细胞培养标准流程.doc

细胞间基本规定
每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。
显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。
超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。
带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。
细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称
细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称.基培需写上开启时间.
细胞培养标准流程
1、 细胞换液、传代（以圆盘培养为例）
Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20—30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品(包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。
步骤：1。观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌
2.弃旧:细胞生长融合达90％时，吸出培养基
3。漂洗:PBS（2mL） 漂洗1-2次
4。消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO2 放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。
5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10％FBS的完全培养基终止消化.
6。吹悬:轻轻吹打混匀，（倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形），吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培,小盘6ml全培）
（细胞生长快留30%，慢40%-50％；其余细胞可提取蛋白或RNA)
7.培养:每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。
PS：六孔板一般加培养基2300μL/孔。
2、 细胞转染
TurboFect 转染试剂转染(用于质粒的转染,说明书附后）
细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%.
以6 孔板为例，转染前细胞先换液，加4ml全培。
取1。5 ml 离心管,加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液,加入质粒2 μg，混匀后静置5 min,再转染试剂4 μL,混匀（转染试剂是质粒的2倍）,室温静置15－20 min。
(转染试剂需加在培养液中部,切忌勿贴壁；静置时间不可超过20 min）
无血清无双抗DMEM量＝全培体积的10％。如6孔板加4mL培养液培养，即转染体系为400ul无血清无双抗DMEM。
缓慢均匀加到培养液后，轻轻晃动圆盘，使其均匀分布.
转染后6h后细胞换液，排除试剂的毒性影响。
24～48 h 后收集细胞用于后续实验.
Note：如果用这种方法转染效率一直不佳，可以在接种细胞前，把转染试剂配好，把转染试剂加到培养盘上，再把细胞接种上。该方法不适用所有细胞,这种方法会导致细胞死亡，不贴壁。
HiPerFect 转染试剂转染（用于siRNA的转染,说明书附后）
For transfection of eukaryotic cells with siRNA and miRNA
以6 孔板为例，转染之前，以2mL全培接种1。5-6×105 细胞于6孔板每孔。
将细胞放置在培养箱中培养，直至转染.（前50%———染90%）
取1.5 ml 离心管，加入100 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入
siRNA（20uM浓度，相当于0。25ug/μL)5uL,转染试剂12μL，轻轻混匀，室温
静置5—10 min。
siRNA：转染试剂：无血清无双抗DMEM 5uL：12ul:100ul。（比例待定）
将步骤3混合液缓慢均匀加到培养液后，轻轻晃动圆盘，使其均匀分布。
24～48 h 后收集细胞用于后续实验。
3、 细胞冻存 （慢冻快融）
1） 配冻存液：全培＋10％DMSO或者90％胎牛＋10％DMSO。（保护细胞膜不被冻坏）
2） 提前准备好程序性降温盒。
3） 标记冻存管:帽子:细胞系名称 冻存者
侧面：细胞系名称 冻存者 冻存时间
级别（按照细胞状态标记A＋，A，B），太差的别冻
4） 细胞经过换液消化后，离心，弃上清.加入2ml的预先配好的冻存液,快速吹打混匀。若不离心，则在冻存管中加100μLDMSO+900μL细胞悬液。
5） 冻存顺序：用冻存仪（程序性降温盒)－80℃过夜→液氮.
或者4℃半小时→－20℃2小时→ －80℃存储。
冻存仪的使用方法
1、确认冻存仪内的异丙醇是否已经使用5次，准备细胞，放入冻存盒（最多18管)。
2、将冻存盒放入-80℃冰箱,并登记信息（冻存者,冻存细胞名称，异丙醇使用次数)
3、至少三个小时后（过夜），将细胞取出放置于自己的细胞盒内或液氮中.
4、将冻存盒取出放回原处。
冻存盒内需放置250ml的异丙醇，异丙醇使用4—5次后需要更新
4、细胞复苏 （DMEM培养液+10%FBS+1％双抗）
1) 准备37℃水浴箱，10mL离心管，配制相应培养基，标记好培养皿。
（离心管和培养皿可提前加好约5ml培养基）
2） 将取出的细胞冻存管快速投入到温水中，同时手握冻存管快速搅动，让细胞以最快的速度融解。
3）吸取所有融化的细胞悬液至加有5倍体积培养基的离心管中。
4）离心800rpm，3min。
5）弃上清，加全培重悬细胞。
6）依次加2ml细胞悬液和10ml全培入新培养皿。
（6cm小圆盘上加入 2 ml的全培；10cm大圆盘上加入10ml的全培)。
7）混匀(十字混匀）,CO2培养。
标准程序：
3）离心1000rpm，2-3 分钟；弃上清,加入1ml全培重悬后转入10ml管，再加入4-5ml全培重悬
4)离心1000rpm，2-3 分钟,离心期间，在6cm小圆盘上加入 2 ml的全培
10cm大圆盘上加入10ml的全培
5）弃上清，加入1ml全培重悬随后加入到上述的6cm小圆盘中
Note：细胞请在6cm的小圆盘内
细胞离心后请用全培再洗一遍尽量去除DMSO的影响