流式检测上机前细胞处理流程与注意事项.doc

流式检测细胞周期与凋亡样品处理流程
1. 胰蛋白酶消化法收集细胞，做成单细胞悬液
2. 1000r/min离心5min，收集沉淀。
3. 沉淀用PBS洗2次，1000r/min离心5min,收集沉淀。
4. 细胞沉淀用4℃预冷的70％的冰乙醇1ml重悬，4℃过夜。即可送检.
备注：1.每个细胞样品细胞量需达到106（细胞沉淀要打散，避免细胞聚集)，细胞量少可能测不出结果，或结果不太准确.
2。样品可在-20℃保存一个月
流式检测细胞DNA倍体样品处理流程
1。胰蛋白酶消化法收集细胞，做成单细胞悬液
2。1000r/min离心5min，收集沉淀。
3。 沉淀用PBS洗2次，加入相应种属的淋巴细胞或鸡红细胞做为内参，内参与预检测细胞的比例为1：3
4. 1000r/min离心5min，收集沉淀。
5。 细胞沉淀用4℃预冷的70%的冰乙醇1ml重悬,4℃过夜.即可送检。
备注：1.每个细胞样品细胞量需达到106（细胞沉淀要打散，避免细胞聚集），细胞量少可能测不出结果，或结果不太准确。
2.样品可在-20℃保存一个月
检测胞内蛋白上机前细胞处理流程
1. 收集实验处理好的细胞，用PBS洗2次,2％多聚甲醛固定15min.
2. 离心弃掉多聚甲醛，再用70％的冰乙醇固定过夜（4℃）。
3. 离心弃掉乙醇,PBS洗一遍,加破膜剂0.5%TritonX—100 50ul/106个细胞 15min。
4. 直接在0.5%TritonX—100中加一抗室温孵育30min，离心,用PBS洗一次，加荧光标记二抗(需进口二抗，国内的效价比较低效果不好），总体系为100ul,总体系中应含0.25%（体积分数）的TritonX—100，室温孵育30min.
5. 也可以直接加FITC直标的一抗.
6. 离心，用PBS洗一次，用2％的多聚甲醛固定，4℃存放待测。
备注：1。 市面上的多聚甲醛多为4%的，可用PBS稀释。如果用两步标记，应做不加一抗,只加二抗的对照管
2。 未染色的新鲜标本贮存方法如下:10%二甲基亚砜,90%小牛血清，5×106～1×107细胞在-70℃过夜,然后置液氮中可长期保存。
　　 3。免疫染色未经固定的标本在4℃可保存48h.若需存放时间较长、或标本具有传染性，应该用固定剂固定。常用的固定剂配方是：的多聚甲醛和PBS或0。8％的生理盐水配成p H7.2的固定液；固定方法是：将经免疫荧光染色的细胞离心沉淀，再加入固定液混匀，放在4℃温度保存。一般来说，经固定处理的标本保存1周至1个月，多数样品的阳性细胞群体比例及荧光强度增色能保持在正常范围之内。
4.每个细胞样品细胞量需达到106，细胞量少可能测不出结果，或结果不太准确
检测细胞转染率上机前细胞处理流程
1. 用胰蛋白酶消化法收集转染后的细胞,用PBS洗2次。
2. 直接用2%多聚甲醛固定，4℃存放，待测。
备注：每个细胞样品细胞量需达到106，细胞量少可能测不出结果，或结果不太准确。