光动力疗法辅助治疗慢性牙周炎对牙龈卟啉单胞菌的影响.pdf

北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024，Vol.32，No.125慢性牙周炎是一种由多种微生物感染引起的慢性炎症性疾病，始动因子是牙菌斑，细菌在牙菌斑结构中产生复杂的相互联系并与宿主间有复杂的互动1,2。传统的非手术牙周治疗目的是去除微生物及其产物和其他导致牙周病的因素3。临床研究结果显示，单纯通过常规龈下刮治和根面平整术(scaling and root planning,SRP)并不能做到很好的清创4,5。其他辅助方法如应用抗生素的效果仍存在争议，且可能出现细菌耐药性以及治疗期间和治疗后的副作用。抗微生物光动力疗法利用光敏剂与靶细胞结合，适当波长的光照射引发能量转移，促进自由基的形成，对细菌及其产物产生毒性和破坏作用，进而导致细胞受损乃至死亡。因此，抗微生物光动力疗法可以应用于牙周炎的治疗 6-8。到目前为止，光动力疗法对龈下刮治和根面平整术后牙周袋内微生物体系的影响尚无定论。本研究的目的是评估龈下刮治和根面平整与抗微生物光动力疗法联合治疗慢性牙周炎的短期微生物学疗效，特别是针对牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingivalis,P.g）这一主要牙周病原体，探索在牙周炎治疗中应用这一疗法的有效性。光动力疗法辅助治疗慢性牙周炎对牙龈卟啉单胞菌的影响王新林 王冬青 姜亦洋 范亚贤 季瑾【摘要】目的 评估抗微生物光动力疗法（aPDT）辅助龈下刮治和根面平整术（SRP）对牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）检出率的影响。方法 选取慢性牙周炎患者 32 人，随机分为实验组（光动力组）（16例）和对照组（16 例），实验组进行龈下刮治和根面平整+光动力疗法，对照组进行龈下刮治和根面平整术，评价基线、治疗后 3、6 个月的微生物指标。采集龈下菌斑和唾液样本，对慢性牙周炎致病菌 P.g 进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测，观察 P.g 菌的检出率。结果 实验组和对照组在随访期的 P.g 阳性率均有所降低。对照组第 3、6 个月与基线相比，P.g 阳性率改善不显著（P 0.05），但实验组无论在第 3、6 个月，与基线相比都显著降低（P 0.05），且在第 3 个月时两组间有统计学差异（P 0.05),but the experimental group showed a significant decrease compared to baseline at both 3rd and 6th months(P0.05),and there was a statistical difference between the two groups at the 3rd month(P0.05).Conclusions Antimicrobial photodynamic therapy as an adjunctive treatment for chronic periodontitis can effectively inhibit P.g.【Key words】Photodynamic therapy;Chronic periodontitis;Scaling and root planning;Porphyromonas gingivalis 作者单位：100050 北京 首都医科大学口腔医学院牙周科（王新林、姜亦洋、范亚贤、季瑾），特诊特需科（王冬青）通信作者：王冬青，E-mail:，电话：[phone]临床研究北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024，Vol.32，No.126材料和方法1.样本量计算以样本量估计公式 n1=n2=2(t+t)s2计算。其中 为检验的第类错误概率，即检验水准或显著性水平，=0.05；为检 验 的第类 错 误 概 率，或 检 验 效 能(把 握 度)1-。=0.1；s=0.7，=0.8，t=1.96|t=1.2816|得出 n1=n2=16。考虑到脱落因素，共纳入 42 例患者，其中有 10 例仅完成初诊，最终完成研究者共 32 例，每组 16 例。2.实验对象及分组32 例在首都医科大学附属北京口腔医院牙周科就诊并已诊断为慢性牙周炎的成年人患者纳入研究，其中男 21 例，女 11 例，年龄 2556 岁，平均(39.28.7)岁。纳入标准：诊断为中度慢性牙周炎；至少有 18 颗完全萌出的牙齿；至少在口腔的每个象限有不少于 4 个位点的牙周袋深度为 58 mm；就诊前 6 个月内未进行过牙周治疗；近 3 个月内未服用抗生素；无明显错牙合畸形、开口呼吸；能够按时复诊，能够保持相对良好的口腔卫生。排除标准：患有糖尿病、心血管疾病和血液性疾病等系统性疾病及传染病；精神疾病；女性妊娠期或口服避孕药；服用抗凝剂等任何影响治疗的药物；吸烟、嗜酒；对光动力治疗材料过敏。采用随机对照单盲研究，将符合标准的患者分为对照组和实验组，实验组患者 16 例，采用SRP+aPDT 治疗；对照组患者 16 例，采用单纯龈下刮治和根面平整术（SRP）治疗。所有患者签署知情同意书。3.治疗方案由一位负责治疗的医生对所有入组患者进行口腔卫生宣教和龈上洁治，1 周后由另外一位负责检查的医生进行临床检查及采样。保证在不同患者采样位点牙位及探诊深度基本一致。3 个月及 6 个月复诊时先由检查医生进行临床检查及基线相同位点采样，然后由治疗医生进行龈上洁治，并加强口腔卫生宣教，之后 1 周各组进行与基线相同的治疗。研究开始时，2 组患者用 1.5%双氧水含漱，在阿替卡因局麻下用赛特力超声洁治手柄及超声龈下工作尖 H3、H4 进行龈下超声刮治，再用 Gracy刮治器（HU-Friedy 公司，美国）进行手工龈下刮治和根面平整。用尖探针探查牙周袋，确认刮治效果。3%双氧水仔细冲洗牙周袋，涂布碘甘油。对于SRP+aPDT 组，患者进行常规 SRP 后，用 3%双氧水冲洗牙周袋，患者漱口，PD 超过 5 mm 位点隔湿，吹干牙面，将光敏剂甲苯胺蓝注入牙周袋，等待1 min，用波长 635 nm 的 LED（PADTM Plus，Denfotex，英国）光照射 1 min，用 3%双氧水彻底冲洗牙周袋。实验组在 3 个月及 6 个月复诊时在行临床检查及采样后进行光动力疗法，治疗期间一共 3 次。4.标本采集在治疗前和治疗后第 3、6 个月，通过采集每一位患者的唾液及龈下菌斑样本，评价慢性牙周炎主要致病菌 P.g 的检出率。具体采集方法如下：唾液样本：嘱患者轻轻漱口，取坐位，将消毒后的不锈钢杯子置于下唇，轻轻张口，半低头，使静息唾液流入杯内，收集约 1 ml；龈下菌斑样本：每个受试者口腔内选择 4 个象限各至少 1 个 PD 5 mm、BI 2的位点作为取样位点并在牙周检查表做标记，每人取样 4 个位点。用小棉粒和刮治器轻轻去除取样位点的龈上菌斑，患者清水漱口，棉卷隔湿，用不锈钢镊子夹取 40 号根管用吸潮纸尖（所有用品均高温高压消毒）轻轻插入袋底，每个位点插 2 根纸尖，计时 40 s，取出置于 1.5 ml 离心管，冷冻保存于-20低温冰箱待检。基线及治疗后 3 个月、6 个月分别在研究对象的同一位点取样。所有研究对象均由同一名资深的牙周专业医师进行检查及样本采集。细 菌 培 养 及 DNA 提 取：由 首 都 医 科 大 学附属北京口腔医院研究所提供 P.g 标准菌株，ATCC33277 培养液。分别通过唾液基因组 DNA 抽提纯化试剂盒（庄盟生物，北京）和小量细菌基因组 DNA 抽提纯化试剂盒（庄盟生物，北京）提取唾液和龈下菌斑 DNA，用 NANODROP 紫外检测仪检测 DNA 浓度。PCR 扩增反应：参照 GenBank 中 Pg 的 16S rDNA基因序列（AF285870），合成检测 P.g 菌 16SrDNA基因的引物，5-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3（Sense），5-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3（Antisense）。由上海生工合成。实时定量 PCR对 DNA 进行扩增。1.5琼脂糖电泳，电压 110 V，电泳 40 min，紫外灯观测，捷达凝胶成像分析软件进行记录。5.统计学分析采用 SPSS17.0 和 Graphpad prism 7 统计软件进北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024，Vol.32，No.127行数据处理和分析。采用 Fisher s Exact Test 对微生物指标进行统计。P 0.05），两组组内比较，对照组基线和 3 个月、6 个月均有显著性差异，3 个月与 6 个月比较无显著性差异；实验组基线和 6 个月比较有显著性差异（表 4）。3.两组患者 P.g 检出结果PCR 电泳 P.g 有检出视为阳性，未检出视为阴性。两组患者在治疗后龈下菌斑和唾液中的 P.g 检出情况见图 1。其中，初诊时实验组（SRP+aPDT）与对照组（SRP）龈下菌斑样本中 P.g 检出率均为 100%。3 个月复诊时龈下菌斑检测结果：实验组 7 例阴性，9 例阳性，检出率 56.25%；对照组1 例阴性，15 例阳性，检出率 93.75%。6 个月复诊时龈下菌斑检测结果：实验组 6 例阴性，10 例阳性，检出率 62.50%；对照组 3 例阴性，13 例阳性，检出率 81.25%。实验组（SRP+aPDT）与对照组（SRP）在随访期的 P.g 阳性率均有所降低。对照组组第 3、6 个月与基线相比，P.g 阳性率改善不显著（P 0.05），但实验组无论在第 3、6 个月，与基线相比都显著降低（P 5 mm 百分比（%）PLIBI实验组1640.728.3411/53.460.4562.4018.603.660.572.830.64对照组1639.608.4810/63.400.7955.3724.263.730.392.960.69表 2 治疗前后 PD 均值的变化比较分组平均 PDP1P2P3基线3 个月6 个月对照组3.400.792.700.562.400.570.0010.0010.125实验组3.460.452.770.332.540.3200030.0010.349P 值（组间）0.6680.7320.575注：P1：0 vs 3 个月；P2：0 vs 6 个月；P3：3 vs 6 个月表 3 治疗前后深牙周袋占比的变化比较分组PD 5mm 占比(%)P1P2P3基线3 个月6 个月对照组55.3724.2630.6522.7321.8922.670.0010.0010.244实验组62.4018.6036.0522.9520.3313.580.0030.0010.100P 值(组间)0.3120.4810.868 注：P1：0 vs 3 个月；P2：0 vs 6 个月；P3：3 vs 6 个月表 4 治疗前后 PLI 的变化比较分组PLIP1P2P3基线3 个月6 个月对照组3.730.393.420.383.350.260.0110.0060.619实验组3.660.573.450.383.240.400.1390.0110.222P 值(组间)0.7220.8200.512注：P1：0 vs 3 个月；P2：0 vs 6 个月；P3：3 vs 6 个月北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024，Vol.32，No.128时两组间有统计学差异（P 0.05）。唾液样本中的P.g 未见显著变化。4.两组患者治疗的不良反应实验过程中及治疗结束后，两组患者均未出现特殊不良反应或治疗相关的副作用。讨 论牙周炎的病因复杂，普遍认为其是细菌诱导的慢性感染性疾病。P.g 是研究广泛且证据充足的重要的牙周可疑致病菌。绝大多数慢性牙周炎患者龈下菌斑都可以分离出 P.g，且分离率高达 90%以上9。残余牙周袋发生的部分原因是由于细菌沉积物难以完全清除，以及微生物群的牙周袋再植10。评估光动力疗法对于牙周治疗的意义，除了比较临床参数，微生物学指标也同样重要。已有证据表明光动力疗法能够调节宿主反应，并具有杀死细菌的能力 11,12。基于光动力疗法对牙周病原体的抗菌作用，本研究旨在评估与单独刮治术相比，光动力疗法联合刮治术治疗慢性牙周炎对牙周致病菌 P.g 的控制效果。对龈下菌斑和唾液 P.g 的检测表明，在治疗后第 3 个月龈下菌斑中 P.g 检出率明显降低。此结果与部分文献报道的实验结果相似13。有研究发现，光动力疗法作为常规刮治术的辅助治疗方法对伴放线聚集杆菌（A.a）、聚合梭杆菌（F.n）有明显的抑制作用，可用于以某些特定菌群为主的慢性牙周炎的治疗14。光敏剂与低能量激光的联合应用有助于杀灭 A.a、P.g、F.n 等牙周致病菌13-15。然而，也有一些研究表明，光动力疗法并没有提供显著的微生物学益处和临床指标的改善16-18，Christodoulides等16在 3 个月和 6 个月后比较两种治疗策略的疗效时，没有观察到病原体（包括 A.a 和 P.g）水平的显著差异。Meisel 等19的文献结果表明，与单独采用传统治疗相比，辅助光动力疗法并不能减少牙周袋的细菌定植。这可能与评估时间点、微生物检测方法以及应用的光敏剂和激光设备等方面的差异有关。目前还没有能够完全消除龈下细菌的技术，尤其是中度和较深牙周袋中的细菌20,21。本研究仅将 P.g 这一有代表性的牙周致病菌作为微生物检测指标，且未进行定量分析，不够准确和全面。另外，最近有研究证实，血脂水平与牙周健康状况存在一定的相关性,高脂血症患者的牙周健康状况明显差于正常血脂者,而且随着高脂血症的加重,其牙周炎的严重程度也增加22。本研究在患者的排除标准并未考虑血脂因素，尚不可确定患者血脂水平是否影响研究结果。由于牙周致病菌存在于牙菌斑生物膜中，其内部的各种微生物达到一个相对稳定的平衡，对细胞的吞噬作用或是抗生素及光动力疗法对细菌的杀灭作用,都有很有效的抵抗。经过牙周治疗后，牙菌斑生物膜受到破坏，微生物的种类和数量都有下降。但是牙菌斑生物膜在口内数小时便可形成，十几小时便可成熟，因此，必须定期机械性去除牙菌斑及钙化形成的牙石23。因此患者的自身口腔卫生维护更加重要，应作为开始临床基础治疗及手术治疗的前提条件24。局部或全身使用抗生素，以及光动力疗法，均应重复应用，以有效杀灭牙周致病菌，维护牙周治疗的疗效。因此本研究在基线、3 个月复诊及 6 个月复诊，均对患者进行与基线相同的治疗。6 个月复诊时龈下菌斑 P.g 检出率比 3 个月时略有升高，但仍显著低于基线检出率。究其较 3 个月略有升高的原因：可能是由于龈下菌斑生态系的自然调整，因为慢性牙周炎是周期性发展的慢性炎症，随机体免疫状态不同，微生物种类、数量不是直线下降，而是有不确定周期的回升24；可能是牙周袋内牙周致病菌的再定植来源还包括牙周组织的细胞及颊黏膜细胞25，无论是刮治术或是光动力疗法均无法杀灭细胞内的牙周致病菌；可能由于患者本身口腔卫生维护欠佳。同时，除了牙周炎的始动因子牙菌斑生物膜，宿主易感性对于牙周炎的发生发展也有很重要的影响。因此牙周临床实验的影响因素较多，在设计和进行临床实验的过图 1 治疗前后龈下菌斑和唾液中 P.g 检出情况的比较北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024，Vol.32，No.129程中应尽量排除主客观因素的影响。近十几年来，有关光动力疗法用于辅助牙周炎基础治疗的研究依然在进行，Amaroli 等26进行的体外实验表明，使用激光消融模式和光动力模式，能量参数为 215.0 J/cm2，多数牙周致病菌均得到有效杀灭，其中 P.g 和 P.i 下降了 99%。而能量参数为 161.7 J/cm2时仅 P.g 和 P.i 的下降有显著性差异。还有很多研究着眼于光动力疗法联合刮治与根面平整用于伴有全身疾病的牙周炎患者。Elsadek 等27的研究表明，光动力疗法联合刮治与根面平整无论是临床指标，还是 IL-6 和 TNF-等促炎细胞因子的降低，均相比单纯刮治与根面平整有显著性差异。本研究的结果表明，抗微生物光动力疗法辅助刮治与根面平整治疗慢性牙周炎在短期对致病菌P.g 有更好的抑制作用。这表明我们可将光动力疗法作为协同杀灭牙周致病菌的一种手段，对牙周炎治疗有良好的辅助效果。参 考 文 献 1 Sanz M,van Winkelhoff AJ;Working Group 1 of Seventh European Workshop on Periodontology.Periodontal infections:understanding the complexity-consensus of the Seventh European Workshop on Periodontology.J Clin Periodontol.2011,38(11):3-6.2 Kinane DF,Stathopoulou PG,Papapanou PN.Periodontal diseases.Nat Rev Dis Primers.2017,3:17038.3 Krishna R,De Stefano JA.Ultrasonic vs.hand instrumentation in periodontal therapy:clinical outcomes.Periodontol 2000,2016,71(1):113-127.4 Anderson GB,Palmer JA,Bye FL,et al.Effectiveness of subgingival scaling and root planing:single versus multiple episodes of instrumentation.J Periodontol,1996,67(4):367-373.5 Yan Y,Zhan Y,Wang X,Hou J.Clinical evaluation of ultrasonic subgingival debridement versus 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