LsABF4基因在叶用莴苣抽薹中的作用分析.pdf

北京农学院学报2 0 2 4，39（2）：49-55Journal of Beijing University of Agriculturehttp:/doi:10.13473/ki.issn.1002-3186.2024.0201LsABF4基因在叶用莴苣抽墓中的作用分析朱俊萱+，邹小丽+，朱嘉齐，王惠玉，刘超杰，韩莹琰，郝敬虹*（农业应用新技术北京市重点试验室/植物生产国家级实验教学示范中心/北京农学院植物科学技术学院，北京10 2 2 0 6）摘要：【目的】探明LsABF4基因在叶用莴苣高温诱导抽墓过程中的作用机制，为将来培育抗抽墓叶用莴苣品种提供理论支持。【方法】以易抽墓叶用莴苣品种GB-30为材料，采用同源克隆的方法克隆出LsABF4基因，运用生物信息学软件和网站在线对基因进行比对、分析和预测编码的氨基酸序列构成、蛋白质结构等，通过病毒诱导基因沉默技术分析LsABF4基因在叶用莴苣抽墓中的作用。【结果】LsABF4基因的CDS序列全长为9 7 8bp，共编码32 5个氨基酸，蛋白相对分子量为358 8 5.2 1Da，理论等电点值为9.47，不稳定指数为48.9 6，该蛋白为不稳定蛋白，蛋白平均疏水指数为一0.9 39，是亲水蛋白；该转录因子含有bZIP_plant_BZIP46保守结构域，并且其高级结构主要由螺旋和无规则卷曲两种结构组成；对基因LsABF4瞬时沉默后，分析茎长测量数据发现，沉默组植株茎长明显高于对照组和空载组。通过石蜡切片技术对茎尖花芽分化的情况进行观察分析，结果呈现出对照组和空载组的植株茎尖生长点呈锥形，花芽尚未分化，而沉默组植株茎尖生长点呈扁平状，已进人花芽分化期。表明通过病毒诱导技术对LsABF4沉默可以促进叶用莴苣抽墓。【结论】LsABF4基因是典型的ABF转录因子，具有ABF蛋白家族的功能，对叶用莴苣抽掌过程起抑制作用。关键词：叶用莴苣；LsABF4；抽；瞬时沉默中图分类号：S636.2文章编号：10 0 2-318 6（2 0 2 4）0 2-0 0 49-0 7 文献标志码：AAnalysis of the role of LsABF4 gene in bolting of leaf lettuceZHU Junxuan+,ZOU Xiaoli+,ZHU Jiaqi,WANG Huiyu,LIU Chaojie,HAN Yingyan,HAO Jinghong(Beijing Key Laboratory of New Technology in Agricultural Application/National Demonstration Center for Experimental PlantProduction Education/College of Plant Science and Technology,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)Abstract:Objective To explore the mechanism of LsABF4 gene in the process of high temperature induced bolting of leaf let-tuce,and to provide theoretical support for the cultivation of anti-bolting leaf lettuce varieties in the future.MethodsTheLsABF4 gene was cloned by homologous cloning using the lettuce variety GB-30 for easy bolting leaves.Bioinformatics soft-ware and website were used to compare,analyze and predict the encoded amino acid sequence and protein structure of the gene.The role of LsABF4 gene in leaf lettuce bolting was analyzed by virus induced gene silencing technique.ResultsJ The totallength of the CDS sequence of LsABF4 gene was 978 bp,encoding 325 amino acids,the relative molecular weight of the pro-tein was 35 885.21 Da,the theoretical isoelectric point value was 9.47,and the instability index was 48.96.This protein wasan unstable protein,and the average protein hydrophobic index was-0.939,which was a hydrophilic protein,The transcrip-tion factor contains the conserved domain of bZIP_plant_BZIP46,and its higher structure is mainly composed of a helix andrandom coil.After instantaneous silencing of LsABF4 gene,analysis of stem length measurement data showed that stem lengthof plants in silent group was significantly higher than that in control group and vector group.The results showed that the收稿日期：2 0 2 4-0 2-15基金项目：国家自然科学基金面上资助项目（32 0 7 2 56 0）；北京市自然科学基金-教委联合重点资助项目（K Z2 0 2 310 0 2 0 34）；北京市种质创制和品种选育联合攻关项目（G20220628003）第一作者：朱俊萱（2 0 0 3一），女，黑龙江哈尔滨人，研究方向为园艺，E-mail：32 9 349 2 2 0 2 q q.c o m邹小丽（2 0 0 0 一），女，广西南宁人，硕士研究生，研究方向为蔬菜生理与分子生物学，E-mail：通信作者：郝敬虹（19 8 0），女，山东济宁人，教授，博士，研究方向为蔬菜生理与分子生物学，E-mail：h a o j i n g-50growth points of the stem tips of the blank control group and the negative control group were conical,and the flower buds werenot differentiated,while the stem tips of the experimental group were flat,and the flower buds had entered the differentiationstage.The result indicated that the silencing of LsABF4 by virus induction technique could promote bolting of leaf lettuce.ConclusionJ LsABF4 gene is a typical ABF transcription factor,which has the function of ABF protein family and can inhibitthe bolting process of leaf lettuce.Keywords:leaf lettuce;LsABF4;bolting;instantaneous silence叶用莴苣（Lactuca sativa L.），菊科莴苣属，一、二年生的半耐寒蔬菜，俗称生菜，原产于欧洲地中海沿岸，作为一种常见的蔬菜，有广泛的种植面积和市场需求。由于叶用莴苣喜欢冷?的生长环境，在夏季高温条件下极易抽墓，导致产品品质和产量的降低，影响其商业价值。迄今为止，叶用莴苣因高温而引发提前抽墓的机制尚不完全明确。因此对叶用莴苣夏季抗抽墓性的提高和调控其抽墓机制，并制定相应的科学管理措施，对叶用莴苣抗抽墓性的发展具有重大意义。脱落酸（abscisic acid,ABA)是植物相应非生物胁迫的重要信号分子，在植物的抽墓过程中起关键作用2 。脱落酸响应元件结合因子（abscisic acid(ABA)-responsive element binding factors,ABFs)是bZIP转录因子的一个亚族，在植物体内功能涉及响应ABA和非生物胁迫3。近年来，已经相继从许多种植物中获得了AREB/ABF转录因子的基因序列4。且前人研究表明，ABF基因对植物的抗性和对逆境适应性的提高起重要的作用。例如在烟草中，过表达NtABF1和NtABF2基因可以增强植株对抗非生物胁迫的能力5；过表达拟南芥AtABF3后,转基因紫花首藉耐盐和抗氧化能力显著提高6 。目前有关叶用莴苣ABF基因影响抽墓方面的研究尚有空白。因此，该研究以易抽墓叶用莴苣品种GB-30为材料，克隆得到ABF转录因子基因LsABF4，通过生信网站和软件多种方式进行序列比对、预测编码等生物信息学分析，采用病毒诱导的基因沉默方法，旨在探究LsABF4基因影响叶用苣抽的分子机制，为今后叶用莴苣抗抽品种培育奠定坚实基础。1试验材料及方法1.1植物材料于2 0 2 2 年11月16 日在北京农学院蔬菜种业创新与高效利用科研团队实验室进行。试验材料为实验室保存编号的易抽墓生菜品种GB-30，选取饱满种子约30 0 颗，清水浸泡3h，随后将其均匀平铺于培养皿上的湿润滤纸上，使其在常温黑暗环北京农学院学报境下萌发直至露白。然后将种子播种在7 2 孔的育苗穴盘中培养生长。待多数幼苗生长至3叶1心阶段时进行第一次筛选，去除受其他因素影响而未发育好的植株，将剩余幼苗移栽至直径为10 cm的营养钵中。当幼苗生长至5叶1心时进行第二次筛选，取长势良好且大小一致的幼苗进行TRV病毒侵染沉默处理。培养条件为：昼夜温度为2 0/13；光照时长为14h；黑暗时长为10 h；相对湿度保持在6 0%7 0%。以处理当天为第0 天，处理后第0、8、16、2 4、32 天观察取样，重复3次，保存于一8 0 冰箱。1.2提取RNA与反转录提取叶用莴苣叶片和茎尖中总RNA的过程参照TIANGEN植物总RNA提取试剂盒说明书，通过1%的琼脂糖凝胶电泳对提取获得的RNA进行质量检测，使用NanoDrop2000对浓度进行测定。合成cDNA第一链的过程参照全式金反转录试剂盒说明书，并将得到的cDNA样本储存于一2 0 冰箱中，用于后续的LsABF4基因克隆。1.3叶用莴苣LsABF4基因全长及沉默片段克隆从NCBI中查找得到LsABF4的CDS区序列，并以此为模板在线设计用于体外克隆的引物LsABF4-F/R(表1),通过 Snap Gene工具确定叶用莴苣LsABF4基因沉默的靶基因区域，从中选取400bp的序列片段，在其两端插入KpnI同源臂序列设计沉默片段引物Vigs-LsABF4-F/R（表1）。以叶用莴苣cDNA为模板，使用诺唯赞高保真酶扩增LsABF4基因全长CDS及靶基因片段。1.4叶用莴苣LsABF4生物信息学分析对基因的开放阅读框架分析采用NCBI OR-Ffinder;使用ProtParam对基因的理论等电点、相对分子量和蛋白质氨基酸种类进行比对分析；用NCBI蛋白BLAST搜索同源序列;蛋白质二级结构的预测采用 NPS-SOPMA；通过 NCBI CD-Search搜索分析蛋白质的保守结构域;用 Cell-PLoc2.0对亚细胞进行定位；信号肽用SignalP5.0分析；利用WISS-MODEL预测蛋白质的三维结构；在BioXM2.6中获取LsABF4编码的氨基酸序列后，通过使第39 卷2024年第2 期引物名称Name of primerLsABF4-FLsABF4-RVigs-LsABF4-FVigs-LsABF4-RLsABF4-qFLsABF4-qR18S-F18S-RpTRV2-FpTRV2-R用Blast工具在NCBI数据库中获取不同种属的ABF氨基酸序列,并对其进行比较分析，最后利用MEGA11.0软件构建LsABF4系统进化树。1.5VIGS介导叶用莴苣LsABF4基因沉默1.5.1VIGS载体的构建使用单酶切法,KpnI酶单切pTRV2载体，使其线性化，诺唯赞重组酶同源重组40 0 bp序列片段与线性化载体，转化入大肠杆菌后，菌落PCR进行鉴定与测序，将序列比对正确的重组质粒pTRV2-LsABF4转化入农杆菌GV3101，摇菌制备侵染液。1.5.2农杆菌侵染设置3个处理组：1.对照组，仅注射清水，以排除试验过程中其他因素的影响；2.空载组，将pTRV2空载体与pTRV1空载体按照1：1的比例混合后注射，用于矫正载体本身可能带来的影响；3.沉默组，将pTRV2-LsABF4与pTRV1空载体以1：1的比例混合后注射。采用5mL无菌注射器在生菜叶片背面将菌液注入，注射完成后，置于计算机温室中进行培养和观察，培养条件为：昼夜温度在2 0/13；光照时长为14h；黑暗时长为10 h；相对湿度保持在6 0%7 0%。1.5.3植株表型观察及检测为观察植株外观形态变化,以侵染处理当天作为第0 天，每8 d观测 1次植株茎长。在注射2 1d后，提取注射后植株新长出的叶片的RNA,以反转录所得的cDNA为模板，使用通用引物pTRV2-F/R（表1)进行PCR克隆，以检测TRV病毒是否成功导人植株。1.5.4基因沉默效果检测用qRT-PCR法对叶用莴苣LsABF4基因沉默效果进行检测，内参基因选取叶用莴苣18 SribosomalRNA，查阅相关资料以设定荧光引物LsABF4-qF/qR（表1），设置3个朱俊萱等:LsABF4基因在叶用莴苣抽薹中的作用分析表1研究中使用的引物及其序列Tab.1 Primers used in the study and their sequences引物序列（5-3）Sequenceofprimer(5-3)CATCTCTAGCTCGCCAGTCACCTAGTGTCGGTCGTCTCTCcctccatggggatccggtaccTATAGGAGGAGTTGATTCAAATGTGGgagacgcgtgagctcggtaccCTCCTTCTGTCTCTTAAGTCTTTCGTTGTTTTTCCTCTTCGGAGGGTTGTCTTGCCAATCCATCTGGTGTGAGTGAAGAAGGGCAATGCACTTCAACCCGATTCACCTGGGAGATGATACGCTGTTCGTGTCTGAAGTTTTAGGTT51引物功能Primerfunction克隆克隆荧光定量荧光定量测序生物学重复和3个技术重复以排除其他因素影响，利用 2-AACt 法对检测基因相对表达量进行计算。1.5.5植株茎尖花芽分化观察茎长观测第2 4天出现明显表型差异后，对叶用莴苣茎尖取样，每个处理各3 株，取其茎尖部位快速放入现配的FAA固定液（38%甲醛5mL，冰醋酸5mL50%乙醇9 0mL配制而成)中，将材料脱水透明处理，然后装人蜡屑包埋浸蜡，使用切片机切片，在温水中展片，烘干后进行染色处理，切片制成后使用荧光正置显微镜观察观察并拍照分析结果。1.6数据处理试验数据采用Excel2016软件进行录人和整理，通过使用IBMSPSSStatistics22软件，应用单因素方差分析法进对不同处理间均值的显著性差异比较分析（P0.05，D u n c a n），并利用AdobePhotoshop 2022和Excel 2016软件作图。2结果与分析2.1叶用莴苣LsABF4基因克隆如图1所示，提取叶用莴苣茎尖RNA并反转录为cDNA，设计引物扩增LsABF4基因CDS区域。LsABF4基因 CDS序列全长为 9 7 8 bp,RT-PCR结果(图1中18)与 NCBI中数据一致。2.2LSABF4蛋白理化性质分析及亚细胞定位预测利用ProtParam网站分析结果表明该基因编码的蛋白质由32 5个氨基酸组成，蛋白相对分子量和理论等电点分别为358 8 5.2 1Da和9.47，不稳定指数为48.9 6，属于不稳定蛋白。蛋白质平均疏水指数为一0.9 39，是亲水蛋白。通过TMHMM对蛋522 000 bp1.500 bp1 000bp750bp500bp250bp-100 bp-M.DNA标准DL2000;18.LsABF4基因克隆结果图1LsABF4基因PCR扩增电泳图M.DL2000 DNA marker;1-8.LsABF4 gene clone resultsFig.1 PCR amplification electrophoresis of LsABF4 gene白质信号肽的分析，发现LsABF4蛋白没有信号肽及跨膜结构，可以推断出该蛋白不属于分泌蛋白。通过Cell-Ploc2.0亚细胞定位预测结果显示，LsABF4蛋白定位于细胞核中，表明LsABF4蛋白可能在细胞核内发挥其生物学功能。2.3LsABF4转录因子结构分析通过使用NCBI CD-search对蛋白质的保守结构分析，发现LsABF4蛋白中含有RMIKNRE-SAARSRARKQAY(Bzip_plant_BZIP46)保守结构域（图2）。利用NPS-SOPMA对蛋白质的二级结构分析，发现该蛋白质的二级结构组成中，无规则北京农学院学报M1第39 卷2345678LsABF4蛋白与刺苞菜蓟和小蓬草等18 种植物中的ABF蛋白质都具有很高的相似性。这意味着LsABF4基因在进化过程中保守性较高，这些同源蛋白序列间的相似性揭示了它们在生物学功能上的关联。使用MEGAv11.O软件中的NJ聚类法对叶用莴苣ABF4与刺苞菜蓟、小蓬草、向日葵等18个物种的ABF4氨基酸序列进行进化树分析（图3），发现其根据差异性被分为了2 组，其中叶用莴苣与刺苞菜蓟、向日葵、小蓬草的同源性最高。这些植物中的ABF蛋白可能具有相似的功能，为研究LsABF4蛋白在植物生长发育、逆境响应等方面的功能提供了线索。一多疣加Solanumverucosum(XM049519923.1)99龙葵Solanum stenotomum(XM 049545832.1)100马铃薯Solanum tuberosum(XM006339151.2)一辣椒 Capsicum annuum(XM 016699573.2)10080L一欧白英Solanum dulcamaraL.(XM055952737.1)98烟草Nicotiana tabacum L.(XM016637411.1)厂番茄Solanum pennelli(XM 015233562.2)100L枸杞Lycium barbarm(XM060321680.1)一卷曲（Randomcoil)的占比最高，为56.31%；其次是螺旋（Alphahelix），占比36.0 0%；延伸主链(Extended strand)占 5.2 3%;转角（Beta turn)的占比最少，为2.46%。对该蛋白质进行三级结构预测后发现（图2），ABF家族蛋白质中有许多与LsABF4蛋白的结构高度相似，表明该蛋白质具有ABF家族特有的保守结构，是典型的ABF转录因子，这一结果为进一步研究该蛋白质的功能和性质提供了重要依据。图2 LsABF4蛋白质三级结构预测图Fig.2LsABF4 protein tertiary structure prediction map2.4LsABF4多序列比对与系统进化分析同源性比对结果表明，LsABF4蛋白与小蓬草（8 8.51%）和刺苞菜蓟（7 8.7 2%）的蛋白相似度较高。使用NCBI网站中的BLAST工具进行氨基酸比对，获得LsABF4的同源蛋白序列。结果表明，胡萝卜Daucuscarota(XM017391445.1)7丹参Sabvia miltirhiza(XM057930700.1)97L金鱼草Antirhinum majus(FM877964.1)牛Arctiumlappa L.(OX941095.1)100厂金盏花Calendulaofficinalis(OY970832.1)99100一石胡妥Logfaminima(OY992764.1)止痢蚤草Pulicaria dvsenterica(OX359291.1)100小蓬草Erigeron canadensisL.(XM043764567.1)100一向日葵Helianthus annuus(XM022180467.2)94厂叶用莴苣Lactuca sativa(XM042897135.2)54L刺苞菜蓟Cynara cardunculus(XM 025110475.1)0.10图3LsABF4与其他物种ABF转录因子的进化树分析Fig.3Evolutionary tree analysis of ABF transcriptionfactors in LsABF4 and other species2.5VIGS介导的基因沉默对叶用莴苣抽的作用2.5.1载体构建与阳性植株检测通过PCR技术成功扩增得到了LsABF4基因的40 0 bp特异片段（图4-A），将扩增得到的40 0 bp片段与pTRV2载体进行连接，构建出了pTRV2-LsABF4表达载体，如图4-B，表明该表达载体已成功转人GV3101农杆菌中。将其注射到叶用莴苣植株中，2 1d后，通2024年第2 期过从3组植株新叶提取总RNA，逆转录为cDNA，并利用RT-PCR技术进行检测，结果证实 pTRV2-LsABF4表达载体已经成功转人莴苣植株中，且pTRV2-LsABF4AMarker2.000 bp500bp250bp朱俊萱等:LsABF4基因在叶用莴苣抽墓中的作用分析BMarker122.000bp500bp250bp53TRV病毒在转人了pTRV2-LsABF4 载体的莴苣植株内得到有效复制和传播，进而实现对目标基因的功能抑制(图 4-C)。34pTRV2-LsABF4567CMarker12 3 4 56782.000bp500bp250bp注：A.400bp的LsABF4的沉默片段扩增电泳图；B.pTRV2-LsABF4重组质粒转人GV3101农杆菌检测电泳图（1 7 组均为pTRV2-LsABF4重组质粒）；C.植株检测电泳图；1.对照组；2、3.空载组；48.沉默组植株；M.BM2000DNAMarker图4载体构建与农杆菌转化琼脂糖凝胶电泳图及植株检测电泳图Note:A.40o bp silent fragment amplification electrophoresis of LsABF4;B.pTRV2-LsABF4 recombinant plasmid transferred toGV3101 Agrobacterium electrophoresis map(Group 1-7 were pTRV2-LsABF4 recombinant plasmid);C.Electrophoretic map of plant detec-tion;1.Blank control group;2,3.vector group;4,5,6,7.8.ABF4-silent;M.BM20oo DNA MarkerFig.4 Agarose gel electrophoresis of carrier construction and Agrobacterium transformation and plant detection2.5.2沉默植株中LsABF4基因的表达分析为了验证是否成功沉默LsABF4基因，采用qRT-PCR技术对3组叶用莴苣中LsABF4基因的表达水平进行检测（图5）。结果显示，在沉默组中，LsABF4基因的表达量相较于对照组和空载组显著下降了约50%，这说明LsABF4基因的表达受到了有效抑制，从而验证了VIGS技术成功实现了对LsABF4基因的沉默作用。而对照组和空载组之间基因表达量没有显著差异，进一步确认了沉默效果的特异性,即观察到的表达量下降是由LsABF4 基因沉默造成的，而非其他无关变量的影响。1.8a1.61.41.21.00.80.60.40.20Black control Empty vectorABF4-silent注:P0.05图5LsABF4基因在对照组，空载组和沉默组植株中的相对表达量Note:P0.05Fig.5The relative expression of LsABF4 gene in controlgroup,vector group and silent group2.5.3瞬时沉默植株茎长的变化当叶用莴苣生长到5叶1心阶段时，分别对3组植株进行了处理，并对其生长表现进行了详细的观察和量化分析。试验结果显示（图6），在感染TRV病毒后,初期8 d9口对照组Blackcontrol8空载组Emptyvector7沉默组ABF4-silent65斗幕432aaa10注：图中不同字母代表不同组别的差异比较结果，P0.05a图6 对照组、空载组、沉默组植株的茎长变化Note:Different letters in the figure represent the differencebcomparison results of different groups,P0.05Fig.6Stem length changes of plants in blank controlgroup,vector group and silent group时，无论是沉默组还是空载组，它们的茎长都与对对照组空载组bb士abaaaa千08处理时间Treat time/d沉默组照组相近，表明此时病毒侵染和载体本身对茎长的影响还不明显。然而，随着时间推移，16 d时，沉默LsABF4基因的植株表现出明显的生长优势，茎长增长速度开始超过对照组和空载组，并呈现显著差异。2 4d时，这种趋势更加显著，沉默组的茎长持续增加，并且其增长速率远高于注射空载载体和对照组的植株，与对照、空载组相比，茎长长了大约50%。同样,空载组与对照组之间茎长的差异依然不明显。32 d时，沉默LsABF4基因的莴苣植株茎长与对照组之间的差距进一步加大，沉默组的茎长大约高出对照组6 0%，充分显示出LsABF4基因沉16243254北京农学院学报第39 卷默对于促进茎长增长具有显著作用。在第2 4天时，对植株的茎部进行了详细的外观形态观察。结果如图7 所示，注射了含有pTRV2-LsABF4载体的植株，由于LsABF4 基因被成功沉默，其茎部长度相较于注射了空载或清水处理的植株有着明显的增长优势，并且这种增长差异达到了统计学上的显著水平。2.5.4瞬时沉默后植株的茎尖花芽分化情况在病毒诱导基因沉默试验第2 4天，选取对照组、空载组以及沉默组的叶用莴苣植株茎尖部位进行石蜡切片，进一步分析其茎尖花芽分化的状况。结果显示（图8），沉默组的植株茎尖生长点相对平缓，凸起不明显，这一特征暗示了该组植株可能已进入了明显的花芽分化阶段，意味着LsABF4基因的沉默可能促进了花芽分化进程的提前或加速。相反，注射清水处理的对照组以及仅注射了空载载体的空载组，其茎尖生长点呈现出明显的突起，这种形态特征对照组1:200 m通常表示这两组植株尚未进人花芽分化阶段，仍然处于营养生长状态。对照组Black control Empty vector ABF4-silent图7 病毒诱导基因沉默(VIGS)感染植株第2 4天茎的形态Fig.7NMorphology of stem 24 d of virus-induced gene si-lencing(VIGS)infected plants空载组沉默组1:200m空载组1:200 um沉默组图8 对照组、空载组、沉默组植株的花芽分化情况Fig.8 Flower bud differentiation of control group,vector group and silent group高，由此表明ABA内源激素促进叶用莴苣抽墓过3讨论和结论蔬菜生产中先期抽墓会导致产品的品质和产量严重下降，而植物激素在植物生长发育时会起到关键作用，如脱落酸（ABA）就扮演着调控植株生长发育以及非生物条件胁迫的适应性的重要角色。胡存彪发现，不同生育期内源激素的含量有很大差异，ABA的含量急剧上升对植株抽墓过程有正向调控作用7，在当归抽的前期，叶片中较高浓度的ABA有利于抽墓，低浓度水平的IAA有利于抽墓8 。然而，有研究表明在大蒜的生长过程中，抽墓后期IAA含量明显升高，而ABA则显著降低，这表明ABA在含量较低、IAA含量较高时则会促进大蒜的抽墓9。另外还有学者证明，ABA抑制抽墓主要作用机制是增加开花抑制因子的表达10。还有研究表明ABA可通过ABA responsive elementbinding protein(AREB)促进转录11,以促进拟南芥成花。吴萍等的研究表明外源ABA等调节剂复配使用可以不同程度的抑制白芷早期抽12 。刘慧等研究表明，ABA含量在叶用莴苣抽过程中升程的进行13。总之，脱落酸对植物的作用涉及多方面，具有时间和空间的复杂性，取决于具体的植物种类、发育阶段及环境条件。因此，要全面理解和解析脱落酸对植物抽墓的确切作用机制，还需要更深入的研究，探究其在细胞信号传导途径中的作用，以及与其他植物激素间的互作关系，才能制定出更为精准的农业生产和园艺实践中的应用策略。ABF(ABRE binding factors)转录因子是能够特异识别ABA相应原件的一类碱性亮氨酸拉链蛋白，属于植物体内一种特殊的转录调控因子家族。研究从叶用莴苣中成功克隆了一个属于ABF转录因子家族的基因，并将其命名为LsABF4。通过对该基因编码的蛋白质进行生物信息学分析，结果显示LsABF4蛋白含有保守的bZIP结构域，这是一个高度保守的DNA结合结构域，广泛存在于许多植物转录因子中,对于调控ABA响应基因至关重要。LsABF4蛋白的二级结构以丰富的螺旋和较高的无规则卷曲为主，无规则卷曲比例超过50%，为不稳定蛋白，与理化性质分析预测结果一致。进2024年第2 期一步的序列比对分析显示,LsABF4与多种植物物种的ABF转录因子在氨基酸序列上有很高的同源性，尤其与小蓬草和刺苞菜蓟的ABF转录因子序列比对的同源性高达8 8.51%和7 8.7 2%，同时，LsABF4与另外16 种植物的ABF蛋白序列也有较高的相似度。这一结果与小麦（Triticum aestivumL.)14、烟草（Nicotiana tabacumL.）15、胡萝卜(Daucus carota）141等物种中的该家族成员结构特征相似，这些证据共同支持了LsABF4是一个典型的bZIP转录因子家族成员，并且表明ABF转录因子在不同植物物种间的进化过程中具有较强的保守性，尽管存在一定的种属特异性差异。总结来说,这项研究不仅揭示了叶用莴苣中LsABF4 基因的基本结构特征和跨物种的保守性，也为深入了解植物中ABF转录因子的功能及其在不同物种间的演化关系提供了线索。研究发现，由于不同植物中的不同ABF转录因子存在序列和结构差异，使得 ABF转录因子存在特异性，导致在非生物胁迫条件下有不同的应答反应16 。例如胡萝卜中的DcABF1基因相应盐胁迫条件而表达14，葡萄中VABFs基因在葡萄果实着色中发挥作用17 ；荔枝中LcABF1基因在种子发育过程中起作用17 ；而在拟南芥中，ABF1受低温胁迫显著诱导，ABF2、A BF4和ABF3在脱水处理和高盐等渗透胁迫环境下受到诱导17。在同一植株的不同生长发育期，ABF转录因子表达情况也会随之改变，例如在小麦营养生长时期，TaABF18-B/D基因的表达量较高，TaABF18-A基因主要在在幼穗时期表达，TaABFI7基因在苗期叶、孕穗期旗叶和籽粒中均高表达，TaABF19在籽粒中高表达15,由此,可以推断即使在同一植株中，ABF转录因子也会有多种功能。为了探究 ABFs基因在叶用莴苣抽墓中的作用，试验采用病毒诱导基因沉默技术(VIGS)针对叶用莴苣品种GB-30中的ABF转录因子ABF4 进行了功能研究。通过荧光定量PCR技术,成功地瞬时降低了LsABF4 基因在叶用莴苣植株中的表达水平；进一步的形态学观察和生物指标测定表明,LsABF4基因沉默后的植株在茎长方面表现出显著的增长优势，与对照组（注射清水处理的植株）和空载组（注射了不含目的基因片段的载体的植株)相比差异极显著；与此同时，通过石蜡切片对茎尖花芽分化情况进行分析，结果显示对照组与空载组植株的茎尖尚处于营养生长阶段，没有进人花芽分化期，而LsABF4基因沉默的植株已显现出花芽分化迹象。综合以上，研究得出结论：沉默LsABF4基因有利于促进叶用莴苣抽墓过程的发生，即LsABF4基因在自然状态下起着抑制朱俊萱等：LsABF4基因在叶用莴苣抽墓中的作用分析istry,2016,109:199-208.7 胡存彪.结球白菜抽墓的激素调控及其低温春化代谢组学研究D.贵州：贵州大学，2 0 17.8黄珊.当归早期抽墓分化和内源性激素变化研究D.杨凌：西北农林科技大学，2 0 2 1.9 黄治军.大蒜抽墓机理与调控技术研究D.泰安：山东农业大学,2 0 11.10RAZEM A Fawzi,El-KEREAMY Ashraf,ABRAMS R Su-zanne,et al.The RNA-binding protein FCA is anabscisic acidreceptorLJI.NATURE,2006,439(19):290-294.11 CHOI Hyung-in,HONG Jung-hee,HA Jin-ok,et al.ABFs,afamily of ABA-responsive element binding factors.JJ.TheJournal of Biological Chemistry,2000,275(3):1723-1730.12吴萍，郭俊霞，王晓宇，等.植物生长调节剂复配对白芷幼苗生长及早期抽墓构成的影响.北方园艺，2 0 2 3（0 2）：8 8-9 5.13刘慧，郝敬虹，韩莹琰，等.高温诱导叶用莴苣抽墓过程中内源激素含量变化分析J.中国农学通报，2 0 14，30（2 5）：97-103.14郝建楠，王雨薇，段奥其，等.胡萝卜ABF转录因子基因DcABF1的克隆与非生物胁迫应答分析J.西北植物学报，2019,39(10):1731-1740.15郭树娟，孙月，郑昊元，等.小麦ABF/AREB/ABI5基因家族全基因组鉴定与表达分析J.农业生物技术学报，2 0 2 3，31(4):667-681.16 刘金义.葡萄bZIP转录因子家族的全基因组鉴定、表达分析及VvbZIP45/VvbZIP08（A REB/A BF类）基因的功能研究D.南京：南京农业大学，2 0 16.17徐献斌.ABA促进葡萄花青苷积累相关基因的筛选及ABFs转录因子的功能分析D.南京：南京农业大学，2 0 2 1.18CHEN Kong