；#：与 si-NC 组比较，P0.05 图 9 lncRNA HOTAIR 调控 miR-1-3p 的表达图 10 Western blot 检测 lncRNA HOTAIR 过表达对 hPDLSCs中 OCN、OPN、ALP 蛋白表达的作用北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024，Vol.32，No.110实。本研究还发现，上调 miR-1-3p 表达逆转了lncRNA HOTAIR 过表达对 hPDLSCs 增殖和成骨相关基因表达的影响，进一步证实 lncRNA HOTAIR通过海绵化 miR-1-3p 对骨向分化产生影响。综上所述，本研究表明 lncRNA HOTAIR 通过下调 miR-1-3p 表达抑制 hPDLSCs 增殖和成骨分化，这为 lncRNA-miRNA 介导成骨分化过程提供了新的视角。参 考 文 献 1 王娟,祁胜财,周蓉,等.丹皮酚对大鼠BMMSCs增殖及成骨向分化的影响.北京口腔医学,2020,28(1):6-11.2 Yu B,Hu J,Li Q,et al.CircMAP3K11 contributes to proliferation,apoptosis and migration of human periodontal ligament stem cells in inflammatory microenvironment by regulating TLR4 via miR-511 sponging.Front Pharmacol,2021,12:633353.3 Zeng WY,Ning Y,Huang X.Advanced technologies in periodontal tissue regeneration based on stem cells:Current status and future perspectives.J Dent Sci,2021,16(1):501.4 Xu Y,Wang X,Liu W,et al.Thrombin-activated platelet-rich plasma enhances osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells by activating SIRT1-mediated autophagy.Eur J Med Res,2021,26(1):105.5 Tomokiyo A,Wada N,Maeda H.Periodontal ligament stem cells:regenerative potency in periodontium.Stem Cells Dev,2019,28(15):974-985.6 黄涛,贾志强,赵晓光,等.LncRNA-HOTAIR可调节脂肪间充质干细胞向成骨细胞的分化.中国组织工程研究,2022,26(25):3951.7 Shen 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