参麦注射液对巨噬细胞NF-κB_PPAR-γ_ABCA1信号通路的影响.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 收稿日期：2023 年 12 月 21 日 作者简介：胡晶（1988-），男，汉族，江西南昌人，博士研究生，主治医师，研究方向为动脉粥样硬化。-42-参麦注射液对巨噬细胞NF-B/PPAR-/ABCA1信号通路的影响 胡 晶 尹秋林 张学洪 周学敏 谢耀武 江西省人民医院（南昌医学院第一附属医院）心血管病医院，江西 南昌 330006 摘要：摘要：目的 探究参麦注射液对巨噬细胞核因子B（NF-B）/过氧化物酶体增殖物激活受体-（PPAR-）/腺苷三磷酸结合盒转运体 A1（ABCA1）信号通路的影响。方法 选取 RAW.264 巨噬细胞进行体外培养，给予参麦注射液含药血清刺激。测定巨噬细胞中胆固醇流出率的变化；通过实时定量 PCR（RT-PCR）检测巨噬细胞中 NF-B、PPAR-及 ABCA1 的转录水平变化；通过 Western Blot 检测巨噬细胞中 NF-B、PPAR-及 ABCA1 的蛋白表达水平变化。对比健康人群、应用参麦注射液的急性冠脉综合征（ACS）患者（观察组）与常规治疗的 ACS 患者（常规组）间血脂、白细胞介素 10（IL-10）、干扰素（INF-）及转化生长因子（TGF-）。结果 实验组巨噬细胞胆固醇流出率显著高于对照组及空白组（P0.05）；实验组巨噬细胞 PPAR-、ABCA1 转录及蛋白水平显著高于对照组及空白组，NF-B 转录及蛋白水平显著低于对照组及空白组（P0.05）；参麦注射液干预后巨噬细胞胆固醇转出率与 PPAR-、ABCA1 转录水平及蛋白水平呈显著正相关性，与 NF-B 转录水平及蛋白水平呈显著负相关性（P0.05）。与常规组相比，观察组患者血脂水平、INF-及 TGF-水平较低，IL-10 水平较高（P0.05）。结论 参麦注射液可提高巨噬细胞胆固醇流出率，可能与降低 NF-B 水平、提高 PPAR-及 ABCA1 水平相关，提示参麦注射液可能通过 NF-B/PPAR-/ABCA1 信号通路调控胆固醇流出率进而参与动脉粥样硬化的发生、发展过程。关键词：关键词：动脉粥样硬化性心血管疾病；三磷酸腺苷-结合转运子 A1；动脉粥样硬化；胆固醇转出率 中图分类号：中图分类号：R58 动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）的病理学基础是动脉粥样硬化（AS)，目前公认的免疫炎症反应与脂质代谢是 AS 发展的两大重要原因。AS 斑块内聚集大量炎症细胞，释放炎症因子，导致 AS 进展及斑块不稳定。胆固醇逆转运是机体排除多余胆固醇的主要途径，也是高密度脂蛋白发挥抗 AS 的机制之一。细胞核因子B（NF-B）可以根据环境的变化调整细胞的功能，调节炎症反应，参与细胞免疫，在动脉粥样硬化的发生和斑块侵蚀或破裂中起重要作用。研究发现，NF-B可以通过下游过氧化物酶体增殖物激活受体-（PPAR-）/腺苷三磷酸结合盒转运体 A1（ABCA1）影响胆固醇逆转运过程，进而影响脂质代谢。参麦注射液是主要成分为红参和麦冬的纯中药制剂，具有生脉、益气固脱、养阴生津等功效，可有效阻止形成活性氧自由基以防止损伤心肌组织，而且还可增强心肌收缩能力，并可通过调节机体免疫功能、抑制神经内分泌激活等方面改善心脏泵功能及血液流变学状态。国内研究发现参麦注射液可以通过NF-B信号通路影响细胞功能，但其是否能影响血脂代谢及免疫炎症反应未见相关报道。基于此，本研究拟探究参麦注射液对巨噬细胞 NF-B/PPAR-/ABCA1 信号通路的影响。1 材料与方法 1.1 细胞培养 购买 RAW.264 巨噬细胞，在 37、5%CO2、饱和湿度的培养箱中通过完全培养基（10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素溶液+89%DMEM）培养，待细胞融合度达 80%时，常规消化分瓶传代，后续实验应选取处于对数生长期的 RAW.264 细胞。按照既往研究方法制备参麦注射液含药血清，加入至 RAW.264 细胞中并设置为实验组，另外取等量生理盐水加入至 RAW.264 细胞中并设置为对照组，不进行干预的 RAW.264 细胞设置为空白组。1.2 实验方法 1.2.1 胆固醇转出率 中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-43-处于对数生长期的 RAW.264 细胞从培养瓶中吸入15ml 离心管内，800rmp 离心 5min，去除上清液，加入8mL 1640 培养基（0.2%BSA），于 37，5%CO2 培养箱中静置培养。第二日将饥饿 12 小时的 RAW.264 细胞移入 15ml 离心管，去除上清液后使用细胞计数板将RAW.264 细胞数量定位 5105/ml 个，再次加入30g/ml 1640 培养基（0.2%BSA）配置成合适细胞浓度，将细胞悬浮液移入 12 孔板内，每孔 1mL3H胆固醇，于 37，5%CO2 培养箱中静置培养。第三天早 8点，取经过高压消毒的 1.5mL EP 管，将 12 孔板中的RAW.264 细胞反复吹吸，使沉淀在底部的细胞悬浮在液体中，将细胞液移入标记的 1.5mlEP 管内，贴好封口膜，800rmp 离心 5min。将细胞液移入相应的孔中，每孔加入 HSP65 溶液，浓度配置为（终浓度 1mg/ml），于37，5%CO2 培养箱中静置培养。第 4 天取经过高压消毒的 1.5mL EP 管，将细胞液移入相应的孔中，每孔加入 10%ApoA-I 溶液，于 37，5%CO2 培养箱中静置培养。6小时后，将孔内细胞液移入1.5mL EP 管内，800rmp离心 5min，取 500l 上清液加入闪烁液中，弃其余上清液，将 1mL NaOH（0.1mol/L）加入 EP 管内，待细胞裂解完全后吸 500l 至闪烁液中。液闪计数仪分别检测细胞介质及细胞溶解物的3H放射量。胆固醇流出率用细胞介质中放射量占总放射量（细胞溶解物+细胞介质）的百分比表示。1.2.2 实时荧光定量 PCR 检测转录水平 使用 TRIzol 试剂盒提取提取 RAW.264 巨噬细胞中总 RNA，通过 SYBRPremixEx Taq试剂盒逆转录提取总 cDNA，所用反应体系用 Real-time PCR（RT-PCR）法进行检测。根据 GenBank中基因序列设计 PCR 引物，检测 ABCA1、PPAR-、NF-B，-actin 作为内参对照，所有引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成，设置 RT-PCR 反应程序，目标基因的表达量用 2-Ct 比较法进行靶基因 mRNA 水平。其中各靶基因引物如下：表 1 ABCA1、PPAR-、NF-B，-actin 引物序列 基因 上游引物序列 下游引物序列 ABCA1 5-GTATTTTTGCAAGGCTACCAG-3 5-GATTGGCTTCAGGATGTCCA-3 PPAR-5-CAAGACAACCTGCTACAAGC-3 5-TCCTTGTAGATCTCCTGCAG-3 NF-B 5-GAAGCACGAATGACAGAGGC-3 5-GCTTGGCGGATTAGCTCTTT-3-actin 5-TAAAGACCTCTATGCCAACAC-3 5-CACGATGGAGGGGCCGGAC-3 1.2.3 Western Blot 检测蛋白表达水平 制备浓度为 10%分离胶 10ml：去离子水 4.0ml，10%过硫酸铵 0.1ml，30%丙烯酰胺 3.3ml，10%SDS0.1ml，1.5mol/LTris-HCl(PH=8.8)2.5ml，TEMED6l（灌胶前现加）。充分混匀，室温放置 15 分钟。灌注凝胶的玻璃板放入电泳槽中，小玻璃面向内，大玻璃板向外。加电泳液漫过内侧的小玻璃板，接通电源按 80V 预电泳 15min 以打开泳道。吸取不同组中 RAW.264 细胞中提取的总蛋白样品，按预定顺序上样（每孔蛋白含量50-80g）。将电泳仪接通电源，设置成80V恒压状态，使样品依次通过浓缩胶及分离胶至适当位置，结束电泳。通过“凝胶三明治”结构进行转膜，其中 ABCA1蛋白采用 300mA，200min，PPAR-、NF-B、-actin蛋白均采用 200mA，90min。取出转移后 PVDF 膜，用1TBST 液漂洗 10min3 次。ABCA1、PPAR-、NF-B及-actin 的检测按照封闭、加入一抗、洗膜、加入二抗、洗膜及显影的过程进行。最终蛋白浓度通过凝胶成像系统成像并照相，利用 ImageJ 软件进行 ABCA1、PPAR-、NF-B 及-actin 蛋白 Western blot 灰度分析。1.2.4 临床指标分析 选择 20212023 年在本院心内科住院，且符合WHO 关于缺血性心脏病的命名和诊断标准的 ACS 患者120 例，通过随机数字表分为 ACS 的常规治疗组(60 例）和参麦注射液治疗组（60 例），另外，设立健康对照组（60 例）。排除标准：（1）3 个月内有中风史；（2）患有感染性或系统性炎性疾病者；（3）患有严重瓣膜病者；（4）患有血液系统性疾病及肿瘤者；（5）严重肝肾功能损害者；（6）患有肿瘤，预计寿命小于 1 年。对比各组患者间总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、白细胞介素 10（IL-10）、干扰素（INF-）及转化生长因子（TGF-）的表达水平。1.4 统计学处理 所有数据均通过 SPSS25.0 进行统计学分析。所有计量资料均符合正态分布，通过均数标注差（）表示，两组间对比采用独立样本 t 检验，多组间对比采用单因素方差分析（ANOVA）。所有计数资料均通过例数（%）表示，组间对比采用 Fisher 精确概率法或卡方检验。胆固醇流出率与各实验指标的相关性分析采用 Pearson 检验。以 P0.05 认为差异具有统计学意中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-44-义。2 结果 2.1 参麦注射液对巨噬细胞胆固醇流出率的影响 实验组巨噬细胞胆固醇流出率显著高于对照组及空白组（P0.05）。见表 2。表 2 参麦注射液对巨噬细胞胆固醇流出率的影响（）组别 胆固醇流出率（%）实验组 4.230.74 对照组 2.610.48 空白组 2.560.45 实验组与对照组 t/P 值 3.567/0.001 实验组与空白组 t/P 值 3.643/0.001 对照组与空白组 t/P 值 0.125/0.759 2.2 参麦注射液对巨噬细 NF-B/PPAR-/ABCA1转录水平的影响 实验组巨噬细胞 PPAR-、ABCA1 转录水平显著高于对照组及空白组，NF-B 转录水平显著低于对照组及空白组（P0.05）。见表 3。2.3 参麦注射液对巨噬细 NF-B/PPAR-/ABCA1蛋白水平的影响 实验组巨噬细胞 PPAR-、ABCA1 蛋白水平显著高于对照组及空白组，NF-B 蛋白水平显著低于对照组 表 3 参麦注射液对巨噬细胞 NF-B/PPAR-/ABCA1 转录水平的影响（）组别 NF-B PPAR-ABCA1 实验组 1.220.34 2.230.44 2.160.38 对照组 1.870.40 1.590.29 1.670.32 空白组 1.890.39 1.570.32 1.660.33 实验组与对照组 t/P 值 3.674/0.001 3.871/0.001 3.746/0.001 实验组与空白组 t/P 值 3.644/0.001 3.889/0.001 3.774/0.001 对照组与空白组 t/P 值 0.083/0.862 0.067/0.903 0.056/0.923 表 4 参麦注射液对巨噬细胞 NF-B/PPAR-/ABCA1 蛋白水平的影响（）组别 NF-B PPAR-ABCA1 实验组 1.130.23 2.010.32 1.760.23 对照组 1.470.34 1.470.27 1.330.30 空白组 1.490.33 1.470.30 1.350.29 实验组与对照组 t/P 值 3.348/0.001 3.347/0.001 3.378/0.001 实验组与空白组 t/P 值 3.345/0.001 3.338/0.001 3.343/0.001 对照组与空白组 t/P 值 0.080/0.871 0.017/0.993 0.036/0.953 表 5 参麦注射液干预后巨噬细胞胆固醇转出率与各实验指标的相关性分析 指标 NF-B mRNA PPAR-mRNA ABCA1 mRNA NF-B 蛋白 PPAR-蛋白 ABCA1 蛋白 相关性系数-0.503 0.451 0.398-0.533 0.378 0.467 P 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 表 6 各组患者间临床指标对比（）组别 TC（mmol/L）TG（mmol/L）IL-10（pg/mL）INF-（pg/mL）TGF-（pg/mL）观察组 5.231.23 2.310.63 66.7618.23 16.275.12 46.878.72 常规组 7.471.34 3.470.52 51.3317.30 27.347.23 71.6311.33 对照组 4.891.33 1.970.53 71.3520.29 14.535.91 40.239.22 观察组与常规组 t/P 值 3.385/0.001 3.364/0.001 7.347/0.001 8.334/0.001 11.234/0.001 观察组与对照组 t/P 值 0.580/0.371 0.417/0.493 1.236/0.153 1.036/0.225 1.506/0.059 常规组与对照组 t/P 值 6.341/0.001 7.323/0.001 10.334/0.001 13.133/0.001 15.113/0.001 中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-45-及空白组（P0.05）。见表 4。2.4 参麦注射液干预后巨噬细胞胆固醇转出率与各实验指标的相关性分析 Pearson 相关性分析表明，参麦注射液干预后巨噬细胞胆固醇转出率与 PPAR-、ABCA1 转录水平及蛋白水平呈显著正相关性，与 NF-B 转录水平及蛋白水平 呈显著负相关性（P0.05）。见表 5。2.5 各组患者间临床指标对比 与常规组相比，观察组患者血脂水平、INF-及TGF-水平较低，IL-10 水平较高（P0.05）。见表 6。3 讨论 目前公认的免疫炎症反应和脂质代谢均是AS形成的重要危险因素。通过诱导免疫耐受/抑制免疫炎症细胞活化、诱导活化细胞的凋亡及减少免疫炎症细胞在血管内皮的黏附，可减缓 AS 的进展。巨噬细胞吞噬脂质积聚形成泡沫细胞作为动脉粥样硬化的主要早期病变过程，巨噬细胞逆向运输内皮下沉积的胆固醇等脂质对于延缓 AS 的进展就显得尤为重要，一旦外周细胞胆固醇逆转运功能受到损害，就会打破斑块局部脂质代谢平衡，使得动脉粥样硬化斑块向不稳定斑块发展。因此，调节逆胆固醇转运功能是阻止动脉粥样硬化发展的重要策略和药物靶点之一。目前胆固醇转出率已经作为评估外周组织（包括巨噬细胞）胆固醇逆转运的金标准，而在细胞中参与外周组织胆固醇运输跨膜的膜蛋白，包括 ABCA1、ATP结合盒转运子 G1 等，均在细胞膜表面表达，参与将脂质从细胞内逆向转运至细胞外以及从胞内转移至载脂蛋白 ApoA的过程。ABCA1 作为一个膜转运蛋白，在胆固醇逆转运和 HDL 生成的起始步骤中起重要作用。细胞外 apoA与细胞膜的 ABCA1 结合后，结合其从细胞内转运出的游离胆固醇和磷脂，形成新生的 HDL。有研究证据指出 PPAR 能够诱导肝脏 X 受体 表达增加，从而引起 ABCA1 的表达增高，从而促进细胞胆固醇外流，影响动脉粥样硬化的发生发展。NFB 参与细胞免疫，在动脉粥样硬化的发生和斑块侵蚀或破裂中起重要作用。通过调节 NFB 通路的活性改善动脉粥样硬化病变为治疗动脉粥样硬化提供新的理念。国内外有研究证据显示 NFB 激活可以减少核内 PPAR含量，进而影响胆固醇转运相关蛋白表达，减少胆固醇流出率。这些都证实 NFB 信号通路可以通过加重炎症促进动脉粥样硬化。参麦注射液是主要成分为红参和麦冬的纯中药制剂，具有生脉、益气固脱、养阴生津等功效，不仅可有效阻止形成活性氧自由基以防止损伤心肌组织，而且还可增强心肌收缩能力，并可通过调节机体免疫功能、抑制神经内分泌激活等方面改善心脏泵功能及血液流变学状态，从而降低心脏前负荷，改善心功能。在本研究中，我们发现实验组巨噬细胞胆固醇流出率显著高于对照组及空白组（P0.05）；实验组巨噬细胞 PPAR-、ABCA1 转录及蛋白水平显著高于对照组及空白组，NF-B 转录及蛋白水平显著低于对照组及空白组（P0.05）；参麦注射液干预后巨噬细胞胆固醇转出率与 PPAR-、ABCA1 转录水平及蛋白水平呈显著正相关性，与 NF-B 转录水平及蛋白水平呈显著负相关性（P0.05）。综上所述，本研究认为参麦注射液可提高巨噬细胞胆固醇流出率，可能与降低 NF-B 水平、提高PPAR-及 ABCA1 水平相关，提示参麦注射液可能通过NF-B/PPAR-/ABCA1 信号通路调控胆固醇流出率进而参与动脉粥样硬化的发生、发展过程。参考文献 1刘欣.隔药饼灸通过调节 ABCA1 和 LCAT 对 AS 兔易损斑块的影响D.湖南:湖南中医药大学,2021.2赵凡,张建军,蔡祥焜等.健脾祛湿方调控 LncRNA H19/miR-130a-3p 对高脂血症大鼠血脂代谢及胆固醇逆转运的研究J.环球中医药,2022,15(12):2311-2320.3雷升云.CTRP9 对巨噬细胞调亡和胆固醇逆转运的作用及机制研究D.山东:山东大学,2021.4金丹茹.清脂通脉颗粒对动脉硬化模型大鼠血脂及 PPAR LXR CD36 表达影响的研究D.辽宁:辽宁中医药大学,2019.中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-46-5黄江伟,江鑫,蒋长荣等.过氧化物还原酶 2通过 ROS-NF-B-miR-33a-ABCA1 途径抑制巨噬细胞脂质蓄积J.中国生物化学与分子生物学报,2020,36(12):1446-1454.6王军峰,张小磊,张祎鹏.参麦注射液联合美托洛尔对冠心病心绞痛患者的影响J.实用中西医结合临床,2020,20(11):64-65.基金项目：江西省中医药管理局科技计划项目资助（2020A0308）。